אנו מתארים טכניקת התמרה חולפת מהירה בשלבים התפתחותיים שונים של Echinococcus granulosus באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התמרה חולפת של הצורות הסטרוביליות של אכינוקוקוס גרנולוסוס
במאמר זה
סיכום
תקציר
אכינוקוקוזיס ציסטי או מחלה הידאטית היא אחת המחלות הטפיליות הזואונוטיות החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה הניצבת במעי של כלבים. יש צורך דחוף במחקר גנטי יישומי כדי להבין את המנגנונים של פתוגנזה ובקרת מחלות ומניעתן. עם זאת, היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מעכב פרשנות ישירה של הגנטיקה התפקודית של טפילי צסטודה, כולל המינים Echinococcus . המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל של התמרת גנים לנטי-ויראליים חולפים בצורות המטא-אקסטודות והסטרוביליות של E. granulosus. פרוטוסקולקסים (PSCs) בודדו מציסטות הידאטידיות והועברו למדיה ספציפית של תרביות דו-פאזיות כדי להתפתח לתולעים סטרוביליות. התולעים עברו טרנספקציה עם נגיף לנטי מהדור השלישי שנקטף, יחד עם תאי HEK293T כבקרת תהליך התמרה. פלואורסצנציה בולטת זוהתה בתולעים הסטרובינציות במשך 24 שעות ו-48 שעות, מה שמעיד על התמרת לנטי-וירוס חולפת ב-E. granulosus. עבודה זו מציגה את הניסיון הראשון להתמרה חולפת מבוססת לנטי-וירוס בתולעים מדגימה את התוצאות המבטיחות עם השלכות פוטנציאליות במחקרים ניסיוניים על ביולוגיה של תולעים שטוחות.
מבוא
אכינוקוקוזיס ציסטי (CE) היא אחת ממחלות הלמינת החשובות ביותר הנגרמות על ידי Echinococcus granulosus, תולעת סרט קטנה בתוך המשפחה Taeniidae 1,2. נערכו מחקרים נרחבים על פיתוח אימונו-דיאגנוסטי וחיסונים עבור E. granulosus. עם זאת, ידע לקוי על הבסיס המולקולרי של הביולוגיה של הטפילים מציב מגבלות משמעותיות באבחון, ניהול ומניעה של מחלה היידטית 3,4,5,6.
בשנים האחרונות, בשל פיתוח שיטות ריצוף גנום ותעתיק, נערכו מגוון רחב של מחקרים מולקולריים על תולעים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושר על ידי המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי והוועדה לבחינת אתיקה מחקרית, מס '958680. Lentiviruses מסווגים כאורגניזמים BSL-2; לפיכך, כל נהלי תרבית המעבדה בפרוטוקול זה בוצעו באמצעות שיטות מעבדה סטריליות ונערכו תחת מכסה מנוע זרימה למינרי על פי הנחיות NIH. איור 1 מדגים הצגה סכמטית של פרוטוקול המחקר עבור שלבי E. granulosus השונים.
1. איסוף ציסטות הידאטיות
- אספו ציסטות כבדות מכבשים נגועות באופן טבעי שנשחטו באופן שגרתי באבטואר.
- לעקר לחלוטין את משטח הציסטה באמצעות גזה סטרילית ו-70% אלכוהול לפני שאיפת הפרוטוסקולקים (PSCs).
- לשאוף 20-50 מ"ל של נוזל hydatid החוצ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן, אנו מתארים טכניקת התמרה ארעית מהירה ויעילה ב- E. granulosus על ידי שימוש בווקטורים לנטי-ויראליים מהדור השלישי. תרבנו PSCs במדיום תרבית דו-פאזית כדי להשיג תולעים סטרוביליות, כפי שתואר קודם לכן25,26. פרוטוסקולקים מתפתחים לתולעים סטרוביליות לאחר 6 שבועות במבחנה. שלבים שונים של E. granulosus נצפו במדיום התרבית הדו-פאזית, כולל PSCs מבודדים (איור 2A), PSCs שהתאדו (איור 2B) ותולע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הבנת הבסיס המולקולרי של נמטודות וביולוגיה של פלטיהלמינתס חיונית להבנת הפתוגניות של טפילים זואונוטיים27. היעדר מערכת יעילה להערכת גנים מהווה מכשול מרכזי לפרשנות ישירה של גנטיקה פונקציונלית של טפילי צסטודה, כולל מיני אכינוקוק 12,27. המחקר הנוכחי מדגים את הפוטנציאל המצוין של נגיף לנטי בהתמרה ארעית E. granulosus.
התמרה לנטי-ויראלית משלבת את פשטות השימוש והמהירות של התמרה חולפת עם ביטוי חזק של קווי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי ועדת מענקי חוקרי העילית תחת פרס מספר 958680 מטעם המכון הלאומי לפיתוח מחקר רפואי (NIMAD), טהראן, איראן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צלחות תרבית 12 בארות | SPL Life Sciences | 30012 | |
| 25 ס"מ2 בקבוק תרבית | SPL מדעי החיים | 70325 | |
| צלחות תרבית 6 בארות | SPL מדעי החיים | 30006 | |
| סידן כלורי | סיגמא-אולדריץ' | C4901-500G | ריכוז עבודה: 2.5 mM |
| CMRL 1066 בינוני | תרמו פישר מדעי | 11530037 | |
| CO2 אינקובטור | ממרט | ICO150 | |
| D-(+)-גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G8270-1KG | |
| DMEM | Life Technology | 12100046 | |
| מרה | מבודד מכלב שעבר המתת חסד ומעוקר על ידי 0.2 μ מסנן מזרק | ||
| m Eosin Y | Sigma-Aldrich | E4009-5G | מכינים 0.1% מ-Eosin לבדיקת אי הכללת עבודה |
| סרום בקר עוברי (FBS) | DNAbiotech | DB9723-100ml | השבתת חום של FBS (30 דקות ב-40 מעלות; ג) |
| סרום עגל עוברי (FCS) | DNAbiotech | DB9724-100 מ"ל | השבתת חום של FCS (30 דקות ב-40 מעלות; C) |
| HEK293T תאים | BONbiotech | BN_0012.1.14 | כליה עוברית אנושית 293T |
| HEPES תמיסת מלח חוצצת (HBS) | סיגמא-אולדריץ' | 51558-50 מ"ל | 2x תרכיז |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך | OLYMPUS | IX51 | |
| פניצילין | סיגמא-אולדריץ' | P3032-10MU | ריכוז עבודה: 100 IU/mL |
| פפסין | רוש | 10108057001 | ריכוז עבודה: 2 מ"ג/מ"ל, pH 2 |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | DNAbiotech | DB0011 | מגיב זה נפתר תוך פחות מדקה אחת ב-D.W |
| Polybrene (מגיב טרנספקציה) | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| RPMI בינוני | BioIdea | BI-1006-05 | |
| נתרן ביקרבונט (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | |
| סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ' | S9137-25G | ריכוז עבודה: 100 μ g/mL |
| דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pCDH513b) | SBI System Biosciences (BioCat GmbH) | CD513B-1-SBI | וקטור העברה (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן) |
| דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pLPI ו-pLPII) | Invitrogen (Life Technologies) | K4975-00 | וקטור מסייע (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן) |
| דור שלישי של פלסמיד לנטי-ויראלי (pMD2G) | Addgene | Plasmid 12259 | וקטור מסייע (הושג באופן מסחרי ממחלקת המחקר לרפואה מולקולרית של המרכז האקדמי האיראני לחינוך, תרבות ומחקר (ACECR), משהד, איראן) |
| Tris/EDTA Buffer (TE) | DNAbiotech | DB9713-100 מ"ל | |
| טריפסין | סיגמא-אולדריץ' | T9935-50MG | 1x פתרונות עבודה (pH 7.4– 7.6) |
מקורות
- Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
- Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
