אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחביות באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטון בגסטרולה דג הזברה

Summary

התפתחות עוברית דורשת תיאום בקנה מידה גדול של תנועת תאים. אבלציה תלת-ממדית של עירור דו-פוטון מאפשרת אבלציה תלת-ממדית מבוקרת מרחבית של קבוצות גדולות של תאים עמוקים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לחקור את התגובה של תאים נודדים באופן קולקטיבי ב vivo להסתבכויות בסביבה המכנית שלהם.

Abstract

מורפוגנזה כרוכה בתנועות תאים רבות כדי לארגן תאים לתוך רקמות ואיברים. לפיתוח תקין, כל התנועות האלה צריכות להיות מתואמות היטב, וצבירת ראיות מצביעה על כך שזה מושג, לפחות בחלקו, באמצעות אינטראקציות מכניות. בדיקת זה בעובר דורשת בעיות פיזיות ישירות. אבלציות לייזר הן אפשרות בשימוש הולך וגדל המאפשרת להקל על אילוצים מכניים או בידוד פיזי של שתי אוכלוסיות תאים זו מזו. עם זאת, אבלציות רבות מבוצעות עם לייזר אולטרה סגול (UV), המציע רזולוציה צירית מוגבלת וחדירת רקמות. שיטה מתוארת כאן כדי לנפח נפחים עמוקים, משמעותיים ומוגדרים היטב באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. אבלציות מודגמות בקו דגי זברה מהונדס המבטא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק במסנדונדורם צירי ומשמשות לניתוק המסנדודרם צירי מבלי להשפיע על הקטודרם המשתרע יתר על המידה או על תא החלמון הבסיסי. התנהגות התא מנוטרת על-ידי הדמיה חיה לפני ואחרי אבלציה. פרוטוקול אבלציה יכול לשמש בשלבים התפתחותיים שונים, על כל סוג תא או רקמה, בקשקשים הנעים בין כמה מיקרונים ליותר ממאה מיקרון.

Introduction

אינטראקציות בין תאים ממלאות תפקידים חיוניים בהתפתחות. תאים מספקים אותות לכך שהשכנים הישירים שלהם, או התאים רחוקים יותר, יכולים לתפוס, ובכך להשפיע על גורלם ו /או התנהגותם. רבים מהאותות האלה הם כימיים בטבע. לדוגמה, באירועי אינדוקציה מאופיינים היטב, קבוצת תאים אחת מייצרת מולקולות מפוזרות המשפיעות על גורלה של אוכלוסיית תאים ^אחרת1. אותות אחרים, לעומת זאת, הם מכניים; תאים מפעילים כוחות ואילוצים על שכניהם, שהשכנים תופסים ומגיבים ^ל2.

דרך אחת ללמוד את החשיבות של אינטראקציות תא-תאים אלה ב vivo היא לחסל כמה תאים ולבחון את ההתפתחות הבאה. למרבה הצער, הטכניקות הזמינות כדי להסיר או להרוס תאים מוגבלי....

Protocol

כל עבודות החיות אושרו על ידי ועדת האתיקה N 59 ו Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche תחת מספר הקובץ APAFIS#15859-2018051710341011v3. חלק מהצעדים המתוארים להלן ספציפיים לציוד ולתוכנה שלנו, אך ניתן להתאים אותם בקלות לציוד שונה.

1. הכנת הזרקה

1. הכן 75 מ"ל של 1% תמיסה אגרוז בעובר בינוני (EM).
2. מניחים את התבנית בהזרקה בצלחת פטרי 90 מ"מ ויוצקים כ 50 מ"ל של אגרוז, מספיק עבור התבנית לצוף. תן לאגורוז להתמצק ולהסיר את תבנית ההזרקה.
3. מכינים מנה מצופה אגרוז על ידי מזיגת 1 מ"ל של אגרוז בצלחת פטרי 30 מ"מ.
4. הכן 4 μL של 30 ng / μL Histone2B-mשרי mRNA פתרון על ידי דילול פתרון ה....

Results

כדי לנתק את הפולסטר באמצעו, עובר Tg (gsc:GFP), שהוזרק עם Histone2B-mCherry mRNAs הותקן בשלב 70% אפיבולי, כמתואר בשלב 4. הפולסטר זוהה על ידי ביטוי GFP, והעובר הותקן כך שמישור הפולסטר מאונך לציר האופטי (איור 1B). הטיית העובר הרחק מעמדה זו תסבך את ההליך. האור יצטרך לעבור דרך רקמות נוספות כדי להגיע למישורי אבלציה, ומישורי אבלציה יהיו מוטים ביחס לצירים עובריים. לאחר שווידא כי כל גרעיני התא מסומנים כראוי, נרשם זמן של 10 דקות לפני ההפסקה כדי ללכוד תנועות תאים לפני אבלציה (

Discussion

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש באופטיקה לא ליניארית כדי לבצע אבלציות נפח עמוקות ומוגדרות היטב. השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא למצוא תנאי טיפול המספקים מספיק אנרגיה כדי לאפשר אבלציות, אבל לא יותר מדי אנרגיה, כדי למנוע פסולת מוגזמת או cavitation. כמות האנרגיה המועברת באתר היעד תלויה בעיקר ב: (1) כוח יציאת הלייזר, (2) איכות יישור הלייזר, (3) אופי הרקמה שדרכה עובר האור כדי להגיע למישור אבלציה, (4) עומק מישור אבלציה. לכן, לפני כל ניסוי, חיוני למדוד כוח יציאת לייזר, להתאים אותו לערך התייחסות (300 mW ב 820 ננומטר בפרוטוקול.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מטרת טבילה במים 25x	Olympus	XLPLN25XWMP2
Agarose	PanReac AppliChem	A8963,0500
תוכנת ניתוח נתונים: Matlab	Math Works
מודולטור אלקטרו-אופטי (EOM)	ConOptics	350-80LA
פתרון			עוברי בינוני (EM)ווסטרפילד, מ. ספר דג הזברה. מדריך לשימוש במעבדה בדג זברה (Danio rerio), מהדורה חמישית. הוצאת אוניברסיטת אורגון, יוג'ין (ספר). (2000).
תא תא סביבתי	Okolab	H201-T-UNIT-BL
EOM דרייבר	ConOptics	302RM
מקור פלואורסצנטי	Lumencor	SOLA
כלים תחתונים מזכוכית	MatTek	P35G-0-10-C
נימי זכוכית	מכשירי הרווארד 300085		קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.58  מ"מ
פיפטות זכוכית	Volac	D810	קצה צריך להיות מלוטש באש
ירוק / אבלציה לייזר	ספקטרה פיזיקה	Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA			מסונתז מפלסמיד pCS2-H2B-mCherry (Dumortier& al. 2012)
תוכנת ניתוח תמונה: IMARIS	Bitplane
ImSpector software	Abberior צוות
עובש הזרקה	כלי מדע אדפטיבי	I-34
טיפים למיקרו-מעמיס	אפנדורף	5242956003
מיקרומניפולטור	Narishige	MN-151
חולץ מיקרופיפטה	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול	Invitrogen	AM1340
פניצילין-סטרפטומיצין	Thermofisher	15140-122	10,000 יחידות פניצילין ו-10 מגסטרפטומיצין למ"ל
צינור פוטו-מכפיל (PMT)	Hammamatsu	H7422-40
PicoPump (מזרק אוויר)	מכשיר דיוק עולמי	PV820
ספקטרום לייזר אדום	פיזיקה	OPO/Insight DeepSee
RNAse מים ללא הזרקה	Sigma	W3500
: Excel	Microsoft
Stereomicroscope	Nikon	SMZ18
Tg(gsc:GFP) קו			Doitsidou, M. et al. הנחיית נדידת תאי נבט קדמוניים על ידי הכימוקין SDF-1. תא. 111 (5), 647– 59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
מיקרוסקופ TriM Scope II	La Vision Biotech