הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62765

⸱

7 בפברואר 2022

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מתאר את שיטת הכתם וצלילה להקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד.

תקציר

הדמיית דגימות ביולוגיות עם אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) דורשת שכבה דקה של קרח זגוגי המכיל את הביומולקולים של עניין. למרות התפתחויות טכנולוגיות רבות בשנים האחרונות שדחפו את CryoEM של חלקיק יחיד לחזית הביולוגיה המבנית, השיטות שבאמצעותן דגימות מתחדשות להדמיה ברזולוציה גבוהה נשארות לעתים קרובות הצעד המגביל את הקצב. למרות שמאמצים רבים שנעשו לאחרונה סיפקו אמצעים להתגבר על משוכות שנתקלו בהן לעתים קרובות במהלך vitrification דגימה, כולל פיתוח של תמיכה מדגם חדשני ומכשור ויטרציה חדשני, הבוכנה המסורתית המופעלת ידנית נשארה מרכיב עיקרי בקהילת cryoEM בשל העלות הנמוכה לרכישה וקלות הפעולה. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות לשימוש במכשיר סטנדרטי בסגנון גיליוטינה המופעל באופן ידני כתם וצלילה להתחדשות של דגימות ביולוגיות להדמיה ברזולוציה גבוהה על ידי קריום חלקיק יחיד. בנוסף, בדרך כלל נתקל בבעיות והמלצות פתרון בעיות כאשר הכנה סטנדרטית נכשלת להניב דגימה מתאימה מתוארים גם.

מבוא

מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד (cryoEM) היא טכניקה מבנית רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לפתור מבנים של דגימות ביולוגיות דינמיות לרזולוציה כמעט אטומית1,2,3,4. ואכן, ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות גלאי אלקטרונים ישיר4,5,6,7,8,9,10, שיפורים במקורות אלקטרונים4,11,12,13,14 ויציבות עדשה אלקטרומגנטית15, יחד עם המשך הפיתוח של רכישת נתונים 16,17 וחבילות תוכנה לניתוח18,19, אפשרו לחוקרים לקבוע כעת באופן שגרתי מבנים של דגימות מחונכות היטב ל-3 רזולוציה של Å או טוב יותר4,11,13,14,20,21,22,23 . למרות יכולות הדמיה ועיבוד נתונים משופרות אלה, הכנת רשת CryoEM נותרה המכשול הגדול ביותר לקביעת מבנה מוצלח ברזולוציה גבוהה ולעתים קרובות משמשת צוואר בקבוק ניכר בזרימת העבודה EM24,25,26,27.

CryoEM מסתמכת על הדמיה של דגימות ביולוגיות בפתרונות מימיים שהוקפאו כדי ליצור סרט דק של קרח "דמוי זכוכית" - תהליך המכונה vitrification - המשמר את המצב הביוכימי המקומי. Vitrification של דגימות ביולוגיות עבור cryoEM שתחילתה מעל 40 שנים28,29,30 וטכניקות וציוד רבים שפותחו עבור תהליך זה מסתמכים על שיטת blot-and-plunge המפורטת במקור31,32,33,34,35 לפיו נפח קטן של מדגם (למשל, 1-5 μL) מוחל על רשת EM מיוחדת לפני הפתרון העודף מוסר באמצעות אינטראקציה פיזית של הרשת עם נייר סופג., התזמון של תהליך זה נקבע בדרך כלל אמפירית עבור כל דגימה כמרכיב קריטי של הקפאת דגימות הוא עובי סרט הקרח הזגג - אם הקרח סמיך מדי אז איכות ההדמיה מתדרדרת באופן דרמטי עקב פיזור מוגבר של קרן האלקטרונים בעוד קרח דק מדי יכול להגביל את אוריינטציות החלבון ו / או להוציא חלקיקים ממרכז חורי רדיד הרשת36 . הסתמכות זו על עובי הקרח המושלם עבור CryoEM חלקיק יחיד הובילה למגוון רחב של טכניקות וציוד שיכולים להקפיא דגימות, כולל רובוטיקה37,38, microfluidics42, והתקנים קוליים או ריסוס27,39,40,41,42,43,44 . בשנים האחרונות, חלק ממכשירי הכנת הדגימה הפופולריים ביותר מסתמכים על שימוש ברובוטיקה להקפאה אוטומטית של דגימות בטכניקת הכתם והצללה45. בעוד מכשירים אלה נועדו ליצור עובי קרח מתאים להדמיה, לעתים קרובות הם נשארים יקרים מדי עבור מעבדות בודדות לרכוש ולתפעול והם נמצאים בדרך כלל בתוך מתקני cryoEM בתעריפים לשעה לשימוש. בשנים האחרונות, טכניקת הכתם וצלילה הידנית המקורית חזרה לשימוש מוגבר3,47,48,49,50,51,52. ואכן, מכשיר כתם וצלילה המופעל באופן ידני יכול להשיג רשתות קריום באיכות גבוהה בשבריר מהעלות של עמיתים רובוטיים. יתר על כן, סופג ידני גם מציע למשתמשים יותר שליטה על סופג כמו חוקרים יכולים להתאים את סוג של blotting (כלומר, back-blotting של הרשת, החלקה קדמית של הרשת, וכו '), וזמן סופג בהתבסס על כל מדגם בודד ושאלות מחקר.

במאמר זה, אנו מספקים פרטים על איך להקפיא ביעילות דגימות ביולוגיות באמצעות מכשיר vitrification כתם וצלילה ידני מסורתי בשילוב עם פלטפורמת dewar מעוצבת בהתאמה אישית53. שיטות עבודה מומלצות, כולל הכנת קריוגן, טיפול ברשת, יישום מדגם, סופג, כמו גם מלכודות נפוצות והמלצות על איך להתגבר על משוכות אלה מסופקים. עצה כיצד להגדיל את עובי הקרח רבייה בין תכשירי רשת וכיצד לשנות כתמי מדגם בהתבסס על סוג הדגימה הביולוגית נדונים. בהתחשב בעלות הנמוכה הקשורה לרכישה ותפעול של הבוכנה הידנית המתוארת בכתב יד זה, מעבדות ברחבי העולם יכולות להכין דגימות ביולוגיות עבור cryoEM באופן חסכוני וניתן לשחזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן את סביבת הצלילה הידנית

הערה: זמן פעולה משוער: 5-30 דקות

  1. אתר את הבוכנה הידנית בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס שבו ניתן למצוא מכשיר אדים כדי לשמור על החדר קרוב ל-100% לחות יחסית (RH) (איור 1A).
    אזהרה: יש להיוועץ בהנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד למיקום בטוח של הבוכנה הידנית ולפעולות המומלצות.
  2. לפני הכנת הרשת, הפעל את מכשיר הלחות בחדר הקר כדי להבטיח שה- RH של החדר הקר ≥ 95 %.
    הערה: הכנת רשת בלחות נמוכה עלולה לגרום להתייבשות של סרטים דקים, שינוי של רכיבי חיץ עקב אידוי, וירידה בשחזור רשת לרשת46. לא מומלץ להקפיא רשתות ב- <80 % RH.
  3. ודאו שטמפרטורת החדר הקר היא 4 מעלות צלזיוס.
  4. אתר את הבוכנה הידנית הרחק מזרמי אוויר חזקים (כלומר, הרחק מפתחי האוורור של יחידת מיזוג האוויר) מכיוון שהם יכולים להוביל למערבולת ליד רשתות ו /או הצטברות קרח בולטת על משטחים קרים.

2. הכן חומרים ואביזרים צוללים

הערה: זמן פעולה משוער: 1-5 דקות

  1. השתמש במספריים נקיים כדי לחתוך עיגולי נייר סופגים לרצועות 1-1.5 ס"מ ורצועת ~ 9 ס"מ. הימנעו מלגעת במרכז נייר הכתמים והשליכו את חתיכות הקצה הקטנות יותר. חשוב לוודא כי רצועות הנייר הכתומים יבשות, נקיות וללא מזהמים. מפרידים את הרצועות ומניחים אותן בצלחת פטרי 100 מ"מ.
  2. מניחים כיסוי זכוכית מרובעת בגודל 22x22 מ"מ לצלחת פטרי נפרדת של 60 מ"מ. צלחת פטרי מזכוכית המכילה כיסויים תשמש לאחסון, העברה ורשתות פריקה זוהרות.
    הערה: מומלץ להשתמש בפחית של מטלית אוויר כדי להסיר את כל הפסולת הנראית מהשקופית לפני הוספת רשתות. אקדח אנטי סטטי יכול לשמש גם כדי להסיר כל חשמל סטטי המצטבר.
  3. התאם וסמן תיבות אחסון של רשת תוויות.
  4. לרכוש 4 עד 6 פינצטה מהדק נקי ויבש ולאתר אותם הבוכנה הידנית. בדוק חזותית כל פינצטה לפני הצלילה כדי להבטיח שהם אינם פגומים והם נקיים ממזהמים.

3. הכן את קריוגן dewar ואת הבוכנה הידנית

הערה: זמן פעולה משוער: 5-15 דקות

  1. התקן את בסיס הפלטפורמה בתחתית הדה-וור של הצלילה. הנח את כלי האתאן dewar על גבי בסיס הפלטפורמה, להוסיף את כלי האתאן פליז, ולאחר מכן להתקין את פלטפורמת אחסון רשת ספינינג.
    1. לאחר הוספת חנקן נוזלי (LN2) ל-dewar צולל, לא ניתן עוד להתאים את גובה בסיס הפלטפורמה. ודא שבסיס הרשת מותקן כראוי ורמה להגבלת נזקי הרשת ו/או פינצטה עקב גובה בוכנה לא תקין.
  2. לפני ההקפאה, בדוק את הבוכנה הידנית ואת כל הציוד הנלווה כדי לוודא שהם מתפקדים כראוי כדי להגביל את אובדן הדגימה ו / או הרשת.
  3. לפני כל מפגש הקפאה, החליפו את הקלטת בזרוע הבוכנה הידנית המשמשת להחזקת פינצטה. הלחות הגבוהה של החדר יכולה לדרדר את הדבק ולהקטין את היכולת של הקלטת להחזיק את פינצטה, להגדיל את הסבירות של נזק פינצטה ו / או אובדן רשת.
  4. התאם את המנורות ליד הבוכנה הידנית כדי לוודא שיש מספיק אור כדי לפקח על פתיל הדגימה ולהבטיח שהעברת רשת תדמיין בקלות כדי למנוע נזק ורשת ו/או אובדן (ראה שלב 3.7). השתמש במנורת טבעת ישירות מאחורי הבוכנה כדי לדמיין תנועה נוזלית ואור משימה גמיש בזרוע ליד dewar כדי להאיר את הרשתות הקפואות.
  5. התאם את מתח הדוושה של כף הרגל כדי להבטיח שזרוע הצלילה של dewar תישמר בבטחה במקומה בזמן שהיא נמצאת במצב מוגבה ומשוחררת במלואה כאשר הדוושה מדוכאת. בצע מספר ריצות "יבשות" לפני יישום מדגם כדי להבטיח הבוכנה פועלת כראוי.
    הערה: התאמה לא נכונה של מתח דוושת כף הרגל תגרום לשחרור מוקדם של הזרוע צוללת (כלומר, המתח מוגדר נמוך מדי) ואובדן רשת או צלילה לא שלמה של הרשת לתוך כלי האתאן (כלומר, המתח מוגדר גבוה מדי).
  6. מניחים את ההשמדה צוללת בבסיס הבוכנה הידנית ישירות מתחת לזרוע הצוללת ומאבטחים אותה במקומה. חבר זוג פינצטה לזרוע הצוללת באמצעות הסרט המצורף. בעת החזקת זרוע הצלילה הידנית, הדחיקו את דוושת כף הרגל כדי להוריד בזהירות את הזרוע הצוללת ולהתאים את הנסיעה של הזרוע הצוללת כדי להבטיח שהרשת תאתר בתוך אמצע כלי האתאן.
  7. השתמש בתחנת הבליטה בחלק העליון של הזרוע הצוללת כדי לקבוע את המיקום הסופי של הזרוע הצוללת כאשר דוושת כף הרגל מדוכאת לחלוטין (איור 1B). התאם את גובה עצירת הבליטה בזרוע הצוללת כדי להתאים את מיקום הרשת בכלי האתאן (איור 1C).
    הערה: הגדרה לא נכונה של גובה הזרוע צוללת עלולה להוביל לנזק ברשת ו/או לפינצטה (למשל, גובה הזרוע הצוללת מוגדר נמוך מדי) או vitrification לקוי (למשל, גובה הזרוע צולל מוגדר גבוה מדי).
  8. אתר את dewar מחוץ לחדר הקר ולהמשיך להכנת אתאן נוזלי (שלב 4).

4. הכן את הקריוגן

הערה: זמן פעולה משוער: 10-30 דקות

  1. להעריך את מיכל האתאן, הרגולטור, הצינורות, ואתאן מחלק טיפ לכל סימן של נזק. דווחו ולתקן מיד כל סימן לנזק לפני שתמשיכו.
    אזהרה: אתאן ואתאן דחוסים: תערובות גז פרופן הן דליקות ועלולות להוות איום חמור על החיים ו/או לגרום לפציעה אם מטופלים כראוי. אנא התייעץ עם מומחה אם אינו בטוח כיצד לפעול או לטפל במיכלי גז דחוסים. יש לעיין בהנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד בעת טיפול בגזים דחוסים דליקים. בנוסף, אתאן נוזלי הוא קריוגן רב עוצמה שיכול להוות איום רציני על החיים ו/או פציעה אם לא מטופל כראוי. יש לעיין בהנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד בעת טיפול בקריוגנים.
  2. לרכוש מספיק LN2 מתאים לטיפול LN2 dewar (כלומר, 3-4 L אופייני להכנת רשת ואחסון).
    זהירות: LN2 הוא קריוגן שיכול להוות איום רציני על החיים ו/או פציעה אם לא מטופל כראוי.
    1. ודא שכל ציוד ההגנה האישי מנוצל כדי למזער את הסיכון לפציעה. האדים של LN2 הוא חנק ויש לטפל בו באזורים מאווררים היטב. אנא התייעצו עם מומחה אם לא בטוחים כיצד לפעול או להתמודד עם כלי קריוגניים קריוגנים. יש לעיין בהנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית של המוסד בעת טיפול בקריוגנים. במצבים בהם לא ניתן להשתמש בחנקן נוזלי בחדר קר, אנו ממליצים על הקפאת צלילה בחלל קריר ומאוורר היטב.
  3. מחוץ לחדר הקר, לקרר את dewar צולל על ידי שפיכת LN2 ישירות לתוך כלי האתאן פליז עד שרמת החנקן הנוזלי מגיעה לחלק העליון של כלי האתאן (כלומר, ממש מעל הפלטפורמה). תכבה את ה-LN2 מחוץ לחללית האתאן לפי הצורך. המשך לשלב הבא כאשר LN2 מפסיק לבעבע באלימות (כ 5 דקות).
    1. הוסף LN2 ישירות לכלי האתאן פליז כדי לקרר מספיק את הכלי לפני עיבוי גז אתאן. כישלון לקרר כראוי את כלי האתאן פליז יגדיל באופן דרמטי את הזמן שלוקח לדחוס אתאן.
    2. לאחר dewar הגיע טמפרטורת LN2 , להימנע מילוי יתר של dewar כך LN2 נשפך לתוך כלי האתאן.
  4. אתאן מגיע כגז דחוס וצריך להניך אותו לשימוש. מיכל האתאן משתמש בווסת דו-שלבי בעל טוהר גבוה כדי לשלוט בזרימת הגז. חבר צינורות שסתום שקע הרגולטור ולהשתמש 14 מד מתכת שטוחה מחלק קצה מחובר בסוף לחלוקת אתאן.
  5. לפני פתיחת שסתום המיכל הראשי אתאן, ודא את הידית התאמת הלחץ שסתום שקע סגורים כל הדרך. פתחו את שסתום המיכל הראשי באופן מלא ולאחר מכן פתחו את שסתום השקע ל- ~ 50%. פתחו לאט את ידית התאמת הלחץ עד לזרימת גז איטית. השתמש שסתום השקע כדי לכוונן את זרימת הגז.
    זהירות: תמיד כוון את קצה חלוקת המתכת הרחק מעצמו בעת פתיחת שסתומים או ביצוע התאמות זרימת גז.
  6. לאט לאט להתחיל את זרימת הגז ולהעריך את קצב הזרימה על ידי החדרת קצה קו הגז אתאן לתוך קטנה של מים deionized. התאם את זרימת הגז עד שקצב הזרימה יפריע במתינות למים.
    1. התאם את קצב זרימת הגז כדי להבטיח עיבוי אתאן תקין מתרחשת - איטי מדי של קצב זרימה יגרום גז אתאן להתמצק בקצה מחלק ומהיר מדי של קצב זרימה יגרום מבעבע אינטנסיבי ולמנוע הקפאה.
  7. לפני הכנסת קצה קו הגז אתאן לתוך כלי האתאן פליז, לנקות ולנגב את הקצה מחלק עם מגבוני משימה עדינים כדי להסיר את כל המים.
  8. בתנועה חלקה ומהירה, אתר את קצה חלוקת הגז בתחתית כלי האתאן מפליז והתחל להזיז את הקצה מחלק במעגל איטי סביב תחתית כלי האתאן. אתאן מוצק ייווצר באופן מיידי אבל יהיה נוזלי במהירות כמו יותר גז אתאן מתווסף / מרוכז.
    1. ממשיכים להזיז את אתאן המתכת מחלק קצה בתחתית כלי האתאן כדי להניב את האתאן המוצק. ממלאים את כלי האתאן ל-3/4 מלא באתאן נוזלי (2-3 חוטים מלמעלה). עצור את זרימת גז האתאן על ידי הסרת טיפ חלוקת אתאן המתכת בזהירות מכלי האתאן מפליז וסגירת שסתום השקע.
  9. למעלה את dewar צולל עם LN2 שופך בעדינות בצד dewar כדי למנוע LN2 תוספת כלי האתאן פליז, עד הרמה הנוזלית רק נוגע כלי האתאן פליז. מניחים את מכסה הקצף על dewar צולל כדי להקל על התגבשות אתאן.
    1. LN2 חייב ליצור קשר ישיר עם כלי האתאן פליז כדי לסייע בהתגבשות של אתאן. לאחר כ 5 דקות, האתאן בתוך כלי הפליז יהפוך קפוא לחלוטין מוצק. הוסף עוד LN2 עד שהוא רק נוגע בכלי האתאן ולהמשיך לשלב הבא.
  10. אם האתאן לא קפוא מוצק, אז כלי האתאן פליז אינו קר מספיק עבור הצעדים הנותרים. מוסיפים עוד LN2 עד שהוא רק נוגע בכלי האתאן וממתין 5 דקות נוספות. ודא כי האתאן בתוך כלי הפליז קפוא לחלוטין מוצק.
  11. פתח את שסתום שקע הגז כדי לייצר זרימת גז אתאן בקצב דומה כפי שנקבע בשלב 4.6. מניחים אנכית את האתאן המתכתי מחלק את הקצה לאתאן המוצק וממשיכים להזיז את קצה חלוקת האתאן בתנועה מעגלית כדי להמיס את האתאן המוצק.
    1. ממשיכים להוסיף אתאן עד שהוא מאוזן עם החלק העליון של כלי האתאן פליז. הסר לאט את הקצה מכלי האתאן וסגור את שסתום שקע מיכל האתאן. מכסים את dewar עם המכסה במשך ~ 1-4 דקות (ים) כדי לתת את האתאן להתמצק סביב הקצוות של כלי האתאן פליז.
      הערה: כלי אתאן אידיאלי יהיה טבעת סימטרית 2-3 מ"מ של אתאן מוצק בהיקף כלי האתאן פליז עם אתאן נוזלי במרכז (איור 1D ואיור 2).
    2. ודא כי האתאן להיות קר ככל האפשר מבלי להתמצק כדי להבטיח vitrification תקין של הדגימה הביולוגית. אי הכנת האתאן הנוזלי כראוי עלולה לגרום להיווצרות לקויה של הדגימה, הצטברות הקרח ו/או אובדן הדגימה, כל אחד מהם תורם להידרדרות איכות הדגימה להדמיה.
    3. אם טבעת מוצקה של אתאן לא נוצרת לאחר 2-3 דקות, להוסיף עוד LN2 כדי dewar לכסות במשך 2-5 דקות נוספות.
    4. אם האתאן מתמצק מהר מדי, יש להשתמש בזוג גדול של פינצטה נקייה כדי לחמם בעדינות את כלי האתאן ו/או אתאן מוצק כדי למנוע התגבשות אתאן מלאה. ברגע האתאן ו LN2 יציבים, לסגור את כל שסתומי מיכל האתאן ולאתר את dewar צולל אל הבוכנה הידנית. אבטחו את ההשמדה לצלול לפוכנה הידנית.
      אזהרה: היזהר במיוחד בעת העברת dewar כמו LN2 יכול לשפוך לתוך כלי האתאן ולבסס את האתאן הנוזלי. במידת הצורך, קבוצה נקייה של פינצטה יכולה לשמש להמסת כל אתאן מוצק באמצע הכלי.
  12. בדקו את מיקומו של האתאן דיואר עם זוג פינצטה ריקה כדי להבטיח שקצה פינצטה יאתר במרכז כלי האתאן ויש מספיק מקום לרשת ולקצה פינצטה בתוך האתאן הנוזלי (איור 1D).
    1. אם טבעת האתאן המוצקה עבה מדי לטיפול קל ברשת, השתמש בזוג טמפרטורת החדר, פינצטה נקייה כדי להמיס את האתאן המוצק וליצור אזור הקפאה יותר במרכז כלי האתאן.

5. הכן רשתות EM

הערה: זמן פעולה משוער: 1-5 דקות

  1. הוסף את תיבות האחסון של הרשת ל- dewar, פתח את המכסה של תיבת אחסון הרשת וודא שכל מכסה יכול להסתובב בחופשיות לחריץ רשת חדש.
  2. העבר בזהירות רשתות מתיבת אחסון הרשת לקצה מכסה הזכוכית הריבועית עם ~ 30-40% מהרשת מקצה השקופית. ודא שנייר הרשת פונה כלפי מעלה. ודא שהרשתות מכוסות כאשר הן אינן בשימוש. הצבת הרשתות על קצה מכסה הזכוכית הריבועית מספקת קלות של טיפול ברשת ומקטינה את הסיכוי לכופף או לפגוע ברשת במהלך ההעברה.
    הערה: רשתות 4-6 מוכנות בדרך כלל בכל פעם.
  3. רנדר רשתות הידרופיליות באמצעות מפרש זוהר או מנקה פלזמה.
    הערה: אנא עיין בהנחיות המומלצות לניקוי רשת המסופקות על ידי יצרן המפרש/מנקה הפלזמה הזוהר.
    1. השתמש ברשתות בתוך 10 דקות של ניקוי פלזמה כמו הרשתות לאבד הידרופיליות ורשת לרשת רבייה פוחתת לאחר זמן זה.

6. הכן דגימת קריום על ידי הקפאת צלילה

הערה: זמן הפעלה משוער: >10 דקות (~ 1-3 דקות לרשת)

  1. השתמש פינצטה מהדקת נקייה ויבשה כדי להרים רשת נקייה, להחליק את מהדק הפלסטיק כלפי מטה כדי לתקן את הרשת במקום, והקש בעדינות על פינצטה כדי להבטיח את הרשת מאובטחת כראוי.
    1. טפל ברשתות ליד הטבעת החיצונית כדי למנוע נזק לרדיד הרשת.
  2. החל 1 עד 5 μL של מדגם על הצד מוכן (למשל, בצד הקדמי או רדיד אלומיניום) של הרשת.
    הערה: הנפח האופטימלי וזמן הכתם תלויים במדגם ויש למטב אותו עבור כל דגימה; אמצעי אחסון גדולים יותר ודגימות צמיגות יותר דורשים זמני חשיפה ארוכים יותר.
  3. אבטחו את ההרכבה מדגם פינצטה לזרוע הצלילה הידנית על ידי עטיפת סרט הדבקה סביב ידית הפינצטה.
    1. התייצבו מול המדגם כלפי המשתמש לקבלת כתמים קדמיים מסורתיים. אם המדגם דורש סגירה לאחור, אתר את הדוגמה הרחק מהמשתמש.
  4. החזק חתיכת נייר סופגת נקייה, יבשה וחתכה בין האגודל לאצבע המורה של כל יד.
    1. רק להתמודד עם ניירות סופג מהקצוות ולא לגעת במרכז כמו שמנים ומזהמים אחרים מן הידיים / כפפות יכול לשנות את איכות הרשת.
  5. הנח את הידיים על קצה ההשמדה לצלול כדי לבסס עמדה יציבה. אתר את נייר הכתם במקביל למשטח הרשת במרחק של כ-1 ס"מ משטח הרשת.
    1. השתמש בחלק האמצעי של נייר הכתמים כדי לאפשר ניידות נוזלים מלאה ואפילו פתיל על פני הרשת.
  6. החלק בעדינות וסובב את האצבע והטבעת זו לעבר זו כדי לכופף נייר סופג לכיוון הרשת כדי ליזום כתמים. שמרו על קשר בין נייר הכתם למשטח הרשת במהלך כל תהליך הכתם.
    1. צרו קשר ישירות עם נייר הכתמים אל משטח הרשת ושמו על מגע עקבי לאורך פני הרשת.
    2. כיפוף עדין של נייר הכתמים מקטין את כיפוף הרשת ו/או את הנזק למשטח הרשת, ומביא לקרח עקבי יותר על פני הרשת (איור 3A).
  7. שים לב לחזית הנוזל הניידת וברגע שהוא מפסיק להתקדם לתוך נייר הכתמים להתחיל לספור במשך 4 עד 6 שניות.
    הערה: ספירה יכולה להתרחש לאחר שהנייר הנפוח יוצר קשר עם משטח הרשת, אך ניתן לבצע שחזור רשת לרשת נמוך יותר. זמן הכתם הכולל יהיה תלוי בסוג הרשת, סוג רדיד אלומיניום, ריכוז המדגם וסוג המדגם (למשל, מסיס לעומת קרום לעומת חלבונים חוטיים). עבור דגימות צמיגות נוספות זמני כתם ארוכים יותר (למשל, 5 עד 7 שניות) יידרשו.
    1. חשוב: לפתח ערכת ספירה אמינה ועקבית כדי לשפר מאוד את יכולת הרבייה במהלך תהליך ההקפאה.
  8. הזז את האצבעות השמאליות, הימניות והאצבעות באצבעות המדד בכיוונים מנוגדים כדי להסיר את נייר הכתם ב"תנועת הצמדה" הרחק ממשטח הרשת. מיד לדכא את דוושת כף הרגל לשחרר את הזרוע צוללת לצלול את הרשת לתוך אתאן נוזלי.
    1. בו זמנית להסיר את נייר סופג ולחץ על דוושת כף הרגל לצלול את הרשת לתוך האתאן בהקדם האפשרי לקבלת התוצאות הקפאה הטובות ביותר. ככל שהזמן בין הסרת נייר סופג וצלילה, כך תתרחש אידוי רב יותר של סרטים דקים ותפחית את יכולת הרבייה מרשת לרשת.
  9. השתמש ביד אחת כדי לייצב את פינצטה מהדקת, לשחרר סרט בזהירות מסביב פינצטה וזרוע צלילה ידנית.
    1. תמיד לשמור על קשר עם פינצטה כדי למנוע תנועה של רשת פינצטה ולהגביל את הנזק ברשת המתרחשים לדפוק את הרשת נגד האתאן המוצק.
  10. לאחר פינצטה מהדקים חופשיים מזרוע הצלילה הידנית, לשמור על פינצטה ביד אחת נח על גבי dewar צולל, להבטיח את הרשת נשארת באתאן הנוזלי. החלק בזהירות את מהדק הפלסטיק מהרשת כדי שניתן יהיה להעביר את הרשת. לשמור על לחץ על פינצטה כדי לשמור על הרשת.
    1. בתנועה מהירה אחת, העבר במהירות את הרשת מכלי האתאן למאגר LN2 . מקם בזהירות את הרשת בתיבת אחסון הרשת.
      הערה: אתאן מסוים עשוי להתמצק על פני הרשת. פתיחת פינצטה מעט תשבור את האתאן ותאפשר את הורדת הרשת לתיבת הרשת.
  11. עוטפים את קצה פינצטה בניגוב משימה עדין כדי למנוע הצטברות כפור. מניחים בצד עד שהפינצטה חוזרת לטמפרטורת החדר.
    1. יש 4 עד 6 פינצטה בהישג יד להקלה על השימוש. כל פינצטה תשמש להקפאת דגימה וחימום לפני השימוש הבא.
  12. חזור על שלבים 6.1-6.11 עבור כל רשת.
  13. לאחר שההקפאה הגיעה לשיאה, סגור באופן מאובטח את תיבת הרשת ועבר למיקום אחסון מתאים.
  14. יש להיפטר בזהירות מהאיתאן הנוזלי ומ-LN2 ולאחסן את כל החומרים במקום יבש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביצוע מוצלח של פרוטוקול הכתם והצללה המתואר כאן יביא לשכבה דקה ואחידה של קרח זגוגית, נטולת קרח משושה, מזהמים ושיפועים גדולים של קרח בלתי שמיש שניתן לצפות בהם תחת מיקרוסקופ האלקטרונים (איור 3). מגע לא עקבי של נייר הכתמים עם משטח הרשת, הסרה מוקדמת של נייר הכתם, או הזזת נייר הכתם במהלך מגע רשת יכול להקטין את איכות הקרח הזגג ולהוביל לעובי קרח לא עקבי על פני רשת EM (איור 4)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

vitrification של דגימות ביולוגיות להדמיה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית חלקיק יחיד (cryoEM) נשאר צעד חשוב מאוד לקביעת מבנה מוצלחת. שיטת הכתם והצלילה הידנית המתוארת בפרוטוקול זה מייצגת שיטה חסכונית, אמינה וחזקה להקפאה מהירה של דגימות ביולוגיות בסרטים דקים של קרח שרץ להדמיית cryoEM. באמצעות השיטות המתוארות בכתב היד, החוקרים יוכלו להרכיב ולהפעיל את הבוכנה הידנית, להכין קריוגן המתאים לדגימות ביולוגיות הקפאת הבזק, ולהכתים ולצלוח באופן ידני רשתות EM המכילות דגימות ביולוגיות. בעוד שיטה זו היא די חזקה, יש לנקוט זהירות במ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לחברי מעבדת הרציק על החשיבה הביקורתית ומתן משוב על כתב יד זה ותוכן הווידאו. M.A.H.Jr נתמך על ידי NIH R35 GM138206 וכמלומד סירל. H.P.M.N נתמך על ידי מענק אימון ביופיסיקה מולקולרית (NIH T32 GM008326). ברצוננו גם להודות לביל אנדרסון, צ'ארלס באומן וד"ר גבריאל לנדר במכון המחקר סקריפס על העזרה בתכנון, הרכבה ובדיקה של הבוכנה הידנית המוצגת בסרטון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תיבת אחסון רשת 4 חריציםטד פלה160-40
14 מד שטוח מתכת מחלק טיפ אמזון
22x22 מ"מ כיסוי זכוכית מרובעתסיגמאC9802-1PAK
60 מ"מ זכוכית צלחת פטרי לאחסון רשתותפישר08-747A
צלחת פטרי זכוכית 100 מ"מ לאחסון נייר ווטמןפישר08-747D
צלחת פטרי זכוכית 150 מ"מ לאחסון נייר ווטמןפישר08-747F
250 מ"לפישר02-555-25B
קלקר כחול dewarSpear LabFD-500
כלי אתאן פליזLasco17-4075
פינצטה הידוקטד פלה38825
מגבוני משימות עדיניםפישר06-666
ווסת דו-שלבי עם שסתום בקרהAirgasY12N245D580-AG
בסיס רשת DewerUCSD
פלטפורמת אתאןUCSD
מיכל פרופאן אתאןPraxairET PR50ZU-Gאתאן (50%) : פרופאן (50%) במיכל בלחץ גבוה
מיכל אתאןPraxairUN1035אתאן (100%)
זרוע גמישה אור משימהAmscopeLED-11CR
רשתות (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 רשת)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתQ325AR1.3
מכשיר אדיםיעד719438
מד לחותThermoProB01H1R0K68
מעיל מעבדהUCSD
חנקן נוזלי dewarוורת'ינגטוןכפפות חנקן נוזלי LD4
פישר19-059-925
מעמד בוכנה ידני (מעמד שחור + דוושת רגל)UCSD
Mark 5 (פלטפורמת צלילה)כפפות ניטריל UCSD
VWR82026-424
P20 פיפטהאפנדורף13-690-029
צינורות PCRאפנדורף
E0030124286 טיפים לפיפטהibis מדעי63300005
מנורת טבעתאמזוןB07HMR4H8G
משקפי בטיחותUCSD
מספרייםאמזוןפיסקרס 01-004761J
מברגאיירונסייד354711
סרטפישר15-901-10R
פינצטה להעברת תיבת רשתאמזוןLTS-3
צינורות טיגוןפישר14-171-130
נייר ספיגה ווטמןפישר1001-090
B07M7YWWLT

מקורות

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047(2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006(2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482(2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747(2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257(2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027(2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773(2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275(2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730(2020).
  53. Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קריו-EM של חלקיק בודדהקפאה מהירה ידניתהכנת קרח ויטריפימיקרוסקופיית אלקטרונים חודרתהכנת רשת לקריו-EMהקפאה באתאן נוזליטכניקת נייר ספיגהויטריפיקציה של דגימות ביולוגיות
הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.