כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס
במאמר זה
סיכום
תקציר
שלל חוץ-תאי (EVs) משמשים במחקרים שונים כדי להוכיח את הפוטנציאל שלהם כטיפול ללא תאים בשל המטען שלהם נגזר מהמקור הסלולרי שלהם, כגון טסיות דם ליסאט (PL). כאשר נעשה שימוש כטיפול, EVs צפויים להיכנס לתאי היעד ולחולל תגובה מאלה. במחקר זה, EVs שמקורו PL נחקרו כטיפול ללא תאים עבור דלקת מפרקים ניוונית (OA). לכן, נקבעה שיטה לסימון רכבים דרכים אלקטרוניים ולבחון את ספיגתם על מגרשי סחוס. כלי עבודה חשמליים שמקורם ב-PL מסומנים בצבע ליפופילי PKH26, נשטפים פעמיים דרך עמוד, ולאחר מכן נבדקים במודל OA מונע דלקת במבחנה למשך 5 שעות לאחר כימות חלקיקים על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA). לפי שעה, explants סחוס קבועים, paraffined, לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר לעלות על שקופיות, ונצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הדבר מאפשר אימות אם EVs להזין את תאי היעד (chondrocytes) במהלך תקופה זו ולנתח את ההשפעה הישירה שלהם.
מבוא
דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה ניוונית מפרקית המרמזת על דלקת מתקדמת ובלתי הפיכה והרס של המטריצה החוץ תאית של הסחוס המפרקי1. למרות צורות שונות של דלקת פרקים יש טיפולים רבים2,3,4, אלה מוגבלים על ידי תופעות הלוואי שלהם ויעילות מוגבלת. טכניקות הנדסת רקמות באמצעות השתלת כונדרוציטים אוטולוגית מיושמות באופן שגרתי לטיפול רגנרטיבי של סחוס פצוע בפצעים סחוס מוקדם OA4. טיפולים מבוססי תאים מוגבלים בעיקר בשל המספר המוגבל של כונדרוציטים יציבים פנוטיפיקית או chondroprogenitors המסוגלים לתקן ביעילות את הסחוס3. לכן, פית....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: מגרשי סחוס התקבלו מהביובנק IdISBa (IB 1995/12 BIO) בהתאם להנחיות המוסדיות לאחר אישור אתי של הפרויקט על ידי ה- CEI-IB (IB 3656118 PI).
1. הכנת טורים
- עקוב אחר עמודות שיווי משקל בהתאם להוראות היצרן או באופן הבא:
- הסר את מכסה העמודה ושיילו את העמודה. הסר את מאגר האחסון על ידי אלגנטיות.
- לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). במהלך כל שטיפה, המתן עד שהעמודה תספוג את כל עוצמת הקול.
הערה: אל תיתן לעמודה להתייבש. - מכסים את העמודה עם המכסה לאחר הכביסה האחרונה ועד הכנת המדגם.
2. תיוג EV
הערה: פרוטוקול תיוג ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סקירה סכמטית לניטור תיוג וספיגה של EV מוצגת באיור 1. ריכוז החלקיקים וגודל EV שזוהו על ידי NTA בטבלה 1 מראים כי ריכוז EV פוחת במהלך התהליך עקב שלב הטיהור המבוצע פעמיים לאחר תיוג עם העמודה. עם זאת, הסכום המתקבל הוא בטווח האופטימלי של מספר החלקיקים לשימוש לטיפול. ריכוז חלקיקים זה משמש לחישוב הנפח של PKH-PL-EV ושליטה המשמשים לטיפול explants סחוס osteoarthritic.
לאחר explants הסחוס מטופלים עם רכבים אופן אלקטרוני או קבוצת הביקורת, הם קבועים לתקופות שונו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיית EV מסייעת להבין תכונות EV, כגון מנגנוני השחרור והספיגה שלהם. ההדמיה שלהם מאפשרת ניטור של ההבחנה הביולוגית שלהם ואת אפיון המאפיינים הפרמקוקינטיים שלהם ככלי רכב תרופתיים. עם זאת, דימות EV ומעקב עשוי להיות קשה בשל הגדלים הקטנים שלהם, אם כי מכשירי הדמיה רבים וטכניקות תיוג פותחו כדי לעזור לחוקרים לפקח על EVs תחת במבחנה ובתנאי vivo 23,24,25.
קיימות שתי אפשרויות בעת מעקב אחר EVs על י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי המכון לסאלוד קרלוס השלישי, שר הכלכלה y Competitividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן לפיתוח אזורי אירופי ERDF (MS16/00124; CP16/00124); על ידי PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, לפרש SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), ממומן על ידי מס תיירות בת קיימא של האיים הבלאריים; על ידי Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); על ידי תוכנית הפוסט-דוקטורט FOLIUM (FOLIUM 17/01) בתוך FUTURMed, ממומנת ב -50% על ידי מס התיירות בת קיימא של האיים הבלאריים וב -50% על ידי ESF; and by the Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומר | |||
| 1.5 מ"ל צינור צנטריפוגה | SPL מדעי החיים | PLC60015 | |
| 1 מ"ל מזרק BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-פרופנול (איזופרופנול | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | מוכן ב-20% עם |
| צלחת תרבית | בארות | SPL מדעי החיים | |
| אתנול אבסולוטי Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | משמש להכנת 96% ו-75% אתנול עם מים Milli-Q |
| ביופסיה אגרוף עם בוכנה 3 מ"מ | Scandidact | MTP-33-32 | |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | מוכן ב-5% עם PBS |
| מחצית סחוס | IdISBa ביובנק | ||
| צינור ריכוז 15 מ"ל Nanosep 100 kD Omega | Pall | MCP100C41 | |
| צינור ריכוז 500 ומיקרו; L Nanosep 100 kD Omega | Pall | OD003C33 | |
| כיסוי זכוכית 24 x 60 מ"מ | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX בינוני | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| בלוקים משובצים של רקמת פרפין | IdISBa עמלת ביובנק | עבור שירות | |
| עמודות Exo-spin mini-HD | מערכות הנחיית תאים | EX05 | |
| Feather S35 מיקרוטום להב | נוצה | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 ומיקרו; מסנן מזרק m | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Fluoroshield עם DAPI | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| Oncostatin M Human | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | הכן תמיסת מלאי לריכוז סופי של 0.1 ומיקרו; g/µ L דילול ב-PBS-0.1% BSA |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | מוכן ב-4% עם PBS ומאוחסן ב-4 מעלות; C |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים לתיוג קרום תא כללי | סיגמא-אולדריץ' | MINI26 | PKH26 ו-Dliuent C כללו |
| נתרן ציטראט דיהידרט | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות | תרמו מדעי | J1800AMNZ | |
| TNFואלפא; | מו"פ D מערכות | 210-TA-005 | הכנת תמיסת סטוק לריכוז סופי של 0.01 ומיקרו; g/µ L מדולל ב-PBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | משמש להכנת תמיסת נתרן ציטראט 0.1% טריטון-0.1% עם מים Milli-Q |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| <חזק>ציוד | |||
| צנטריפוגה 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 |
| רוטור NanoSight NS300 | מכשיר Malvern | NS300 | עם לייזר משובץ ב λ= 532 ננומטר ומצלמה sCMOS |
| Shandon Finesse 325 ידני Microtome | Thermo Scientific™ | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי TCS-SPE | Leica Microsystems | 5200000271 |
מקורות
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
