Method Article

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות ביטוי גנים לא יסולא בפז הן כלי רב ערך לחקר תהליכים ביולוגיים. מערכות ביטוי אופטוגנטיות יכולות לספק שליטה מדויקת על תזמון ביטוי הגנים, המיקום והמשרעת באמצעות אור כסוכן המעורר. בפרוטוקול זה, מערכת ביטוי אופטוגנטית משמשת להשגת ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה. מערכת זו מסתמכת על גורם שעתוק מהונדס הנקרא TAEL המבוסס על גורם שעתוק המופעל על ידי אור ממקור טבעי מהחיידק E. litoralis. כאשר הוא מואר באור כחול, TAEL דימרייז, נקשר לאלמנט הרגולטורי הקוגניטיבי שלו הנקרא C120, ומפעיל תמלול. פרוטוקול זה משתמש בעוברי דגי זברה מהונדסים המבטאים את גורם התמלול של TAEL תחת שליטתו של מקדם ה- ubb בכל מקום. יחד עם זאת, האלמנט הרגולטורי C120 מניע את הביטוי של גן עיתונאי פלואורסצנטי (GFP). באמצעות לוח LED פשוט כדי לספק הפעלת אור כחול, אינדוקציה של ביטוי GFP ניתן לזהות תחילה לאחר 30 דקות של תאורה ומגיע לשיא של אינדוקציה יותר מפי 130 לאחר 3 שעות של טיפול באור. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מוערכת על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) ועל ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא גישה רב-תכליתית וקלה לשימוש לביטוי גנים אופטוגנטיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות ביטוי גנים לא ניתנות לתקדים מסייעות לשלוט בכמות, בתזמון ובמיקום של ביטוי גנים. עם זאת, השגת שליטה מרחבית וטמפורלית מדויקת באורגניזמים רב-תאיים הייתה מאתגרת. בקרת זמן מושגת בדרך כלל על ידי הוספתתרכובות מולקולה קטנה 1 או הפעלה של מקדמי הלם חום2. עם זאת, שתי הגישות חשופות לסוגיות של תזמון, כוח אינדוקציה ותגובות לחץ מחוץ למטרה. שליטה מרחבית מושגת בעיקר על ידי שימוש ביזמים ספציפיים לרקמות3, אבל גישה זו דורשת מקדם מתאים או אלמנט רגולטורי, אשר לא תמיד זמינים, וזה לא תורם אינדוקציה ברמת תת רקמות.

בניגוד לגישות קונבנציונליות כאלה, מפעילי שעתוק אופטוגנטיים המופעלים על ידי ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה מרסד.

1. חציית דגי זברה ואוסף עוברים

  1. שמור על קווי דגי זברה מהונדסים נפרדים המכילים את מפעיל התמלול של TAEL או את הגן הכתב הנשלט על ידי C120 כדי למזער הפעלה מזויפת.
  2. לחצות 6-8 דגי זברה בוגרים מכל שורה בשיטות סטנדרטיות9 כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים הן את רכיבי TAEL והן את רכיבי C120(איור 1B).
    הערה: לחלופין, שני הרכיבים יכולים לבוא לידי ביטוי באופן ארעי באמצעות מיקרו-ינון של mRNA או DNA פלסמיד בשיטות סטנדרטיות10.
  3. לאסוף עוברים במנות פ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור הדגמה זו, קו כתב GFP מגיב C120(Tg(C120F:GFP)ucm107)נחצה עם קו מהונדס המבטא TAEL-N בכל מקום מן ubiquitin b (ubb) מקדם (Tg (ubb:TAEL-N)ucm113))כדי לייצר עוברים מהונדסים כפולים המכילים את שני האלמנטים. 24 שעות לאחר ההפריה, העוברים נחשפו להפעלת האור הכחול, פעמו בתדר של 1 שעות על /1 שעה כבויה. אינדוקציה של ביטוי GFP כותמה על-ידי qRT-PCR ב- 30 דקות, שעה אחת, 3 שעות ו- 6 שעות לאחר ההפעלה (איור 2B וטבלה 1). בהשוואה לעובר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת TAEL/C120 האופטוגנטית להשגת ביטוי גנים כחול שאינו ניתן לתפוקה באור. מערכת זו מורכבת מפעיל תמלול, TAEL, כי dimerizes על תאורה עם אור כחול ומפעיל שעתוק של גן עניין במורד הזרם של אלמנט רגולטורי C120. ביטוי מושרה של כתב GFP ניתן לזהות לאחר מעט כמו 30 דקות של חשיפה לאור, דבר המצביע על כך גישה זו בעלת קינטיקה מהירה יחסית מגיבה.

מספר גורמים יכולים להשפיע על רמות האינדוקציה. הקריטיים ביותר הם אורך הגל והעוצמה של הפעלת האור. בפרוטוקול זה נעשה שימוש 465 ננומטר נורות LED.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסטפן מטרנה ולחברים במעבדות וו ומטורנה על הצעות והערות מועילות על פרוטוקול זה. אנו מודים לאנה ריד, קווין גרדנר ולורה מוטה-מינה על דיון ותובנות יקרי ערך בעת פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH; R03 DK106358) והוועדה לתיאום חקר הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה (CRN-20-636896) ל- S.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender כלי איור מדעי מבוסס אינטרנט BioRenderhttps://biorender.com/
מצלמה דיגיטלית CCD צבעוניתLumenara755-107
קונסולת מד כוח ואנרגיה קומפקטית, מסנן עירור LCD דיגיטלי 4 אינץ'ThorlabsPM100D
, 545 ננומטראולימפוסET545/25x
illustra RNAspin Mini kitGE בריאות95017-491
אינסטנט אוקיינוס מלח יםמיידי אוקיינוסSS15-10
MARS AQUA ניתן לעמעום 165 W אור אקווריום LED (כחול ולבן)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW מתג טיימר דיגיטלי לתכנותAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR ירוק תערובת מהירהQuantabio101414-286
תוכנת עיבוד תמונה פוטושופתוכנת
PrismGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 מערכת PCR בזמן אמתApplied BiosystemsA28137
סטריאומיקרוסקופאולימפוסSZX16
טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונט)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 מקור אור LED פלואורסצנטיExcelitas010-00326Rהופסק. הוא הוחלף ב-X-Cite mini+
גרפים וסטטיסטיקה Adobe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

Related Articles