כתב יד זה מתאר כיצד להעריך במערכת החיסונית של vivo של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בתאי הגידול (EVs) באמצעות ציטומטריית זרימה. רכבים חשמליים שמקורם בגידולים העוברים מוות תאי אימונוגני שנגרם כתוצאה מהטיפול נראים רלוונטיים במיוחד במערכון הגידול. פרוטוקול זה מדגים את ההערכה של אוקסליפלטין-induced emunostimulatory גידול EVs אבל יכול להיות מותאם להגדרות שונות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ב-Vivo הקרנה אימונוגנית של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בגידול על ידי ציטומטריית זרימה של תאי T טחול
במאמר זה
סיכום
תקציר
מוות תאי אימונוגני של גידולים, הנגרם על ידי כימותרפיה או הקרנה, יכול לעורר תגובות תאי T ספציפיים לגידול על ידי שחרור דפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה וגרימת הייצור של סוג I אינטרפרון. אימונותרפיות, כולל עיכוב נקודת ביקורת, מסתמכות בעיקר על תאי T קיימים הספציפיים לגידול כדי לפתח אפקט טיפולי. לפיכך, גישות טיפוליות סינרגטיות המנצלות מוות תאי אימונוגני כחיסון אנטי-סרטני מהותי עשויות לשפר את יכולת התגובה שלהן. עם זאת, הספקטרום של גורמים אימונוגניים ששוחררו על ידי תאים תחת לחץ המושרה על ידי טיפול נשאר מאופיין באופן חלקי, במיוחד לגבי שלפוחיות חוץ תאיות (EVs). רכבים חשמליים, חלקיקים מממברניים בקנה מידה ננומטרי הנפלטים כמעט מכל התאים, נחשבים כמקלים על תקשורת בין-תאית, ובסרטן, הוכחו כמתווכים בין-ראשוניים נגד אנטיגנים של גידולים. כדי להעריך את ההשפעה החיסונית של רכבים חשמליים שמקורם בגידולים בתנאים שונים, שיטות הסתגלות, מדרגיות ותקיפות מבוקשות. לכן, כאן מוצגת גישה קלה וחזקה יחסית להערכת האימונוגניות של רכבים חשמליים . הפרוטוקול מבוסס על ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי T טחול לאחר חיסון vivo של עכברים עם רכבים חשמליים, מבודד על ידי בדיקות מבוססות משקעים מתרביות תאים סרטניים תחת טיפול או מצב יציב. לדוגמה, עבודה זו מראה כי חשיפה oxaliplatin של B16-OVA מורין מלנומה תאים הביא לשחרור של רכבים חשמליים אימונוגניים שיכולים לתווך את ההפעלה של תאי T ציטוטוקסיים תגובתי הגידול. לפיכך, הקרנה של כלי רכב חשמליים באמצעות חיסון vivo וציטומטריית זרימה מזהה תנאים שבהם כלי רכב חשמליים אימונוגניים יכולים לצאת. זיהוי תנאים של שחרור EV אימונוגני מספק תנאי הכרחי לבדיקת היעילות הטיפולית של רכבים חשמליים נגד סרטן ובחינת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים כדי לחשוף בסופו של דבר תובנות חדשות על תפקידם של כלי רכב חשמליים באימונולוגיה של סרטן.
מבוא
המערכת החיסונית ממלאת תפקיד מרכזי במאבק נגד סרטן, הן כאשר הוא מועלה על ידי עיכוב מחסום חיסוני והן על היעילות של טיפולים קונבנציונליים לסרטן. תאים סרטניים שנכנעים לטיפולים גנוטוקסיים כגון הסוכנים הכימותרפיים אוקסליפלטין ודוקסורוביצין, או טיפול קרינה מייננת יכולים לשחרר אנטיגנים ודפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) שעשויים ליזום תגובה חיסונית נוגדת גידולים הסתגלות1. ה- DAMPs הבולטים ביותר, בהקשר של מוות תאי אימונוגני, כוללים אותות find-me כגון ATP כימוטקטי, אותות eat-me כגון חשיפת calreticulin, המקדם את ספיגת תאי הגידול על ידי תאים המציגים אנטיגן, ואת שחרורו של HMGB1, המפעיל קולטני זיהוי דפוס, ובכך משפר את ההצגה הצולבת של אנטיגנים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בתחילת הניסויים, עכברים היו לפחות 6 שבועות של גיל נשמרו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. הפרוטוקול הנוכחי עומד בסטנדרטים האתיים המוסדיים ובתקנות המקומיות השוררות. מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הסוכנות הרגולטורית המקומית (Regierung von Oberbayern, מינכן, גרמניה). הטיות אפשריות הקשורות למין לא נחקרו במחקרים אלה.
1. ייצור ובידוד של רכבים חשמליים שמקורם בתאי הגידול לאחר חשיפה לכימותרפיה
- תרבית מורין B16 תאי מלנומה המבטאים אובלבומין (B16-OVA) ב- DMEM (המכיל 4 מ"מ L-גלוטמין ו 4.5 גרם / L D-גלוקוז) בתוספת FCS (10% v / v), פניצילין (100 יחידות / מ"ל) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 °C (37 °C ,עד התאים לגדול בהתמדה והם כ 90% קונפלציה.
....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה נועד להקל על הערכה פשוטה וקלה לשחזור של האימונוגניות של רכבים חשמליים שמקורם בגידול. בזאת, עכברים מחוסנים עם רכבים חשמליים הנגזרים מתרביות הפריה חוץ גופית של תאים סרטניים המבטאים את המודל אנטיגן עוף ovalbumin (OVA). התגובה החיסונית הבאה מנותחת בתאי T טחול באמצעות ציטומטריית זרימה.
איור 1 מספק סקירה כללית של השלבים המעשיים של הפרוטוקול כולו. מאחר שהעבודה מתמקדת במוות תאי אימונוגני, הצגה צולבת וחסינות נגד גידולים הנגרמת על ידי EV, פרוטו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק הערכה אימונולוגית של vivo של כלי רכב חשמליים שמקורם בתאי מלנומה תחת לחץ הנגרמת על ידי כימותרפיה תוך הסתגלות לרכבים חשמליים הנפלטים מסרטן שונים תחת טיפולים שונים. חיסון עכברים עם רכבים חשמליים המופקים מתאי B16-OVA שטופלו באוקסליפלטין, למשל, מרחיב את תאי CD8+ T המייצרים IFN-γ בטחול, אשר מגורים עוד יותר על ידי דגירה ex vivo עם אובלבומין, המציין תגובה חיסונית ספציפית לגידול. לכן, זיהוי של רכבים חשמליים אימונוגניים על ידי סינון באמצעות פרוטוקול זה מאפשר הבנה מקיפה יותר של טיפולים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ו Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (ל- H.P.), מענק מחקר Harf Mechtild מקרן DKMS למתן חיים (ל- H.P.) פרס חוקר צעיר על ידי ברית המחקר מלנומה (ל- S.H.), מלגה על ידי Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (ל- F.S.), מלגה על ידי Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (ל- F.S.), קרן זרעים של האוניברסיטה הטכנית מינכן (ל- S.H.) ומענק מחקר על ידי קרן וילהלם סנדר (2021.041.1, ל- S.H.). H.P. נתמך על ידי תוכנית החוקרים הצעירים של EMBO.
תרומות מחבר:
F.S., H.P., ו S.H. עיצבו את המחקר, ניתחו ופירשו את התוצאות. פ.ס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אנטי-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | שיבוט 17A2 |
| אנטי-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | שיבוט GK1.5 |
| אנטי-CD8 APC Biolegend | 100712 | שיבוט 53-6.7 | |
| אנטי-IFN&גמא; PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| מסננת תאים, 100 ומיקרו; m | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 ומיקרו; m |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium עם D-גלוקוז (4.5 גרם/ליטר) ו-L-גלוטמין (4 מ"מ) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | סרום עגל עוברי (FCS) |
| צבע כדאיות לתיקון eFluor 506 | eBioscience, חטיבה של Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| תרכיז קיבוע/פרמיביליזציה | eBioscience | 00-5123-43 | תרכיז קיבוע/פרמביליזציה (10x) |
| קיבוע/פרמביליזציה מדלל | eBioscience | 00-5223-56 | |
| יונומיצין | סיגמא-אולדריץ | 407952 | מ-Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-גלוטמין | גיבקו | 25030-032 | L-גלוטמין (200 מ"מ) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | אובאלבומין עם אנדוטוקסין 1 EU/מ"ג - CAS 9006-59-1 |
| אוקסליפלטין | של בית החולים | ||
| MRI PBS | סיגמא-אולדריץ' | D8537 | תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 1514-122 | תערובת של פניצילין (10,000 U/mL) וסטרפטומיצין (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-אצטט, ≥ 99% (HPLC) |
| מסנן PVDF, 0,22 ומיקרו; m, למזרקים | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV יחידת סינון 0.22 ומיקרו; m Durapore PVDF ממברנה |
| מאגר ליזה של תאי דם אדומים | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 מדיום עם D-גלוקוז (2.00 גרם/ליטר) ו-L-גלוטמין (300 מ"ג/ליטר), ללא |
| מזרק HEPES, 26 גרם | BD Biosciences | 305501-1 | מ"ל מזרקי Sub-Q עם מחט (0.45 מ"מ x 12.7 מ"מ) |
| מגיב בידוד אקסוזום כולל | Invitrogen | 4478359 | לבידוד ממצע תרבית תאים |
| β -Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β -מרקפטואתנול (50 מ"מ) |
מקורות
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691(2014)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
