Method Article

טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה מסתגלת באמצעות מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות כוללות בדרך כלל פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. יתר על כן, לשיטות גידול בתפוקה גבוהה המבוססות על מיקרו-פלטות שפותחו בשנים האחרונות יש מצב גידול מיקרוביאלי ירוד והקבלה ניסיונית בגלל החמצן המומס הנמוך שלהן, תערובת לקויה, אידוי חמור והשפעה תרמית. בשל יתרונות רבים של מיקרו-טיפות, כגון נפח קטן, תפוקה גבוהה ויכולת שליטה חזקה, הטכנולוגיה המיקרופלואידית מבוססת הטיפות יכולה להתגבר על בעיות אלה, אשר שימשה בסוגים רבים של מחקר של טיפוח מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה, סינון ואבולוציה. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים נשארים בשלב של בנייה ויישום מעבדה. כמה סוגיות מרכזיות, כגון דרישות תפעוליות גבוהות, קשיי בנייה גבוהים והיעדר טכנולוגיית אינטגרציה אוטומטית, מגבילים את היישום הרחב של טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות במחקר מיקרוביאלי. כאן, מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) פותחה בהצלחה על בסיס טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות, והשיגה שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור מקוון, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך גידול הטיפות המיקרוביאליות. בפרוטוקול זה, Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג פראי וזן E. coli חיוני למתנול (MeSV2.2) נלקחו כדוגמאות כדי להציג כיצד להשתמש ב- MMC כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ובעל תפוקה גבוהה יחסית ואבולוציה מסתגלת בפירוט. שיטה זו קלה לתפעול, צורכת פחות עבודה וריאגנטים, ויש לה תפוקה ניסיונית גבוהה ומקבילות נתונים טובות, שיש לה יתרונות גדולים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה עבור חוקרים מדעיים לביצוע מחקר מיקרוביאלי קשור.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גידול מיקרוביאלי הוא בסיס חשוב למחקר מדעי מיקרוביולוגי וליישומים תעשייתיים, הנמצא בשימוש נרחב בבידוד, זיהוי, שחזור, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים 1,2,3. שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות משתמשות בעיקר במבחנות, צלוחיות שייק ולוחות מוצקים כמיכלי גידול, בשילוב עם אינקובטורים רועדים, ספקטרופוטומטרים, קוראי מיקרו-פלטות וציוד אחר לטיפוח, גילוי וסינון מיקרוביאליים. עם זאת, לשיטות אלה יש בעיות רבות, כגון פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. שיטות הטיפוח בתפוקה גבוהה שפותחו בשנים האחרונות מבוססות בעיקר על המיקרו-לוחית. אבל למיקרו-פלטה י....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התקנת מכשירים ותוכנה

  1. בחרו בסביבה נקייה וסטרילית (כגון ספסל נקי) כחלל קבוע ייעודי ל-MMC. התקן את ה- MMC בהתמדה בחלל.
    הערה: הרחיקו את ה-MMC מהפרעה של שדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום חזקים. הימנע מרטט חמור מלהשפיע על רכיבי הגילוי האופטיים. ספק את ספק הכוח של AC220 V, 50 HZ ל- MMC. לפרטים על MMC עיין בטבלת החומרים ובאתר האינטרנט של MMC16.
  2. התקן את תוכנת הפעולה מקובץ MMC.zip
    הערה: צור קשר עם המחברים עבור הקובץ .zip MMC.
    1. צור תיקיה ייעודית ושמור בה את קובץ ה- zip.
    2. צור תיקיה ייעודית נוספת כ"ספריית ההתקנה ". פתח את ה- MMC.zip ושמור את הקבצים בתיקיה החדשה.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משתמש ב-E. coli MG1655 ובזן MeSV2.2 כדוגמאות להדגמת הטיפוח המיקרוביאלי והאבולוציה האדפטיבית החיונית למתנול עם תפוקה אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה יחסית ב-MMC. מדידת עקומת הגדילה שימשה בעיקר לאפיון גידול מיקרוביאלי. האבולוציה ההסתגלותית נערכה על ידי תת-גידול רציף אוטומטי והוספת ריכוז גבוה של מתנול כלחץ סלקטיבי במהלך כל תת-טיפוח. השאלה אם האבולוציה ההסתגלותית מומשה הוערכה באמצעות מגמת הווריאציה של ערך ה-OD המרבי של הטיפות במהלך כל תקופת תת-טיפוח. הפרמטרים הניתנים לכוונון ופרמטרים דיוק של MMC מוצגים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח. MMC היא מערכת גידול מיקרוביאלית ממוזערת, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות ומכשירים קונבנציונליים לטיפוח בתפוקה גבוהה של מיקרוביאל בתפוקה גבוהה, ל-MMC יש יתרונות רבים כגון צריכת עבודה וריאגנטים נמוכה, פעולה פשוטה, זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה), איסוף נתונים ברזולוציה גבוהה והקבלה מעולה. ל-MMC יש גם כמה יתרונות מיוחדים שונים מהטכנולוגיה המיקרופלואידית הקונבנציונלית של טיפות ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2018YFA0901500), הפרויקט הלאומי של מכשירים וציוד מדעיים מרכזיים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21627812), ותוכנית המחקר המדעי של יוזמת אוניברסיטת צינגהואה (20161080108). אנו מודים גם לפרופ' ג'וליה א. וורהולט (המכון למיקרוביולוגיה, המחלקה לביולוגיה, ETH ציריך, ציריך 8093, שוויץ) על אספקת זן E. coli החיוני למתנול גרסה 2.2 (MeSV2.2).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μ m PVDF מסנן קרוםMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBלעקר את שמן MMC
ב-4 מעלות ו-deg; מקרר CHaierBCD-289BSWלאחסון ריאגנטים
AgarBecton, Dickinson and Company214010להכנת צלחת מוצקה
CaCl2· 2H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ20011160רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
ספסל נקיבייג'ינג דונגליאן הר ייצור מכשירים ושות', בע"מDL-CJ-INDIIלניתוח אספטי ועיקור UV
CoCl2· 6H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10007216רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מחשבLenovoE450התקנת תוכנה ובקרת MMC
חממת טמפרטורה קבועהשנחאי qixin מכשיר מדעי ושות', בע"מLRH 250לגידול מיקרוביאלי באמצעות מדיום מוצק
CuSO4· 5H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10008218רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
איזון אלקטרוניOHAUSAR 3130למגיב במשקל
צינור EPתרמו פישר1.5 מ"ללאיסוף טיפות
FeCl3· 6H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10011928רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
צינור הקפאהתרמו פישר2.0 מ"ללשימור זן
גלוקונאטסיגמא-אולדריץ'S2054רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
גליצרולGENERAL-REAGENTG66258Aלשימור מתח
סיר עיקור קיטור בלחץ גבוהSANYO MLS3020 חשמלילעיקור חיטוי
איזופרופיל-&בטא;-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotop420322רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מתנולMACKLINM813895מרכיב במדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
MgSO4· 7H2OBIOBYING1305715רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-Iביצוע קביעת עקומת גדילה והתפתחות אדפטיבית. אנא עיין בשבב
מיקרופלואידי http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODלפעולות טיפות שונות. אנא עיין
ב-http://www.tmaxtree.com/en/ MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODשלב השמן למיקרופלואידיקה טיפתית. אנא עיין ב-http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793Jרכיב של מדיום LB
Na2HPO4· 12H2Oמגיב כללירכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
NH4Clסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10001518רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
צלחת פטריקורנינג משולבת90 מ"מלהכנת פיפטה אפנדורף בינונית מוצקה
2.5 μ L, 10 ו-mu; L, 100μ L, 1000μ Lלטיפול בנוזלים
מחבר מהיר ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—לחיבור של כל מפרק. אנא עיין
בבקבוק http://www.tmaxtree.com/en/ ריאגנטLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBדגימה ואחסון של תמיסת חיידקים וריאגנטים. אנא עיין בבקבוק http://www.tmaxtree.com/en/
שייקUnion-Biotech50 מ"ללגידול מיקרוביאלי
חממת טלטולשנחאי Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2Bלגידול מיקרוביאלי בבקבוק שייק
Streptomycin sulfateSolarbioS8290רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
מזרקJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 מ"ללשאוב נוזל ולהזריק אותו לבקבוק המגיב
מחט מזרקOUBEL Hardware Store22Gהקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ.
טריפטוןאוקסואיד בע"מLP0042רכיב של מקרר LB בינוני
בטמפרטורה נמוכה במיוחדSANYO Ultra-lowMDF-U4086Sלשימור מתח (-80 ו-deg; ג)
UV– ספקטרופוטומטר Visחברת ג'נרל אלקטריקUltrospec 3100 proלמדידת ערכי OD
ויטמין B1SolarbioSV8080רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
תמצית שמריםאוקסואיד בע"מרכיב LP0021של מדיום LB
ZnSO4· 7H2Oסינופארם ריאגנט כימי בייג'ינג ושות', בע"מ10024018רכיב של המדיום המיוחד עבור MeSV2.2.
G10267B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles