Method Article

טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות כוללות בדרך כלל פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. יתר על כן, לשיטות גידול בתפוקה גבוהה המבוססות על מיקרו-פלטות שפותחו בשנים האחרונות יש מצב גידול מיקרוביאלי ירוד והקבלה ניסיונית בגלל החמצן המומס הנמוך שלהן, תערובת לקויה, אידוי חמור והשפעה תרמית. בשל יתרונות רבים של מיקרו-טיפות, כגון נפח קטן, תפוקה גבוהה ויכולת שליטה חזקה, הטכנולוגיה המיקרופלואידית מבוססת הטיפות יכולה להתגבר על בעיות אלה, אשר שימשה בסוגים רבים של מחקר של טיפוח מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה, סינון ואבולוציה. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים נשארים בשלב של בנייה ויישום מעבדה. כמה סוגיות מרכזיות, כגון דרישות תפעוליות גבוהות, קשיי בנייה גבוהים והיעדר טכנולוגיית אינטגרציה אוטומטית, מגבילים את היישום הרחב של טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות במחקר מיקרוביאלי. כאן, מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) פותחה בהצלחה על בסיס טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות, והשיגה שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור מקוון, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך גידול הטיפות המיקרוביאליות. בפרוטוקול זה, Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג פראי וזן E. coli חיוני למתנול (MeSV2.2) נלקחו כדוגמאות כדי להציג כיצד להשתמש ב- MMC כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ובעל תפוקה גבוהה יחסית ואבולוציה מסתגלת בפירוט. שיטה זו קלה לתפעול, צורכת פחות עבודה וריאגנטים, ויש לה תפוקה ניסיונית גבוהה ומקבילות נתונים טובות, שיש לה יתרונות גדולים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה עבור חוקרים מדעיים לביצוע מחקר מיקרוביאלי קשור.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גידול מיקרוביאלי הוא בסיס חשוב למחקר מדעי מיקרוביולוגי וליישומים תעשייתיים, הנמצא בשימוש נרחב בבידוד, זיהוי, שחזור, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים 1,2,3. שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות משתמשות בעיקר במבחנות, צלוחיות שייק ולוחות מוצקים כמיכלי גידול, בשילוב עם אינקובטורים רועדים, ספקטרופוטומטרים, קוראי מיקרו-פלטות וציוד אחר לטיפוח, גילוי וסינון מיקרוביאליים. עם זאת, לשיטות אלה יש בעיות רבות, כגון פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. שיטות הטיפוח בתפוקה גבוהה שפותחו בשנים האחרונות מבוססות בעיקר על המיקרו-לוחית. אבל למיקרו-פלטה יש רמה נמוכה של חמצן מומס, תכונת ערבוב ירודה, והתאדות חמורה והשפעה תרמית, שלעתים קרובות מובילים למצב צמיחה ירוד ולהקבלה ניסיונית של מיקרואורגניזמים 4,5,6,7; מצד שני, הוא צריך להיות מצויד בציוד יקר, כגון תחנות עבודה לטיפול בנוזל וקוראי מיקרו-פלטות, כדי להשיג טיפוח אוטומטי וזיהוי תהליכים 8,9.

כענף חשוב של הטכנולוגיה המיקרופלואידית, מיקרופלואידיקה של טיפות פותחה בשנים האחרונות על בסיס מערכות מיקרופלואידיות מסורתיות של זרימה רציפה. זוהי טכנולוגיה מיקרופלואידית של זרימה בדידה המשתמשת בשני פאזות נוזליות בלתי חדירות (בדרך כלל מי שמן) כדי ליצור מיקרו-טיפות מפוזרות ולפעול עליהן10. מכיוון שלמיקרו-טיפות יש את המאפיינים של נפח קטן, שטח פנים ספציפי גדול, קצב העברת מסה פנימי גבוה, וללא זיהום צולב הנגרם על ידי מידור, והיתרונות של שליטה חזקה ותפוקה גבוהה של טיפות, היו סוגים רבים של מחקרים המיישמים טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות בטיפוח, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים בתפוקה גבוהה11 . עם זאת, יש עדיין סדרה של בעיות מפתח כדי להפוך את הטכנולוגיה microfluidic טיפות פופולרי ויישם באופן נרחב. ראשית, פעולת המיקרופלואידיקה של טיפות היא מסורבלת ומורכבת, וכתוצאה מכך דרישות טכניות גבוהות למפעילים. שנית, טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות משלבת רכיבים אופטיים, מכניים וחשמליים וצריכה להיות קשורה לתרחישי יישום ביוטכנולוגיה. קשה למעבדה או לצוות יחיד לבנות מערכות בקרה מיקרופלואידיות טיפות יעילות אם אין שיתוף פעולה רב-תחומי. שלישית, בגלל הנפח הקטן של מיקרו-טיפות (מפיקוליטר (pL) למיקרוליטר (μL)), נדרש קושי רב כדי להבין את הבקרה האוטומטית המדויקת ואת הזיהוי המקוון בזמן אמת של טיפות עבור כמה פעולות מיקרוביאליות בסיסיות כגון תת-גידול, מיון ודגימה, וקשה גם לבנות מערכת ציוד משולבת12.

על מנת להתמודד עם הבעיות הנ"ל, פותחה בהצלחה מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) המבוססת על טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות13. ה- MMC מורכב מארבעה מודולים פונקציונליים: מודול זיהוי טיפות, מודול זיהוי ספקטרום טיפות, מודול שבב מיקרופלואידי ומודול דגימה. באמצעות אינטגרציה ובקרה של המערכת של כל המודולים, מערכת הפעלה אוטומטית כולל ייצור, טיפוח, מדידה (צפיפות אופטית (OD) ופלואורסצנציה), פיצול, היתוך, מיון של טיפות נקבע במדויק, השגת שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך של טיפוח טיפות מיקרוביאליות. MMC יכול להכיל עד 200 יחידות גידול טיפות משוכפלות של נפח 2-3 μL, אשר שווה ערך ל -200 יחידות גידול של בקבוק שייק. מערכת גידול המיקרו-טיפות יכולה לספק את הדרישות של אי-זיהום, חמצן מומס, ערבוב והחלפת אנרגיה-מסה במהלך צמיחתם של מיקרואורגניזמים, ולענות על הצרכים השונים של מחקר מיקרוביאלי באמצעות פונקציות משולבות מרובות, למשל, מדידת עקומת גדילה, אבולוציה אדפטיבית, ניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד, ומחקר וניתוח מטבוליטים (המבוססים על זיהוי פלואורסצנציה)13,14.

כאן, הפרוטוקול מציג כיצד להשתמש ב-MMC כדי לבצע טיפוח אוטומטי ומיקרוביאלי ואבולוציה אדפטיבית בפירוט (איור 1). לקחנו את Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג בר כדוגמה כדי להדגים את מדידת עקומת הגדילה ואת זן E. coli החיוני למתנול MeSV2.215 כדי להדגים את האבולוציה ההסתגלותית ב-MMC. פותחה תוכנת הפעלה עבור MMC, מה שהופך את הפעולה לפשוטה וברורה מאוד. בכל התהליך, המשתמש צריך להכין את פתרון החיידקים הראשוני, להגדיר את התנאים של MMC, ולאחר מכן להזריק את תמיסת החיידקים ואת הריאגנטים הקשורים לתוך MMC. לאחר מכן, ה-MMC יבצע באופן אוטומטי פעולות כגון יצירת טיפות, זיהוי ומספור, טיפוח ואבולוציה אדפטיבית. הוא גם יבצע זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה) של הטיפות ברזולוציית זמן גבוהה ויציג את הנתונים הקשורים (אותם ניתן לייצא) בתוכנה. המפעיל יכול לעצור את תהליך הטיפוח בכל עת על פי התוצאות ולחלץ את טיפות המטרה לניסויים הבאים. ה- MMC קל לתפעול, צורך פחות עבודה וריאגנטים, ויש לו תפוקה ניסיונית גבוהה יחסית ומקבילות נתונים טובות, שיש להן יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול וחזקה לחוקרים לביצוע מחקרים מיקרוביאליים קשורים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התקנת מכשירים ותוכנה

  1. בחרו בסביבה נקייה וסטרילית (כגון ספסל נקי) כחלל קבוע ייעודי ל-MMC. התקן את ה- MMC בהתמדה בחלל.
    הערה: הרחיקו את ה-MMC מהפרעה של שדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום חזקים. הימנע מרטט חמור מלהשפיע על רכיבי הגילוי האופטיים. ספק את ספק הכוח של AC220 V, 50 HZ ל- MMC. לפרטים על MMC עיין בטבלת החומרים ובאתר האינטרנט של MMC16.
  2. התקן את תוכנת הפעולה מקובץ MMC.zip
    הערה: צור קשר עם המחברים עבור הקובץ .zip MMC.
    1. צור תיקיה ייעודית ושמור בה את קובץ ה- zip.
    2. צור תיקיה ייעודית נוספת כ"ספריית ההתקנה ". פתח את ה- MMC.zip ושמור את הקבצים בתיקיה החדשה.
      הערה: תצורת המחשב היא הטובה ביותר לעמידה: (1) מערכת ההפעלה Windows 7 64 סיביות ומעלה; (2) מעבד: i5 ומעלה; (3) זיכרון: 4 ג'יגה-בתים ומעלה; (4) דיסק קשיח: 300 ג'יגה-בתים ומעלה (מהירות סיבוב העולה על 7,200 סל"ד או דיסק במצב מוצק).

2. הכנות

  1. חברו את מחט המזרק (הקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ), מחבר מהיר A ובקבוק ריאגנט (איור 2C), והצמידו אותם אוטומטית ל-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: פתח מעט את הפקק של בקבוק המגיבים במהלך העיקור. ניתן להכין עוד כמה בקבוקי ריאגנטים בכל פעם לשימוש.
  2. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) כדי לסנן שמן MMC. מכניסים מראש את השבב המיקרופלואידי (איור 2B) ואת שמן ה-MMC לספסל הנקי ומעקרים אותם על ידי הקרנה אולטרה סגולה למשך 30 דקות לפני השימוש.
    הערה: לפרטים של מחבר מהיר A, בקבוק מגיב, שמן MMC ושבב מיקרופלואידי מתייחסים לטבלת החומרים.
  3. התקנת השבב המיקרופלואידי
    1. פתחו את דלת תא הפעולה (איור 2A) והרימו את בדיקת הסיבים האופטיים.
    2. יישרו את חורי השדה החשמלי עם מחטי השדה החשמלי והניחו בעדינות את השבב על מעמד השבב. לאחר מכן הכנס את שתי עמודות המיקום לתוך חורי המיקום והניח את בדיקת הסיבים האופטיים (איור 2D).
    3. חבר את המחבר המהיר A על השבב ליציאה המתאימה של MMC בהתאם למספר המיקום (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
  4. יש לחדש את שמן ה-MMC (לכ-80 מ"ל) בבקבוק השמן ולרוקן את נוזל הפסולת בבקבוק הפסולת לפני השימוש.
    הערה: נוזל הפסולת הוא בדרך כלל פסולת אורגנית. יש לעיין בחוקים וברגולציה האזוריים בעת הסילוק, בכפוף לשינויים המבוססים על מערך ניסיוני.

3. מדידת עקומת גדילה ב-MMC

  1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
    1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות להכנת לוריא-ברטאני (LB) בינוני ואוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: רכיבים של מדיום LB: NaCl (10 גרם/ליטר), תמצית שמרים (5 גרם/ל') וטריפטון (10 גרם/ל' ).
    2. מוציאים את זן E. coli MG1655 ממלאי הגליצרול ומטפחים אותו בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל בינוני של LB באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 שעות.
      הערה: זמן הטיפוח תלוי בזנים הספציפיים. זה אופטימלי לטפח את הזן לתקופה / שלב לוגריתמי.
    3. דיללו את תמיסת E. coli MG1655 בתרבית עם מדיום טרי ל-OD600 של 0.05-0.1 כדי לקבל תמיסת חיידקים ראשונית (הכינו כ-10 מ"ל).
  2. לחץ על אתחול כדי לאתחל את MMC. לאחר הופעת ממשק האתחול, הגדר את טמפרטורת הטיפוח כ- 37 °C ואת ערך האות הפוטואלקטרי כ- 0.6 (איור 3A). האתחול ייקח כ-20 דקות.
  3. הפעל את מנורת ה- UV (אורך גל 254 ננומטר) במהלך האתחול.
  4. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית ושמן MMC לבקבוק הריאגנטים.
    1. מוציאים בקבוק ריאגנט מעוקר על הספסל הנקי ומהדקים את הפקק.
    2. השתמש במזרק סטרילי 10 מ"ל כדי להזריק 3-5 מ"ל של שמן MMC ממחט המזרק של הצינור הצדדי. הטו וסובבו את בקבוק הריאגנטים באיטיות כדי לגרום לשמן לחדור באופן מלא לדופן הפנימית.
    3. להזריק כ 5 מ"ל של תמיסת חיידקים ראשונית, ולאחר מכן למלא את בקבוק המגיב על ידי הזרקת 5-7 מ"ל של השמן שוב.
    4. שלפו את המחבר המהיר העצמאי A, והכניסו את המחבר המהיר A של בקבוק המגיב למחבר המהיר B כדי להשלים את פעולת הזרקת הדגימה (איור 4A).
  5. המתן עד שהאתחול יסתיים ולאחר מכן כבה את מנורת ה- UV (אורך גל של 254 ננומטר).
  6. פתח את דלת תא הניתוח, והכניס את בקבוק המגיבים לאמבטיית המתכת.
  7. שלף את מחבר C2 של השבב ואת המחבר המהיר A של בקבוק המגיב. חבר את מחבר הצינור הצדדי של בקבוק המגיב למחבר C2 ואת מחבר הצינור העליון למחבר O2. לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
  8. לחץ על עקומת גדילה כדי לבחור את הפונקציה של מדידת עקומת גדילה (איור 3A). בממשק הגדרת הפרמטרים, הזן את המספר כ- 15, הפעל את מתג זיהוי ה- OD והגדר את אורך הגל כ- 600 ננומטר. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 10 דקות.
    הערה: כאן, מספר מתייחס למספר הטיפות שיש ליצור. אורך גל מתייחס לאורך הגל של ה-OD שיש לזהותו. הגדר את המספר (מקסימום 200) ואת אורך הגל (350-800 ננומטר) בהתאם לדרישות הניסוי.
  9. כאשר חלון קופץ מופיע בממשק הראשי המבקש "הסר את בקבוק המגיבים בין C2 ל- O2, לחץ על לחצן אישור לאחר השלמתו", פתח את דלת תא הפעולה כדי להוציא את בקבוק המגיב ולחבר את מחברי C2 ו- O2.
  10. סגור את הדלת ולחץ על הלחצן אישור בחלון הקופץ כדי לטפח באופן אוטומטי את הטיפות ולזהות את ערכי ה- OD.
    הערה: ה- MMC מזהה את ערך ה- OD כאשר הטיפה עוברת את בדיקת הסיבים האופטיים. לכן, תקופת הגילוי תלויה במספר הטיפות שנוצרו.
  11. כאשר עקומת הגדילה מגיעה לשלב הנייח, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD. בחר את נתיב שמירת הנתונים וייצא את ערך ה- OD שנרשם במהלך תקופת הטיפוח בתבנית .csv, אשר ניתן לפתוח על-ידי תוכנה מתאימה (לדוגמה, Microsoft Excel). לאחר מכן השתמש בתוכנת מיפוי (לדוגמה, EXCEL ו- Origin 9.0) כדי להתוות את עקומת הגדילה.
    הערה: במהלך תהליך הטיפוח, ניתן ללחוץ על ייצוא הנתונים בכל עת כדי לייצא את נתוני OD של כל הטיפות הנוכחיות.

4. אבולוציה אדפטיבית ב-MMC

  1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
    1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי להכין את התווך הנוזלי המיוחד ואת הלוחות המוצקים עבור MeSV2.2 ואת autoclave ב 121 °C (74 °F) למשך 15 דקות.
      הערה: עבור הרכיבים של המדיום המיוחד עיין בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
    2. טפחו את MeSV2.2 באמצעות הלוח המוצק (קוטר = 90 מ"מ) באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר מכן בחרו מושבה עצמאית וטפחו אותה בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של המדיום הנוזלי המיוחד באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
    3. דיללו את תמיסת MeSV2.2 המתורבתת עם המדיום ל-OD600 של 0.1-0.2 (ודא שהנפח הכולל אינו פחות מ-10 מ"ל) והמשיכו לטפח אותה בבקבוק השייק במשך 5 שעות כדי להשיג את תמיסת החיידקים הראשונית.
      הערה: MeSV2.2 הוא זן E. coli חיוני למתנול. המדיום הנוזלי המיוחד מכיל 500 מילימול/ל' מתנול, המהווה עקה חזקה עבור MeSV2.2, וכתוצאה מכך צמיחה איטית מאוד. שימו לב שהשגת תמיסת החיידקים הראשונית כאן שונה מזו המתוארת בשלב 3.1.
  2. אתחל את ה-MMC כמוסבר בשלבים 3.2, 3.3 ו-3.5.
  3. מוציאים שני בקבוקי ריאגנט מעוקרים, שאחד מהם מיועד לתמיסת החיידקים הראשונית והשני מיועד למדיום הטרי. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית (5 מ"ל), מדיום טרי (12-15 מ"ל) ושמן MMC לבקבוקי הריאגנטים כפי שהוסבר בשלב 3.4.
    הערה: מכיוון שאבולוציה אדפטיבית היא תהליך ארוך טווח הכולל תת-גידולים מרובים, אחסן כמה שיותר מדיום טרי ב-MMC. לא ניתן לחדש את המדיום במהלך ריצת הניסוי.
  4. התקינו את שני בקבוקי הריאגנטים ב-MMC כפי שהוסבר בשלב 3.6. התקן את האחד עבור תמיסת החיידקים הראשונית בין מחבר C2 ו- O2 והשני עבור המדיום הטרי בין מחבר C4 ל- O4.
  5. לחצו על ALE כדי לבחור את הפונקציה של אבולוציה אדפטיבית (איור 3B). בממשק הגדרת הפרמטרים, הפעל את המתג זיהוי OD .
  6. הגדר את המספר כ- 50, אורך גל כ- 600 ננומטר, ריכוז כ - 0%, סוג כזמן, פרמטר כ- 30 שעות וחזרות כ- 99. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 25 דקות.
    הערה: כאן, "ריכוז" מתייחס לריכוז המרבי של גורמים כימיים לאבולוציה אדפטיבית. עבור טיפות שונות, ניתן לממש ב- MMC להציג ריכוזים שונים של גורמים כימיים כדי לספק תנאי גדילה שונים. חשב את הריכוזים המוצגים באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    כאן "C" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים שהוכנסו לטיפות; "a" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C4 ל- O4; "b" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C6 ל- O6; ו-"i" מתייחס לריכוז הזמין. ישנם שמונה ריכוזים זמינים ב- MMC. מכיוון שלגורם הכימי כאן יש ריכוז יחיד (500 mmol/L מתנול) והוא אחד המרכיבים של המדיום, רק בקבוק מגיב אחד המכיל את הגורם הכימי מותקן כאן, והריכוז מוגדר כ-0%. כתב מתייחס למצב של תת-טיפוח, המחולק לשלושה סוגים: מצב זמן, מצב ערך OD ומצב פלואורסצנציה. הראשון פירושו לטפח את הטיפות למשך זמן קבוע ולאחר מכן תת-טיפוח, בעוד ששני האחרונים האמצעים לטפח את הטיפות לערך OD מוגדר מראש / עוצמת פלואורסצנציה ולאחר מכן תת-טיפוח. פרמטר מתייחס לפרמטר הקשור הנדרש בעת בחירת מצב של תת-טיפוח. חזרות מתייחסות למספר תת-הטיפוחים.
  7. הסר את בקבוק המגיבים הממוקם בין מחבר C2 ל- O2 כפי שמוסבר בשלב 3.8.
  8. שימו לב אם ערכי ה-OD המרביים של הטיפות במהלך כל תקופת טיפוח עלו באופן משמעותי. אם העלייה מתרחשת ועומדת בדרישות הניסוי, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD כפי שמוסבר בשלב 3.9.
    הערה: כאן, תקופת הטיפוח המשני תלויה בפרמטר. לדוגמה, בעת הגדרת סוג כזמן ופרמטר כ- 30 שעות, תקופת הטיפוח המשני היא 30 שעות. במהלך כל תקופת תת-טיפוח, ישנם ערכי ה- OD המרביים של הטיפות. להעריך אם האבולוציה ההסתגלותית עונה על דרישות הניסוי על ידי עלייה של ערכי OD מקסימליים (העלייה תלויה בתהליך הטיפוח בפועל של הזן, למשל, גדל ביותר מ -20%).
    אזהרה: שימו לב אם המדיום הטרי המאוחסן מותש. אם העלייה המשמעותית לא התרחשה גם לאחר שהמדיום מותש, הוציאו את הטיפות הגדלות טוב יותר ובצעו סבב חדש של אבולוציה מסתגלת.
  9. חלץ את טיפות המטרה מה- MMC.
    1. לחצו על כפתור הסינון כדי לבחור את הפונקציה של חילוץ טיפות (איור 3C). בחר באפשרות איסוף , לחץ על מספרי טיפות היעד ולאחר מכן לחץ על אישור.
      הערה: סינון טיפות כולל "לאסוף", "להשליך" ו "לחלץ תמיסת זרעים". "תמיסת זרעים לחלץ" פירושה לאסוף את הטיפות הנותרות13 לאחר פעולת הטיפוח התת-קרקעית.
    2. המתן עד שהחלון הקופץ יבקש, "אנא שלף את המחבר המהיר של CF והכנס אותו לצינור ה- EP". הכניסו את המחבר המהיר של CF לצינור ה-microcentrifuge לאיסוף בהתאם להנחיות התוכנה ולאחר מכן לחצו על אישור (איור 4D).
    3. לאחר 1-2 דקות, ממשק התוכנה יצוץ חלון חדש המבקש, "אנא הכנס את המחבר בחזרה ולחץ על אישור אם סיים". לאחר מכן, הכנס את המחבר המהיר של CF בחזרה ולחץ על אישור כדי לגרום ל- MMC להמשיך לפעול (איור 4D). כאשר טיפת היעד הבאה מגיעה לאתר זיהוי הטיפות, חזור על 4.9.2-4.9.3 כדי לאסוף אותה.
      הערה: לאחר שכל טיפות המטרה נאספו, ה- MMC ימשיך לטפח את הטיפות הנותרות. אם הטיפוח אינו נחוץ, לחץ על עצור כדי לסיים ישירות את הפעולה.
    4. מחלצים את הטיפה באמצעות פיפטה של 2.5 μL, מפילים אותה על צלחת האגרוס בקוטר 90 מ"מ ומפזרים אותה באופן שווה עם מוט התפשטות זכוכית משולש באורך צדדי של 3 ס"מ. לאחר מכן לטפח אותו באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
    5. בחרו 3-5 מושבות עצמאיות וטפחו אותן בנפרד בצלוחיות שייק 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום טרי באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי לאחסן את תמיסת החיידקים בתרבית בצינור הגליצרול לניסויים הבאים.

5. נקי מה-MMC

  1. לאחר השלמת הניסוי, לחץ על עצור כדי להפסיק את כל הפעולות. לאחר מכן לחץ על נקה כדי לנקות את השבב והצינורות. זה ייקח בערך 15 דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש ב-E. coli MG1655 ובזן MeSV2.2 כדוגמאות להדגמת הטיפוח המיקרוביאלי והאבולוציה האדפטיבית החיונית למתנול עם תפוקה אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה יחסית ב-MMC. מדידת עקומת הגדילה שימשה בעיקר לאפיון גידול מיקרוביאלי. האבולוציה ההסתגלותית נערכה על ידי תת-גידול רציף אוטומטי והוספת ריכוז גבוה של מתנול כלחץ סלקטיבי במהלך כל תת-טיפוח. השאלה אם האבולוציה ההסתגלותית מומשה הוערכה באמצעות מגמת הווריאציה של ערך ה-OD המרבי של הטיפות במהלך כל תקופת תת-טיפוח. הפרמטרים הניתנים לכוונון ופרמטרים דיוק של MMC מוצגים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח. MMC היא מערכת גידול מיקרוביאלית ממוזערת, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות ומכשירים קונבנציונליים לטיפוח בתפוקה גבוהה של מיקרוביאל בתפוקה גבוהה, ל-MMC יש יתרונות רבים כגון צריכת עבודה וריאגנטים נמוכה, פעולה פשוטה, זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה), איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה והקבלה מעולה. ל-MMC יש גם כמה יתרונות מיוחדים שונים מהטכנולוגיה המיקרופלואידית הקונבנציונלית של טיפות ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2018YFA0901500), הפרויקט הלאומי של מכשירים וציוד מדעיים מרכזיים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21627812), ותוכנית המחקר המדעי של יוזמת אוניברסיטת צינגהואה (20161080108). אנו מודים גם לפרופ' ג'וליה א. וורהולט (המכון למיקרוביולוגיה, המחלקה לביולוגיה, ETH ציריך, ציריך 8093, שוויץ) על אספקת זן E. coli החיוני למתנול גרסה 2.2 (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μ m PVDF מסנן קרוםMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBלעקר את שמן MMC
ב-4 מעלות ו-deg; מקרר CHaierBCD-289BSWלאחסון ריאגנטים
AgarBecton, Dickinson and Company214010להכנת צלחת מוצקה
CaCl2· 2H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ20011160רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
ספסל נקיבייג'ינג דונגליאן הר ייצור מכשירים ושות', בע"מDL-CJ-INDIIלניתוח אספטי ועיקור UV
CoCl2· 6H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10007216רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מחשבLenovoE450התקנת תוכנה ובקרת MMC
חממת טמפרטורה קבועהשנחאי qixin מכשיר מדעי ושות', בע"מLRH 250לגידול מיקרוביאלי באמצעות מדיום מוצק
CuSO4· 5H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10008218רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
איזון אלקטרוניOHAUSAR 3130למגיב במשקל
צינור EPתרמו פישר1.5 מ"ללאיסוף טיפות
FeCl3· 6H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10011928רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
צינור הקפאהתרמו פישר2.0 מ"ללשימור זן
גלוקונאטסיגמא-אולדריץ'S2054רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
גליצרולGENERAL-REAGENTG66258Aלשימור מתח
סיר עיקור קיטור בלחץ גבוהSANYO MLS3020 חשמלילעיקור חיטוי
איזופרופיל-&בטא;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotop420322רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מתנולMACKLINM813895מרכיב במדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-Iביצוע קביעת עקומת גדילה והתפתחות אדפטיבית. אנא עיין בשבב
מיקרופלואידי http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODלפעולות טיפות שונות. אנא עיין
ב-http://www.tmaxtree.com/en/ MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODשלב השמן למיקרופלואידיקה טיפתית. אנא עיין ב-http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793Jרכיב של מדיום LB
Na2HPO4· 12H2Oמגיב כללירכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
NH4Clסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10001518רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
צלחת פטריקורנינג משולבת90 מ"מלהכנת פיפטה אפנדורף בינונית מוצקה
2.5 μ L, 10 ו-mu; L, 100μ L, 1000μ Lלטיפול בנוזלים
מחבר מהיר ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—לחיבור של כל מפרק. אנא עיין
בבקבוק http://www.tmaxtree.com/en/ ריאגנטLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBדגימה ואחסון של תמיסת חיידקים וריאגנטים. אנא עיין בבקבוק http://www.tmaxtree.com/en/
שייקUnion-Biotech50 מ"ללגידול מיקרוביאלי
חממת טלטולשנחאי Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2Bלגידול מיקרוביאלי בבקבוק שייק
Streptomycin sulfateSolarbioS8290רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מזרקJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 מ"ללשאוב נוזל ולהזריק אותו לבקבוק המגיב
מחט מזרקOUBEL Hardware Store22Gהקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ.
טריפטוןאוקסואיד בע"מLP0042רכיב של מקרר LB בינוני
בטמפרטורה נמוכה במיוחדSANYO Ultra-lowMDF-U4086Sלשימור מתח (-80 ו-deg; ג)
UV– ספקטרופוטומטר Visחברת ג'נרל אלקטריקUltrospec 3100 proלמדידת ערכי OD
ויטמין B1SolarbioSV8080רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
תמצית שמריםאוקסואיד בע"מרכיב LP0021של מדיום LB
ZnSO4· 7H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10024018רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
G10267B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles