מאמר שיטה

התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס

DOI:

10.3791/62783

⸱

16 בספטמבר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אכינוקוקוזיס ציסטי או מחלה הידאטית היא אחת המחלות הטפיליות הזואונוטיות החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה הניצבת במעי של כלבים. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי כדי להבין את המנגנונים של פתוגנזה ובקרת מחלות ומניעתן. עם זאת, היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מעכב פרשנות ישירה של הגנטיקה התפקודית של טפילי צסטודה, כולל המינים Echinococcus . המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל של התמרת גנים לנטי-ויראליים חולפים בצורות המטא-אקסטודות והסטרוביליות של E. granulosus. פרוטוסקולקסים (PSCs) בודדו מציסטות הידאטידיות והועברו למדיה ספציפית של תרביות דו-פאזיות כדי להתפתח לתולעים סטרוביליות. התולעים עברו טרנספקציה עם נגיף לנטי מהדור השלישי שנקטף, יחד עם תאי HEK293T כבקרת תהליך התמרה. פלואורסצנציה בולטת זוהתה בתולעים הסטרובינציות במשך 24 שעות ו-48 שעות, מה שמעיד על התמרת לנטי-וירוס חולפת ב-E. granulosus. עבודה זו מציגה את הניסיון הראשון להתמרה חולפת מבוססת לנטי-וירוס בתולעים מדגימה את התוצאות המבטיחות עם השלכות פוטנציאליות במחקרים ניסיוניים על ביולוגיה של תולעים שטוחות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אכינוקוקוזיס ציסטי (CE) היא אחת ממחלות הלמינת החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה בתוך המשפחה Taeniidae 1,2. נערכו מחקרים נרחבים על פיתוח אימונו-דיאגנוסטי וחיסונים עבור E. granulosus. עם זאת, ידע לקוי על הבסיס המולקולרי של הביולוגיה של הטפילים מציב מגבלות משמעותיות באבחון, ניהול ומניעה של מחלה היידטית 3,4,5,6.

בשנים האחרונות, בשל פיתוח שיטות ריצוף גנום ותעתיק, נערכו מגוון רחב של מחקרים מולקולריים על תולעים שטוחות על ידי מספר קבוצות מחקר 7,8,9. עם זאת, בעולם הטפילים, ההתקדמות בטכנולוגיית העברת הגנים בתולעים שטוחות טפיליות עדיין מוגבלת בהשוואה לשיטות ההתמרה הארעיות הניתנות לשחזור שפותחו עבור פרוטוזואה מסוימת 10,11,12.

השימוש במערכות לידה ויראליות התגלה ככלי חיוני להעברת טרנסגנים ולחקירות גנים/חלבונים בשני העשורים האחרונים13. נגיף הלנטי מדביק גם תאים מתחלקים וגם תאים שאינם מתחלקים, ובכך מאפשר להדביק תאים פוסט-מיטוטיים 14,15,16. עדויות עדכניות מצביעות על כך ששימוש במערכת התמרה מבוססת לנטי-וירוס בתאי יונקים מציע את הפוטנציאל להתגבר על רוב המגבלות של טכניקות קודמות של דפיקה/הפלה. התכנון והבנייה של וקטורים לנטי-ויראליים של ביטוי עם סמנים מולקולריים מתאימים, כגון ביטוי GFP, תוארו בעבר16. לכן, אנו מעריכים התמרה חולפת לנטי-ויראלית של גן מדווח GFP בפרוטוסקולקסים ובתולעים הסטרובילות של E. granulosus.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי והוועדה לבחינת אתיקה מחקרית, מס '958680. Lentiviruses מסווגים כאורגניזמים BSL-2; לפיכך, כל נהלי תרבית המעבדה בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות שיטות מעבדה סטריליות ונערכו תחת מכסה מנוע זרימה למינרי על פי הנחיות NIH. איור 1 מדגים הצגה סכמטית של פרוטוקול המחקר עבור שלבי E. granulosus השונים.

1. איסוף ציסטות הידאטיות

  1. אספו ציסטות כבדות מכבשים נגועות באופן טבעי שנשחטו באופן שגרתי באבטואר.
  2. לעקר לחלוטין את משטח הציסטה באמצעות גזה סטרילית ו-70% אלכוהול לפני שאיפת הפרוטוסקולקים (PSCs).
  3. לשאוף 20-50 מ"ל של נוזל hydatid החוצה לתוך צינורות חרוטיים סטריליים 50 מ"ל.
  4. לאחר הניקוז, מכתימים את הציסטה עם להב חד, מעבירים את שכבת הנביט לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל, ומנערים אותה לתקופה קצרה (כ-2 דקות) כדי להגדיל את אוסף ה-PSCs. מעבירים את שכבת הנביט לצינור חדש של 1.5 מ"ל לאפיון מולקולרי.
  5. שטפו את ה-PSCs פי 3-5 עם מי מלח עם מאגר פוספט (PBS).
  6. שימו לב ל-PSC ב-0.1% eosin במשך 5 דקות כדי לקבוע את כדאיות ה-PSC תחת מיקרוסקופ אור. השתמש בתשדירי שירות עם לפחות 95% כדאיות לתרבות.
  7. טפלו בזרז PSC עם 2 מ"ל של פפסין (2 מ"ג/מ"ל, pH 2) למשך 15-20 דקות.
  8. כדי לבודד PSCs בודדים, החיזרו את משקעי ה-PSC ב-PBS והעבירו אותו דרך שתי שכבות של גזה סטרילית לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל.
    הערה: חשב את הממוצע של שלוש ספירות על 50 μL של משקעי PSC באמצעות מיקרוסקופ אור. עבור ניסויים מאוחרים יותר, השתמש בערך המשוער כדי לקבוע PSCs/μL. יש לאפיין כל ציסטה מבודדת הידאטיד על סמך פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בשיטות מולקולריות, כגון ריצוף PCR17 או ניתוח עקומת התכה ברזולוציה גבוהה18.

2. טיפוח דו-פאזי של PSCs של E. granulosus כדי להשיג תולעים בוגרות

הערה: PSCs מבודדים צריכים להיות מתורבתים בתנאים סטריליים תחת ארון זרימה למינרי מחלקה II. הכן את השלבים המוצקים והנוזליים של מדיום התרבית הדו-פאזית בנפרד לפני שתמשיך לשלבים הבאים19.

  1. הכינו את מדיום התרבות הדו-פאזית כך שיכלול שני שלבים.
    1. עבור השלב המוצק, להוסיף 10 מ"ל של סרום בקר לבקבוקון 25 מ"ל ולהשאיר אותו coagulate ב 76 °C (76 °C ) למשך 20-30 דקות.
    2. עבור השלב הנוזלי (CMRL שעבר שינוי), יש לערבב 100 מ"ל של סרום עגל עוברי מומת בחום (FCS), 36 מ"ל של 5% תמצית שמרים, 5.6 מ"ל של 30% גלוקוז (במים מזוקקים), 1.4 מ"ל של 5% מרה לכלבים ב-PBS, 20 mM HEPES buffer ו-10 mM NaHCO3 ב-260 מ"ל של CMRL-1066 בינוני. לבסוף, יש להוסיף לתערובת פניצילין (100 יחב"ל/מ"ל) וסטרפטומיצין (100 מ"ג/מ"ל).
  2. הוסיפו 10 מ"ל של מדיום הפאזה הנוזלית לכל בקבוקון תרביתבגודל 25 ס"מ 25 ס"מ.
  3. הוסיפו כ-5,000 PSCs לבקבוקון התרבית והעבירו את הבקבוקון לחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  4. לאחר 24-48 שעות, מעבירים את ה-PSCs לבקבוקון חדש עם הפאזה המוצקה (סרום בקר) ומוסיפים 1 מ"ל של אותו מדיום פאזה נוזלית טרייה לכל בקבוקון. העבר את הצלוחיות לחממת CO2 (37 °C , 5% CO2).
  5. כל 5-7 ימים, החליפו את המדיום במדיום פאזה נוזלית טרייה בהתבסס על שינויים בצבע מדיום התרבית והשיעור המשוער של PSCs מובחנים.
    הערה: פרוטוסקולקים מגיבים במהירות לשינויים סביבתיים לאחר שעברו תרבית, ורובם עוברים התמיינות תוך 2-3 שבועות. בשל צריכת החומרים המזינים והצמיחה וההתפתחות של פרוטוסקולקים, ה- pH של מדיום התרבית משתנה, וצבעו משתנה לכיוון כתום וצהוב.

3. טיפוח מונופאזי של PSCs של E. granulosus

  1. ודא כי טיפוח מונופאזי נעשה 24-48 שעות לפני ההעתקה.
    1. תרבית כ-5,000 PSCs בבקבוקון תרבית בגודל25 ס"מ עם RPMI ו-10% סרום בקר עוברי (FBS).
    2. מעבירים את הצלוחיות לחממת CO2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עד לשימוש.

4. תרבית תאים לייצור והכנה של וירוסים

הערה: תאי כליה עובריים אנושיים 293T (HEK293T) התקבלו לייצור וקטורים מהמרכז לחקר פתולוגיה ותאי גזע, אוניברסיטת קרמן למדעי הרפואה.

  1. העבר 5 × 105 תאי HEK293Tלבקבוק בגודל 25 ס"מ המכיל 5 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
  2. דגירה של תאי HEK293T בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2 והעברו אותם במדיום התרבית השלם כל 48 שעות. לבסוף, השתמש בתאי HEK293T בעלי מעבר נמוך עבור התמרה20.

5. ייצור והכנה של הנגיף עם וקטורים לנטיוויראליים מהדור השלישי

הערה: וקטור lentivirus pCDH513b (וקטור העברה) ו- PLPII, PLPI ו- PMD2G (וקטורים עוזרים) שימשו לביטוי הגן של כתב GFP. ראה טבלת החומרים ואיור משלים S1.

  1. יום 1:
    1. לאחר התנסות בתאי HEK293T21 בצלחות תרבית של 6 בארות, זרע 7 × 104 תאים לכל באר עם DMEM טרי ללא אנטיביוטיקה המכיל 10% FBS.
    2. השתמש בתאים ב-50%-60% מפגש להתמרה בשיטת סידן פוספט.
  2. יום 2:
    1. החליפו את מדיום תרביות התאים 2-3 שעות לפני הניסוי ב-DMEM טרי ללא אנטיביוטיקה המכיל 2% FBS.
    2. בצינור של 1.5 מ"ל, ערבבו את הדור השלישי של הפלסמידים הלנטי-ויראליים, כולל 7 מיקרוגרם/μL pCDH513b (וקטור העברה), 4 מיקרוגרם/μL PLPII, 4 מיקרוגרם/μL PLPI ו-2 מיקרוגרם/μL PMD2G (וקטורים עוזרים).
    3. הוסף מאגר HEPES (0.28 M NaCl, 0.05 M HEPES ו- 1.5 mM Na2HPO4; טווח pH אופטימלי, 7.00-7.28) לתערובת לנפח של 422 μL.
    4. הוסיפו לתערובת 16 μL של מאגר Tris-EDTA (TE) של 1%.
    5. מוסיפים 62 μL של 2.5 mM סידן כלורי לצינורות ומערבבים היטב.
    6. הוסיפו לתערובת 500 μL של 2x מי מלח עם חציצה של HEPES (HBS), טיפה אחר טיפה, תוך 1-2 דקות באמצעות פיפטת פסטר. מערבבים בעדינות עד לקבלת תמיסה אטומה למחצה, ודוגרים את התערובת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. מוסיפים את התערובת לכל צלחת באיטיות ומפיצים אותה בתנועות מעגליות איטיות.
    8. דגירו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 של 5% והחליפו את המדיום לאחר 4-6 שעות ב-DMEM ללא אנטיביוטיקה המכיל 10% FBS.
  3. יום 3:
    1. אשרו התמרה חולפת מוצלחת ואת יכולת הכדאיות של התא באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
  4. יום 4:
    1. קוצרים וירוסים ממדיום התרבית על ידי איסוף הסופרנאטנט של כל באר ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -70 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: ניתן היה לרכז את נגיפי הלנטי-וירוסים שנקטפו ולצמצם אותם לצורך טרנספקציה מדויקת22.

6. התמרה חולפת של שלבים שונים של E. granulosus עם הנגיף

  1. יום 1:
    1. השתמשו בצלחת תרבית של 12 בארות להעברת גנים. תרבית 5 × 103-5 × 104 תאי HEK293T במשולש, עם מדיום DMEM שלם כהתייחסות הפנימית.
    2. תרבות 150 PSCs טריים במשולש ב- RPMI ו- 10% FBS.
    3. תרבית 30 תולעים טרובילציה במשולש ב-DMEM המכילה 10% FBS מומת חום.
      הערה: כל אמצעי ההעתקה חייב להיות ללא אנטיביוטיקה. שמור שלוש בארות בקרה שאינן מטופלות עבור תאי HEK293T, PSCs ותולעים סטרוביליות בתהליך.
    4. הכינו תערובת של 1 ×-106 וירוסים עם ריאגנט טרנספקציה של 4 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת החומרים) כדי להתמר את תאי HEK293T ואת השלבים השונים של התולעת.
    5. מוסיפים את התערובת לכל צלחת באיטיות ומפיצים אותה בתנועות מעגליות איטיות. דגירה של הצלחות במשך 4-6 שעות בחממת CO2 (37 °C (37 °C (37 °C), 5% CO2). החלף את המדיום עבור כל דגימה באותו מדיום תרבית שלם כדי למזער את ההשפעות הרעילות של מגיב הטרנספקציה.
  2. יום 2:
    1. חזור על שלבים 6.1.4-6.1.5 כדי להגביר את היעילות של התמרה חולפת עבור תאי HEK293T, PSCs ותולעים סטרוביטיביות.
    2. דגירה של כל הלוחות למשך 24-48 שעות בחממת CO2 עם אותם תנאי תרבית המבוססים על סוג המדיה התאית.
  3. יום 3:
    1. בדוק אם ההעתקה מצליחה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
      הערה: שקול להשתמש במבחנים מאשרים נוספים כמו PCR/qPCR20,23 או טכניקות כתםמערביות 24 בהליך העברת הגנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה ארעית מהירה ויעילה ב- E. granulosus על ידי שימוש בווקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי. תרבנו PSCs במדיום תרבית דו-פאזית כדי להשיג תולעים סטרוביליות, כפי שתואר קודם לכן25,26. פרוטוסקולקים מתפתחים לתולעים סטרוביליות לאחר 6 שבועות במבחנה. שלבים שונים של E. granulosus נצפו במדיום התרבית הדו-פאזית, כולל PSCs מבודדים (איור 2A), PSCs שהתאדו (איור 2B) ותולע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת הבסיס המולקולרי של נמטודות וביולוגיה של פלטיהלמינתס חיונית להבנת הפתוגניות של טפילים זואונוטיים27. היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מהווה מכשול מרכזי לפרשנות ישירה של גנטיקה פונקציונלית של טפילי צסטודה, כולל מיני אכינוקוק 12,27. המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל המצוין של נגיף לנטי בהתמרה ארעית E. granulosus.

התמרה לנטי-ויראלית משלבת את פשטות השימוש והמהירות של התמרה חולפת עם ביטוי חזק של קווי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי ועדת מענקי חוקרי העילית תחת פרס מספר 958680 מטעם המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי (NIMAD), טהראן, איראן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות תרבית 12 בארותSPL Life Sciences30012
25 ס"מ2 בקבוק תרביתSPL מדעי החיים70325
צלחות תרבית 6 בארותSPL מדעי החיים30006
סידן כלוריסיגמא-אולדריץ'C4901-500Gריכוז עבודה: 2.5  mM
CMRL 1066 בינוניתרמו פישר מדעי11530037
CO2 אינקובטורממרטICO150
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
מרהמבודד מכלב שעבר המתת חסד ומעוקר על ידי 0.2 μ מסנן מזרק
m Eosin YSigma-AldrichE4009-5Gמכינים 0.1% מ-Eosin לבדיקת אי הכללת עבודה
סרום בקר עוברי (FBS)DNAbiotechDB9723-100mlהשבתת חום  של  FBS (30 דקות ב-40 מעלות; ג)
סרום עגל עוברי (FCS)DNAbiotechDB9724-100 מ"להשבתת חום  של  FCS (30 דקות ב-40 מעלות; C)
HEK293T תאיםBONbiotechBN_0012.1.14כליה עוברית אנושית 293T
HEPES תמיסת מלח חוצצת (HBS)סיגמא-אולדריץ'51558-50 מ"ל2x תרכיז
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךOLYMPUSIX51
פניציליןסיגמא-אולדריץ'P3032-10MUריכוז עבודה: 100 IU/mL
פפסיןרוש10108057001ריכוז עבודה: 2 מ"ג/מ"ל, pH 2
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)DNAbiotechDB0011מגיב זה נפתר תוך פחות מדקה אחת ב-D.W
Polybrene (מגיב טרנספקציה)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI בינוניBioIdeaBI-1006-05
נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KG
סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'S9137-25Gריכוז עבודה: 100 μ g/mL
דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBIוקטור העברה (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן)
דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pLPI ו-pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00וקטור מסייע (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן)
דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pMD2G)AddgenePlasmid 12259וקטור מסייע (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן)
Tris/EDTA Buffer (TE)DNAbiotechDB9713-100 מ"ל
טריפסיןסיגמא-אולדריץ'T9935-50MG1x פתרונות עבודה (pH 7.4– 7.6)
של כלב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. Clinical Microbiology Reviews. 34 (3), 0029020(2021).
  3. Eckert, J., Thompson, R. C. A. Historical aspects of echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 1-64 (2017).
  4. Romig, T., et al. Ecology and life cycle patterns of Echinococcus species. Advances in Parasitology. 95, 213(2017).
  5. Craig, P. S., Hegglin, D., Lightowlers, M. W., Torgerson, P. R., Wang, Q. Echinococcosis: control and prevention. Advances in Parasitology. 95, 55(2016).
  6. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95 (1), 315(2017).
  7. Tsai, I. I. J., et al. The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature. 496 (7443), 57-63 (2013).
  8. Koziol, U., Brehm, K. Recent advances in Echinococcus genomics and stem cell research. Veterinary Parasitology. 213 (3-4), 92-102 (2015).
  9. Zheng, H., et al. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics. 45 (10), 1168-1175 (2013).
  10. Pérez-Victoria, J. M., Torres, A. P. T. C., Gamarro, F., Castanys, S. ABC transporters in the protozoan parasite Leishmania. International Microbiology. 4 (3), 159-166 (2001).
  11. Ehrenkaufer, G. M., Singh, U. Transient and stable transfection in the protozoan parasite Entamoeba invadens. Molecular and Biochemical Parasitology. 184 (1), 59-62 (2012).
  12. Moguel, B., Bobes, R. J., Carrero, J. C., Laclette, J. P. Transfection of Platyhelminthes. BioMed Research International. 2015, 206161(2015).
  13. Tang, Y., Garson, K., Li, L., Vanderhyden, B. C. Optimization of lentiviral vector production using polyethylenimine-mediated transfection. Oncology Letters. 9 (1), 55-62 (2015).
  14. Mann, V. H., Suttiprapa, S., Rinaldi, G., Brindley, P. J. Establishing transgenic schistosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (8), 1230(2011).
  15. Balcaitis, S., Weinstein, J. R., Li, S., Chamberlain, J. S., Möller, T. Lentiviral transduction of microglial cells. Glia. 50 (1), 48-55 (2005).
  16. Sastry, L., Johnson, T., Hobson, M. J., Smucker, B., Cornetta, K. Titering lentiviral vectors: comparison of DNA, RNA and marker expression methods. Gene Therapy. 9 (17), 1155-1162 (2002).
  17. Bowles, J., Blair, D., McManus, D. P. Genetic variants within the genus Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. Molecular and Biochemical Parasitology. 54 (2), 165-173 (1992).
  18. Rostami, S., et al. High resolution melting technique for molecular epidemiological studies of cystic echinococcosis: differentiating G1, G3, and G6 genotypes of Echinococcus granulosus sensu lato. Parasitology Research. 112 (10), 3441-3447 (2013).
  19. Mousavi, S. M., et al. Biological and morphological consequences of dsRNA-induced suppression of tetraspanin mRNA in developmental stages of Echinococcus granulosus. Parasites and Vectors. 13 (1), 190(2020).
  20. Afgar, A., et al. MiR-339 and especially miR-766 reactivate the expression of tumor suppressor genes in colorectal cancer cell lines through DNA methyltransferase 3B gene inhibition. Cancer Biology & Therapy. 17 (11), 1126-1138 (2016).
  21. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (16), e755(2008).
  22. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (32), e1499(2009).
  23. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e4031(2012).
  24. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  25. Dezaki, E. S., et al. Comparison of ex vivo harvested and in vitro cultured materials from Echinococcus granulosus by measuring expression levels of five genes putatively involved in the development and maturation of adult worms. Parasitology Research. 115 (11), 4405-4416 (2016).
  26. Mousavi, S. M., et al. Calmodulin-specific small interfering RNA induces consistent expression suppression and morphological changes in Echinococcus granulosus. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  27. Aboobaker, A. A., Blaxter, M. L. Functional genomics for parasitic nematodes and platyhelminths. Trends in Parasitology. 20 (4), 178-184 (2004).
  28. Elegheert, J., et al. Lentiviral transduction of mammalian cells for fast, scalable and high-level production of soluble and membrane proteins. Nature Protocols. 13 (12), 2991(2018).
  29. Mizukami, C., et al. Gene silencing in Echinococcus multilocularis protoscoleces using RNA interference. Parasitology International. 59 (4), 647-652 (2010).
  30. Thompson, R. C. A., Jenkins, D. J. Echinococcus as a model system: biology and epidemiology. International Journal for Parasitology. 44 (12), 865-877 (2014).
  31. Thompson, R. C. A. Biology and systematics of Echinococcus. Advances in Parasitology. Thompson, R. C. A., Deplazes, P., Lymbery, A. J. 95, 65-109 (2017).
  32. Brehm, K., Koziol, U. Echinococcus-host interactions at cellular and molecular levels. Advances in Parasitology. 95, 147-212 (2017).
  33. Moguel, B., et al. Transient transgenesis of the tapeworm Taenia crassiceps. SpringerPlus. 4, 496(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים