Method Article

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

DOI:

10.3791/62783

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אכינוקוקוזיס ציסטי או מחלה הידאטית היא אחת המחלות הטפיליות הזואונוטיות החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה הניצבת במעי של כלבים. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי כדי להבין את המנגנונים של פתוגנזה ובקרת מחלות ומניעתן. עם זאת, היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מעכב פרשנות ישירה של הגנטיקה התפקודית של טפילי צסטודה, כולל המינים Echinococcus . המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל של התמרת גנים לנטי-ויראליים חולפים בצורות המטא-אקסטודות והסטרוביליות של E. granulosus. פרוטוסקולקסים (PSCs) בודדו מציסטות הידאטידיות והועברו למדיה ספציפית של תרביות דו-פאזיות כדי להתפתח לתולעים סטרוביליות. התולעים עברו טרנספקציה עם נגיף לנטי מהדור השלישי שנקטף, יחד עם תאי HEK293T כבקרת תהליך התמרה. פלואורסצנציה בולטת זוהתה בתולעים הסטרובינציות במשך 24 שעות ו-48 שעות, מה שמעיד על התמרת לנטי-וירוס חולפת ב-E. granulosus. עבודה זו מציגה את הניסיון הראשון להתמרה חולפת מבוססת לנטי-וירוס בתולעים מדגימה את התוצאות המבטיחות עם השלכות פוטנציאליות במחקרים ניסיוניים על ביולוגיה של תולעים שטוחות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אכינוקוקוזיס ציסטי (CE) היא אחת ממחלות הלמינת החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה בתוך המשפחה Taeniidae 1,2. נערכו מחקרים נרחבים על פיתוח אימונו-דיאגנוסטי וחיסונים עבור E. granulosus. עם זאת, ידע לקוי על הבסיס המולקולרי של הביולוגיה של הטפילים מציב מגבלות משמעותיות באבחון, ניהול ומניעה של מחלה היידטית 3,4,5,6.

בשנים האחרונות, בשל פיתוח שיטות ריצוף גנום ותעתיק, נערכו מגוון רחב של מחקרים מולקולריים על תולעים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי והוועדה לבחינת אתיקה מחקרית, מס '958680. Lentiviruses מסווגים כאורגניזמים BSL-2; לפיכך, כל נהלי תרבית המעבדה בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות שיטות מעבדה סטריליות ונערכו תחת מכסה מנוע זרימה למינרי על פי הנחיות NIH. איור 1 מדגים הצגה סכמטית של פרוטוקול המחקר עבור שלבי E. granulosus השונים.

1. איסוף ציסטות הידאטיות

  1. אספו ציסטות כבדות מכבשים נגועות באופן טבעי שנשחטו באופן שגרתי באבטואר.
  2. לעקר לחלוטין את משטח הציסטה באמצעות גזה סטרילית ו-70% אלכוהול לפני שאיפת הפרוטוסקולקים (PSCs).
  3. לשאוף 20-50 מ"ל של נוזל hydatid החוצ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה ארעית מהירה ויעילה ב- E. granulosus על ידי שימוש בווקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי. תרבנו PSCs במדיום תרבית דו-פאזית כדי להשיג תולעים סטרוביליות, כפי שתואר קודם לכן25,26. פרוטוסקולקים מתפתחים לתולעים סטרוביליות לאחר 6 שבועות במבחנה. שלבים שונים של E. granulosus נצפו במדיום התרבית הדו-פאזית, כולל PSCs מבודדים (איור 2A), PSCs שהתאדו (איור 2B) ותולע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת הבסיס המולקולרי של נמטודות וביולוגיה של פלטיהלמינתס חיונית להבנת הפתוגניות של טפילים זואונוטיים27. היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מהווה מכשול מרכזי לפרשנות ישירה של גנטיקה פונקציונלית של טפילי צסטודה, כולל מיני אכינוקוק 12,27. המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל המצוין של נגיף לנטי בהתמרה ארעית E. granulosus.

התמרה לנטי-ויראלית משלבת את פשטות השימוש והמהירות של התמרה חולפת עם ביטוי חזק של קווי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי ועדת מענקי חוקרי העילית תחת פרס מספר 958680 מטעם המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי (NIMAD), טהראן, איראן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחות תרבית 12 בארותSPL Life Sciences30012
25 ס"מ2 בקבוק תרביתSPL מדעי החיים70325
צלחות תרבית 6 בארותSPL מדעי החיים30006
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'C4901-500Gריכוז עבודה: 2.5  mM
CMRL 1066 בינוניתרמו פישר מדעי11530037
CO2 אינקובטורממרטICO150
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
מרהמבודד מכלב שעבר המתת חסד ומעוקר על ידי 0.2 μ מסנן מזרק
m Eosin YSigma-AldrichE4009-5Gמכינים 0.1% מ-Eosin לבדיקת אי הכללת עבודה
סרום בקר עוברי (FBS)DNAbiotechDB9723-100mlהשבתת חום  של  FBS (30 דקות ב-40 מעלות; ג)
סרום עגל עוברי (FCS)DNAbiotechDB9724-100 מ"להשבתת חום  של  FCS (30 דקות ב-40 מעלות; C)
HEK293T תאיםBONbiotechBN_0012.1.14כליה עוברית אנושית 293T
HEPES תמיסת מלח חוצצת (HBS)סיגמא-אולדריץ'51558-50 מ"ל2x תרכיז
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךOLYMPUSIX51
פניציליןסיגמא-אולדריץ'P3032-10MUריכוז עבודה: 100 IU/mL
פפסיןרוש10108057001ריכוז עבודה: 2 מ"ג/מ"ל, pH 2
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)DNAbiotechDB0011מגיב זה נפתר תוך פחות מדקה אחת ב-D.W
Polybrene (מגיב טרנספקציה)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI בינוניBioIdeaBI-1006-05
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'S9137-25Gריכוז עבודה: 100 μ g/mL
דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBIוקטור העברה (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן)
דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pLPI ו-pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00וקטור מסייע (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן)
דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pMD2G)AddgenePlasmid 12259וקטור מסייע (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן)
Tris/EDTA Buffer (TE)DNAbiotechDB9713-100 מ"ל
טריפסיןסיגמא-אולדריץ'T9935-50MG1x פתרונות עבודה (pH 7.4– 7.6)
של כלב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Echinococcus GranulosusTransient TransductionLentiviral VectorsStrobilated WormsHydatid DiseaseProtoscoleces IsolationBiphasic CultureGene TransferFluorescence MicroscopyTapeworm Genetics

Related Articles