הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62780

⸱

4 באוקטובר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy and Tissue Engineering Group, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands, 2Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa), 3Cellomics Unit, Institut Universitari d'Investigació en Ciències de la Salut (IUNICS), Universitat de les Illes Balears, 4Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (FBSTIB)

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.

תקציר

שלל חוץ-תאי (EVs) משמשים במחקרים שונים כדי להוכיח את הפוטנציאל שלהם כטיפול ללא תאים בשל המטען שלהם נגזר מהמקור הסלולרי שלהם, כגון טסיות דם ליסאט (PL). כאשר נעשה שימוש כטיפול, EVs צפויים להיכנס לתאי היעד ולחולל תגובה מאלה. במחקר זה, EVs שמקורו PL נחקרו כטיפול ללא תאים עבור דלקת מפרקים ניוונית (OA). לכן, נקבעה שיטה לסימון רכבים דרכים אלקטרוניים ולבחון את ספיגתם על מגרשי סחוס. כלי עבודה חשמליים שמקורם ב-PL מסומנים בצבע ליפופילי PKH26, נשטפים פעמיים דרך עמוד, ולאחר מכן נבדקים במודל OA מונע דלקת במבחנה למשך 5 שעות לאחר כימות חלקיקים על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA). לפי שעה, explants סחוס קבועים, paraffined, לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר לעלות על שקופיות, ונצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הדבר מאפשר אימות אם EVs להזין את תאי היעד (chondrocytes) במהלך תקופה זו ולנתח את ההשפעה הישירה שלהם.

מבוא

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה ניוונית מפרקית המרמזת על דלקת מתקדמת ובלתי הפיכה והרס של המטריצה החוץ תאית של הסחוס המפרקי1. למרות צורות שונות של דלקת פרקים יש טיפולים רבים2,3,4, אלה מוגבלים על ידי תופעות הלוואי שלהם ויעילות מוגבלת. טכניקות הנדסת רקמות באמצעות השתלת כונדרוציטים אוטולוגית מיושמות באופן שגרתי לטיפול רגנרטיבי של סחוס פצוע בפצעים סחוס מוקדם OA4. טיפולים מבוססי תאים מוגבלים בעיקר בשל המספר המוגבל של כונדרוציטים יציבים פנוטיפיקית או chondroprogenitors המסוגלים לתקן ביעילות את הסחוס3. לכן, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות למניעת התקדמות המחלה וחידוש נגעים סחוס גדולים הוא בעל חשיבות עליונה.

שלל חוץ תאי (EVs) הוצעו כטיפול OA על ידי מחברים שונים5,6. רכבים יפים הם גופים membranous המופרשים על ידי רוב סוגי התאים, מעורבים איתות בין תאי, הוכחו להפעיל את ההשפעות הטיפוליות של תאי גזע7,8,9, שבגללם הם עוררו לאחרונה עניין ברפואה רגנרטיבית10. EVs נגזר תאים סטרומיים mesenchymal (MSCs) הם EVs הטיפולי העיקרי נחקר עבור OA, אם כי תאים אחרים הקשורים למפרקים שימשו כמקורות EV, למשל, chondroprogenitors או תאים חיסוניים11,12.

תרכיזי טסיות דם, כגון טסיות דם (PLs), משמשים כדי לשפר את ריפוי הפצע בפציעות שונות, כגון כיבים קרנית13,14,15 או התחדשות רקמתגיד 16, בגלל ההשערה כי רכיב EV של תרכיזי טסיות דם עשוי להיות אחראי על תופעות אלה17 . מחקרים מסוימים הקשורים למחלות הקשורות למפרקים משתמשים בטסיות דם אלקטרוניות (PL-EVs) כטיפול כדי לשפר מצבים אוסטיאוארטיטיקה. PL-EVs לשפר את התפשטות chondrocyte ונדידת תאים על ידי הפעלת Wnt / β-catenin מסלול18, קידום הביטוי של סמנים chondrogenic בכונדרוציטים osteoarthritic19, או מראה רמות גבוהות יותר של חלבונים כונדרוגניים ופחות חריגות tissular בארנבות osteoarthritic שטופלו PL-EVs18.

רכבים אופניים מכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין המשוחררים לתא היעד, ומבססים תקשורת בין תאים, שהיא התכונה העיקרית הקשורה ליישומים הטיפוליים שלהם20. ההשפעות של רכבים הפעלה אלקטרוניים תלויות בתאים המגיעים אליהם ובשחרור המטען הבא. השפעה זו יכולה להיות מאושרת בעקיפין על ידי שינויים הנגרמים בתאים, כגון פעילות מטבולית או שינוי ביטוי גנים. עם זאת, שיטות אלה אינן מאפשרות הדמיה של האופן שבו EVs להגיע לתאים כדי להפעיל את הפונקציה שלהם. לכן, מאמר זה מציג שיטה לתייג את אלה PL נגזר רכבים רחפנים לשמש כטיפול עבור דלקת מונע סחוס explants. מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה לניטור ספיגת EV והתקדמות chondrocytes הנוכחי explants ב- time-lapse של 5 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: מגרשי סחוס התקבלו מהביובנק IdISBa (IB 1995/12 BIO) בהתאם להנחיות המוסדיות לאחר אישור אתי של הפרויקט על ידי ה- CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. הכנת טורים

  1. עקוב אחר עמודות שיווי משקל בהתאם להוראות היצרן או באופן הבא:
    1. הסר את מכסה העמודה ושיילו את העמודה. הסר את מאגר האחסון על ידי אלגנטיות.
    2. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). במהלך כל שטיפה, המתן עד שהעמודה תספוג את כל עוצמת הקול.
      הערה: אל תיתן לעמודה להתייבש.
    3. מכסים את העמודה עם המכסה לאחר הכביסה האחרונה ועד הכנת המדגם.

2. תיוג EV

הערה: פרוטוקול תיוג EV זה משתמש במדגם PL-EV שבודד בעבר על-ידי כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) עם תנאים שתוארו בעבר21,22. עם זאת, כל דגימת EV ממקור כלשהו עשויה לשמש עם פרוטוקול זה.

  1. מרכז את דגימת EV ואת השליטה (PBS) באמצעות צינור ריכוז.
    1. מקם את הדגימות בצינור ריכוז 15 מ"ל או 500 μL, בהתאם לנפח ההתחלתי של דגימת EV החל. צנטריפוגות הצינורות על פי הוראות היצרן עד לקבלת דגימה כמעט יבשה.
      הערה: דגימת הבקרה נחוצה כדי לבדוק אם יש רקע צבע. למרות שיטה זו אינה דורשת כל נפח ראשוני ספציפי, יש לקחת בחשבון כי סביב 10% של חלקיקים יאבדו במהלך שלבי טיהור.
  2. Resuspend הדגימות המרוכזות עם דגימות EV דילול C. Resuspend עם 200 μL וקבוצת הביקורת עם 100 μL ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים.
  3. להפריד את דגימת EV לשני aliquots של 100 μL. לסמן אחד עם צבע ולהשתמש בו כטיפול (PKH-PL-EV); להשאיר את השני לא מסומן אבל לעבד אותו (NTA-PL-EV) כמו מדגם EV ולהשתמש בו כדי לכמת את ריכוז EV על ידי NTA.
  4. הכן פתרון 2x צבע, וכתוצאה מכך 8 מיקרומטר PKH26 פתרון ב- C דילול.
  5. לערבב 1 μL של 1 mM PKH26 מקשר לכל 125 μL של דילול C במדגם. הכן אמצעי אחסון הדרוש להוספה לדגימות ביחס של 1:1.
  6. הוסיפו תמיסת צבע 2x לדגימות PKH-PL-EV ובקרה ביחס של 1:1 כדי להשיג ריכוז צבע 1x וריכוז PKH26 של 4 מיקרומטר. הוסף את אותו נפח של PBS לדגימת NTA-PL-EV. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. הוסף 5% סרום בקר אלבומין-PBS פתרון הדגימות ביחס 1:1 ולהבטיח כי עוצמת הקול הסופי הוא ~ 400 μL.
    הערה: שלב זה מאפשר הסרה של אינטראקציות צבע לא-מיניות או צבע לא מאוגד.
  8. המשך להפריד את ה- EVs המסומנים מהצבע הלא מאוגד והאינטראקציות הלא-מדעיות של הצבע עם העמודה.

3. בידוד EV מתויג

  1. הסר את המכסה מהעמודה, הוסף 400 μL של המדגם (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV, או בקרה), ולהשליך את כל הנוזל eluted.
  2. המתן עד שהדוגמה תוזן בעמודה לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הבא. מוסיפים 600 μL של PBS ומשליכים את כל הנוזלים הנבהים.
  3. המתן עד שה- PBS יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא. הוסף 600 μL של PBS ולאסוף שבריר של 600 μL ב 1.5. mL צינור צנטריפוגה (EVs או שליטה).
    הערה: שלבים אלה נדרשים כדי להסיר את הצבע העודף מהדגימות. הפרדה נוספת לפי עמודה נדרשת כדי להשיג EVs טהור יותר. לפיכך, השלבים הבאים צריכים להתבצע בעמודה חדשה שישוות (שלב 4.1)או באותה עמודה לאחר שלב כביסה ראשוני (שלב 4.2).
  4. הכן את העמודה לשלב הפרדת EV חדש כדי להשיג EVs טהור יותר. אם זוהי עמודה חדשה, חזור על שלבים 2.1. ו-2.2. אם זה אותו עמודה, לשטוף את העמודה עם 2.5 מ"ל של 20% איזופרופנול ולאחר מכן לחזור על שלבים 2.1 ו 2.2.
  5. הוסף 600 μL של EVs eluted בעבר שהושגו בשלב 2.5 לעמודה ולבטל את אמצעי האחסון הנבהר. המתן עד שהנוזל יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
  6. הוסף 400 μL של PBS והשלך את כל אמצעי האחסון הנבה. המתן עד שהנוזל יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
  7. הוסף 600 μL של PBS ולאסוף שבריר של 600 μL בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. השתמש בדגימות EVs ובקרה עבור ניתוחים נוספים או לאחסן אותם לילה ב 4 oC.
  8. אחסן את העמודות הנמצאות בשימוש עתידי.
    1. לשטוף את העמודה עם 25 מ"ל של 20% איזופרופנול ולהשליך את הנפח eluted. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של PBS.
    2. הוסף את מאגר האחסון שהוסר בשלב 1.1.1 והמתן לכניסה של המאגר לעמודה. מכסים את העמודה במכסה ומאחסנים ב- 4 oC עד לשימוש הבא.

4. כימות EV

  1. הכן 1:1,000 דילול של מדגם NTA-PL-EV ואת מדגם PL-EV הראשוני כמתואר על ידי שני השלבים הבאים.
    1. הכן 1 מ"ל של 1:10 מדולל NTA-PL-EV ו 1 מ"ל של 1:10 PL-EV ראשוני מדולל עם PBS מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
    2. הכן 1 מ"ל של דילול של 1:100 של הדגימות המדוללות הקודמות עם PBS מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  2. הזריקו את דגימת NTA-PL-EV המדוללת 1:1,000 או את דגימת PL-EV הראשונית באמצעות מזרק סטרילי למשאבת NTA. בצע את ההוראות וההמלצות של היצרן לריכוז חלקיקים וקביעת התפלגות גודל.
    הערה: כמו ריכוז EV תלוי בנפח המתנע מדגם, ייתכן שיהיה צורך לקרוא דילול ביניים ולבצע התאמות כדי לקבל קביעת NTA נכונה.

5. EVs המשמש כטיפול עבור דלקת מונעת OA

  1. לשטוף את הסחוס פעמיים עם PBS excise אותו באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 3 מ"מ בתנאים סטריליים.
    הערה: בצע את ההליך מצעדים 5.1 עד 5.6 במכסה המנוע של תרבית התא.
  2. מניחים את explants בצלחות תרבות 96-טוב עם בינוני DMEM-F12 בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 oC, 5% CO2, ו 80% לחות.
    1. כדי להקים מודל OA מונע דלקת, להשלים את המדיום תרבית התא עם 10 ננוגרם / מ"ל oncostatin M ו 2 ng/ mL גידול נמק גורם-אלפא (TNFα).
  3. לטפל explants עם 1 × 109 חלקיקים / גם של EVs מסומן (PKH-PL-EV) או שליטה במדיום תרבית התא בתוספת oncostatin M ו- TNFα.
    הערה: למדוד את עוצמת הקול של המדגם המכיל 1 × 109 חלקיקים / טוב ולהשתמש באותו אמצעי אחסון עבור הפקד.
  4. מוציאים את המדיום מלוחות תרבית התאים 96-well המכילים explants סחוס. הוסף 200 μL של המדיום תרבית התא המתואר בשלב 5.3 לכל באר.
    הערה: אם הצלחות 96-באר היו במגע עם סרום בקר עוברי (FBS), לשטוף כל באר שלוש פעמים עם 200 μL של PBS כדי להסיר כל EVs מן FBS.
  5. עצור את ההחמרה בזמנים שונים: 0, 1, 2, 3, 4 ו 5 שעות.
  6. לשטוף את בארות תרבית התא המכיל את explants הסחוס פעמיים עם 200 μL של PBS.
  7. הוסף 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) לרקמה כדי לתקן את זה עבור 3 שעות ב 4 oC.
    הערה: שלבים הקשורים PFA צריך להתבצע במכסה המנוע אדים בעקבות המלצות גיליון נתוני בטיחות.
  8. הסר PFA, להוסיף 100 μL של PBS, לאחסן את הרקמה הקבועה ב 4 °C (50 °F) ולעבד את הדגימות בתוך 48 שעות.

6. הכנה ודמיון מיקרוסקופי

הערה: הליך היסתולוגי זה מורכב התייבשות, הטמעת פרפין, וצעדי התייבשות. שלבים אלה עשויים להפחית את פלואורסצנטיות הצבע הכוללת (מגבלה המוזכרת בגליון הנתונים עבור PKH26). לכן, הליכים אחרים, כגון חתך קפוא, עשויים להתאים יותר להדמיה של EV על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

  1. הטמע את הרקמות הקבועות בבלוקים פרפין. חותכים את הרקמה ל-6 חלקים בעובי 6 מיקרומטר.
  2. דפראפפיניט את מקטעי הרקמה.
    הערה: כל השלבים באמצעות קסילן צריכים להתבצע במכסה אדים.
    1. לטבול את מקטעי הרקמה קסילן במשך 30 דקות, 100% אתנול במשך 2 דקות, 96% אתנול במשך 2 דקות, 75% אתנול במשך 1 דקות, ולבסוף במים מזוקקים במשך 30 s.
  3. תחדירו את חלקי הרקמות.
    1. הכן 0.1% תמיסה נתרן ציטוט 0.1% כדי permeabilize הרקמה. מוסיפים טיפה של 20 μL לכל קטע רקמות ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף כל סעיף פעמיים עם 20 μL של PBS.
  4. בשקופית מיקרוסקופית, הוסף טיפה של מדיום הרכבה המכיל 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) עם מדיום הרכבה מימי לשימור פלואורסצנטיות. לכסות את השקופית המכילה 3 מקטעי רקמה מהשלב 6.3.1.
  5. לדגור על השקופיות בלילה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
  6. יש לאחסן ב-4 °C (75°F), מוגן מפני אור עד למיקרוסקופיה קונפוקלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סקירה סכמטית לניטור תיוג וספיגה של EV מוצגת באיור 1. ריכוז החלקיקים וגודל EV שזוהו על ידי NTA בטבלה 1 מראים כי ריכוז EV פוחת במהלך התהליך עקב שלב הטיהור המבוצע פעמיים לאחר תיוג עם העמודה. עם זאת, הסכום המתקבל הוא בטווח האופטימלי של מספר החלקיקים לשימוש לטיפול. ריכוז חלקיקים זה משמש לחישוב הנפח של PKH-PL-EV ושליטה המשמשים לטיפול explants סחוס osteoarthritic.

לאחר explants הסחוס מטופלים עם רכבים אופן אלקטרוני או קבוצת הביקורת, הם קבועים לתקופות שונו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הדמיית EV מסייעת להבין תכונות EV, כגון מנגנוני השחרור והספיגה שלהם. ההדמיה שלהם מאפשרת ניטור של ההבחנה הביולוגית שלהם ואת אפיון המאפיינים הפרמקוקינטיים שלהם ככלי רכב תרופתיים. עם זאת, דימות EV ומעקב עשוי להיות קשה בשל הגדלים הקטנים שלהם, אם כי מכשירי הדמיה רבים וטכניקות תיוג פותחו כדי לעזור לחוקרים לפקח על EVs תחת במבחנה ובתנאי vivo 23,24,25.

קיימות שתי אפשרויות בעת מעקב אחר EVs על י...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המכון לסאלוד קרלוס השלישי, שר הכלכלה y Competitividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן לפיתוח אזורי אירופי ERDF (MS16/00124; CP16/00124); על ידי PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, לפרש SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), ממומן על ידי מס תיירות בת קיימא של האיים הבלאריים; על ידי Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); על ידי תוכנית הפוסט-דוקטורט FOLIUM (FOLIUM 17/01) בתוך FUTURMed, ממומנת ב -50% על ידי מס התיירות בת קיימא של האיים הבלאריים וב -50% על ידי ESF; and by the Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
1.5 מ"ל צינור צנטריפוגהSPL מדעי החייםPLC60015
1 מ"ל מזרק BD PlastipakBD303174
2-פרופנול (איזופרופנולPanreac AppliChem1.310.901.211מוכן ב-20% עם
צלחת תרביתבארותSPL מדעי החיים
אתנול אבסולוטי PharmpurScharlabET0006005Pמשמש להכנת 96% ו-75% אתנול עם מים Milli-Q
ביופסיה אגרוף עם בוכנה 3 מ"מScandidactMTP-33-32
סרום בקר  אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA7030מוכן ב-5% עם PBS
מחצית סחוסIdISBa ביובנק
צינור ריכוז 15 מ"ל Nanosep 100 kD OmegaPallMCP100C41
צינור ריכוז 500 ומיקרו; L Nanosep 100 kD OmegaPallOD003C33
כיסוי זכוכית 24 x 60 מ"מDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX בינוניBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
בלוקים משובצים של רקמת פרפיןIdISBa עמלת ביובנקעבור שירות
עמודות Exo-spin mini-HDמערכות הנחיית תאיםEX05
Feather S35 מיקרוטום להבנוצה43037
Filtropur S 0.2 ומיקרו; מסנן מזרק mSarstedt83.1826.001
Fluoroshield עם DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGהכן תמיסת מלאי לריכוז סופי של 0.1 ומיקרו; g/µ L דילול ב-PBS-0.1% BSA
ParaformaldehydeSigma-Aldrich8.18715.1000מוכן ב-4% עם PBS ומאוחסן ב-4 מעלות; C
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100xBiowestL0022
PKH26 ערכת קישור תאים פלואורסצנטיים אדומים לתיוג קרום תא כלליסיגמא-אולדריץ'MINI26PKH26 ו-Dliuent C כללו
נתרן ציטראט דיהידרטScharlabSO019911000
Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיותתרמו מדעיJ1800AMNZ
TNFואלפא;מו"פ D מערכות210-TA-005הכנת תמיסת סטוק לריכוז סופי של 0.01 ומיקרו; g/µ L מדולל ב-PBS-0.1% BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787משמש להכנת תמיסת נתרן ציטראט 0.1% טריטון-0.1% עם מים Milli-Q
XyleneScharlabXI0050005P
<חזק>ציוד
צנטריפוגה 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11
רוטור NanoSight NS300מכשיר MalvernNS300עם לייזר משובץ ב λ= 532 ננומטר ומצלמה sCMOS
Shandon Finesse 325 ידני MicrotomeThermo Scientific™
מיקרוסקופ קונפוקלי TCS-SPELeica Microsystems5200000271
) מים Milli-Q 96 PLC30096A78100101

מקורות

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029(2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סימון EVנדידת EVעיקר EVמיקרוסקופיה קונפוקליתEV מליזט טבקיותמעקב אחרי ננו-חלקיקיםמודל In Vitro של OAעיקר של כונדרוציטים
תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.