הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)

3.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62830

⸱

5 בפברואר 2022

 ,  , 
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.

תקציר

חקירות במבחנה איתנה של המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה אינטגרליים היוו אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה והגורמים הרבים המשפיעים על התנהגות החלבון בתאים חיים. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם מערכת מודל מימטיקה וטופילית מאוד במבחנה לחקירת אינטראקציות בין קרום חלבון וחיקור התנהגות חלבונים באופן מדויק ותלוי גירוי. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה זולה ויעילה לייצור GUVs עם קולטן סרוטונין 1A האנושי (5-HT1AR) משולב ביציבות בממברנה. אנו מייצרים ג'וונים בשיטת נפיחות הידרוג'ל מותאמת; על ידי הפקדת סרט שומנים על גבי תערובת של agarose ו 5-HT1AR ולאחר מכן לחות המערכת כולה, שלל ניתן ליצור עם כוון כראוי ופונקציונלי 5-HT1AR משולב לתוך הממברנה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- GUVs אלה כדי לבחון אינטראקציות בין קרום חלבון והתנהגות לוקליזציה באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יכול לקדם את הבנתנו את הפונקציונליות של חלבוני ממברנה אינטגרליים, ומספק תובנה פיזיולוגית עמוקה.

מבוא

ממברנות מודל סינתטי הם כלים רבי עוצמה בחקירה של המאפיינים הבסיסיים ואת הפונקציות של biomembranes. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר מגוון תכונות קרום פלזמה וניתן להנדסן כדי לחקות מצבים פיזיולוגיים שונים1,2,3,4,5,6,7,8. הוא מבוסס היטב כי קרום הפלזמה והארגון שלה לשחק תפקיד מפתח בהמון של תהליכים תאיים, כגון העברת אותות, הידבקות, אנדוציטוזיס, ותחבורה9,10,11,12,13,14,15.

GUVs כבר מפוברק בשיטות שונות, כולל הידרציה עדינה16, נפיחות הידרוג'ל17, electroformation18, טכניקות מיקרופלואידיות19,20,21,22, jetting23, וחילופי ממס24,25,26. בשל אתגרים בטיפול בחלבוני ממברנה אינטגרליים (IMPs), פלטפורמות במבחנה לחקור אותם הוגבלו. GUVs מציגים פלטפורמה פשוטה לחקר IMPs בסביבה המחקה את הסביבה המקורית שלהם. למרות שהיו מספר גישות לחזרת חלבונים ב- GUVs, אתגרים נובעים משלב חלבונים עם הכיוון הנכון ושמירה על פונקציונליות חלבון27.

שחזור החלבון המוצלח ביותר ב- GUVs דורש את שיטת החלפת חומרי הניקוי; אשר כרוך solubilizing החלבונים מהסביבה הטבעית שלהם על ידי דטרגנטים, ואחריו טיהור חלבון, ולאחר מכן החלפת מולקולות דטרגנט עם שומנים באמצעות שיטות שונות28. בעוד חומרי ניקוי משמשים לייצוב המבנה שלישוני של IMPs במהלך הטיהור, micelles דטרגנט הם סביבה לא טבעית יחסית עבור חלבונים אלה, אשר מיוצבים טוב יותר, במיוחד עבור מחקרים פונקציונליים, ב bilayers השומנים28,29,30. יתר על כן, שילוב חלבוני טרנסממברן פונקציונליים לתוך bilayer השומנים באמצעות טכניקות ייצור GUV מסורתיות היה קשה בשל הגודל, העדינות של חלבונים אלה, ואת צעדי החלפת דטרגנט נוספים כי יהיה צורך27,31,32,33. השימוש בממס אורגני להסרת חומרי ניקוי גורם לצבירה של חלבונים ודנטורינג34. שיטה משופרת בתיווך דטרגנט מבטיחה, עם זאת, יש צורך בזהירות עבור שלב הסרת חומרי ניקוי ואופטימיזציה עשויה להיות נחוצה עבור חלבונים ספציפיים31,35. בנוסף, שיטות המשתמשות electroformation יכול להגביל את הבחירה של חלבון ולא יכול להיות מתאים לכל הרכבי השומנים טעונים במיוחד שומנים טעונים31,36,37. טכניקה נוספת בה נעשה שימוש היא היתוך המושרה בפפטיד של שלשלות חד-צדדיות גדולות (LUVs) המכילות את החלבון הרצוי עם רכבי שטח, אם כי נמצא כי הוא מייגע ויכול להוביל להכנסת מולקולות זרות - הפפטידים הפוסובגניים33,38,39. שלל קרום פלזמה ענק (GPMVs), אשר נגזרים תאים חיים, ניתן להשתמש כדי להתגבר על חלק מבעיות אלה, אולם הם מאפשרים שליטה מינימלית של השומנים וחלבון התוצאה14,40,41. לכן, שילוב של IMPs בשכבה הדו-ליפידית של GUVs באמצעות שיטת הנפיחות האגרוז המותאמת שלנו מציג שיטה אמינה לבחון עוד יותר חלבונים אלה בסביבת הממברנה42,43,44,45.

איתות ותקשורת תאית כוללת משפחה של חלבונים המכונה קולטנים מצמידי חלבון G (GPCRs); GPCRs הם בין המשפחה הגדולה ביותר של חלבונים והם קשורים עם מצב רוח מווסת, תיאבון, לחץ דם, תפקוד לב וכלי דם, נשימה, ושינה בין פונקציות פיזיולוגיות רבות אחרות46. במחקר זה, השתמשנו קולטן סרוטונין אנושי 1A (5-HT1AR) שהוא חבר טיפוסי של משפחת GPCR. 5-HT1AR ניתן למצוא במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית) וכלי הדם; זה משפיע על פונקציות רבות כגון קרדיווסקולרי, העיכול, תפקודים אנדוקריניים, כמו גם השתתפות ברגולציה של mood47. מחסום גדול למחקר GPCR נובע מהמבנה האמפיפילי המורכב שלהם, ו- GUVs מציגים פלטפורמה מבטיחה לחקירה של תכונות שונות של עניין, החל מפונקציונליות חלבון, אינטראקציות בין חלבון שומנים לחלבון ואינטראקציות חלבון-חלבון. גישות שונות נוצלו לחקר אינטראקציות בין חלבון שומנים לשומנים כגון תהודה פלסמון פני השטח (SPR)48,49, ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)50,51, שכבת-על שומנים חלבונית (אש"ף) 51,52,53,54, ספקטרומטריית מסת מקומית55, קלורימטריה איזותרמית (ITC)56,57, וליפוזום מטען מטען 58,59. המעבדה שלנו השתמשה בגישת ה- GUV הפשוטה כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות חלבון שומנים על פונקציונליות החלבון על ידי תקציר BODIPY-GTPγS, אשר נקשר עם Giα subunit במצב הפעיל של הקולטן. הכריכה שלהם מרוקנת את הפלורופור ומייצרת אות פלואורסצנטי שניתן לזהות לאורך זמן45. יתר על כן, מחקרים שונים חקרו אינטראקציות חלבון השומנים ואת התפקיד של חלבונים חישה או ייצוב עקמומיות ממברנה60,61, וניצול גישת GUV אפשרי יכול להיות יתרון מרכזי.

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לשלב GPCRs לתוך הממברנה של GUVs באמצעות מערכת הידרוג'ל אגרוז שונה17,42. יתר על כן, בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו, השיטה שלנו יכולה להיות מתאימה IMPs שיכול לשאת חשיפה לטווח קצר 30-40 °C (50 °F). בקצרה, אנו מפיצים סרט דק של אגרוז בשילוב עם שברי ממברנה המכילים את GPCR של עניין. לאחר ג'לציה של שכבה זו, אנו מפקידים תמיסת שומנים על גבי agarose ולאפשר ממס להתאדות. התייבשות של המערכת בוצעה אז עם חוצץ מימי, וכתוצאה מכך היווצרות של GUVs עם חלבון משולב bilayer השומנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תיוג חלבונים

  1. אפשר NHS-רודמין, שברי ממברנה 5-HT1A , ועמוד התפלה אחד 7 K MWCO ספין להתפלש בטמפרטורת החדר.
  2. יש להמיס 1 מ"ג NHS-רודמין ב-100 מיקרו-לן של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
  3. הוסף 5 μL של פתרון 1 M נתרן ביקרבונט כדי להגדיל את ה- pH של פתרון 5-HT1AR ל- pH 8.
  4. הוסף 3.66 μL של פתרון NHS-רודמין ל 50 μL של פתרון 5-HT1AR ו pipette בעדינות למעלה ולמטה בצינור microcentrifuge.
    הערה: יש להקפיד על עודף טוחן של NHS-רודמין פי 10 לפחות.
  5. שומרים על התערובת מוגנת מפני אור ומניחים על סיבוב בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
  6. לשטוף עמוד ספין 7 k MWCO עם 200 μL של תמיסת מלח פוספט 1x (1x PBS) שלוש פעמים במשך 1.5 דקות ב 1.5 RCF עבור כל לשטוף.
  7. מוסיפים את החלבון המסומן לעמודה אחת ומאזנים את הכמות בצינור מיקרוצנטריפוגה אחר.
  8. ספין את החלבון המסומן פעם אחת במשך 5 דקות ב 1.5 RCF.
  9. קח ספקטרום UV-vis באמצעות ספקטרופוטומטר ננו טיפה ב 280 ננומטר ו 554 ננומטר ולחשב את יעילות תיוג בעקבות המדריך של היצרן.
  10. יש לאחסן את החלבון המסומן המכוסה ב-5 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. הפתרון יציב כשבוע לאחר התיוג.

2. ג'וונים עם 5-HT 1A משולבים בממברנה

  1. הכנת חומרים וריאגנטים
    1. אפשרו לחלבון, שומנים ו-BSA (אלבומין בסרום בקר) להתכווצ לטמפרטורת החדר.
    2. במהלך תקופה זו, לנקות את כיסויים על ידי הצבת אותם מתנול sonicating במשך 30 דקות ב 40 °C (50 °F). ודא כי מתנול מכסה לחלוטין את כיסויים ואת מפלס המים באמבט המים הוא מעל הרמה של מתנול במיכל.
      הערה: מתנול רעיל ויש לטפל בו במכסה כימי מתאים.
    3. יבש את מתנול עודף על כיסויים עם זרם עדין של אוויר. מניחים את מתלה כיסוי מכוסה בתנור 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להבטיח כי כיסויים עודפים להתייבש.
    4. התחל בתהליך ניקוי הפלזמה. ראשית, מניחים את כיסויי הניקוי לתוך מנקה הפלזמה ולסגור את שסתום צריכת האוויר כדי לפנות את כל האוויר בתוך התא.
    5. לאחר התא הוא תחת ואקום, לנקות את כיסויים במשך 5 דקות באמצעות הגדרת כוח RF גבוהה ואקום כמעט שלם, עם צריכת אוויר קלה בלבד לתוך תא הוואקום. כדי להבטיח את הרמה הנכונה של פלזמה, להתאים את הפתיחה של תא ואקום כך צבע התוצאה של הפלזמה הוא יציב, ורוד בהיר.
      הערה: זה חיוני בעת שימוש באוויר כי הפלזמה נשארת צבע ורוד בהיר למשך שלב הטיפול בפלזמה, כמו צבע סגול כהה יותר מציין כי יש כמות לא נכונה של אוויר בתא ויביא לטיפול פלזמה תת-אופטימלית.
    6. לאחר 5 דקות עברו, לכבות את כוח RF ולשחרר את הוואקום.
      הערה: עם ההסרה מתא הפלזמה, אנא ודא כי כיסויים להישאר מכוסה.
  2. הכנת הידרוג'ל
    1. שלבו 6 מ"ג של אגרת התכה נמוכה במיוחד עם 300 מיקרו-אל של מים אולטרה-תותים (כלומר, 2% (w/v) אגרוז).
      הערה: 2% אגרוז ישמש לייצור GUV ללא חלבון. פתרון אגרוז ניתן לשמור על 45 °C (55 °F) במשך יומיים.
    2. שלב 9 מ"ג של אגרוז בטמפרטורה נמוכה במיוחד עם 300 μL של מים אולטרה-תותים עבור 3 w / v% agarose על ידי כפי שהוכן בשלב 3.1. 3% אגרוז ישמש לייצור חלבונים משולבים GUVs.
    3. מערבולת את הפתרון לזמן קצר לפני הצבתם על בלוק חום 90 °C (90 °F) במשך 10 דקות. לאחר מכן, מערבולת הצינור שוב לפני העברתו בלוק חום 45 °C (45 °F) כדי לשמור אותו בצורה מותכת עד לשימוש נוסף.
  3. אגרוז וערבוב חלבונים
    1. לערבב 21 μL של 3% agarose עם 7 μL של 5-HT1AR קרום שברים. פיפטה למעלה ולמטה לאט פעמים רבות כדי להבטיח ערבוב הולם. לאחר מכן, דגירה ב 45 °C (55 °F) במשך 1 דקות.
  4. תצהיר הידרוג'ל ושומנים
    1. עבור GUVs ללא חלבון: לעשות סרט דק על כיסויים פלזמה טריים ניקה באמצעות 20 μL של 2% agarose. שחררו במהירות כיסוי נוסף על גבי טיפת האגורוז והחליקו בעדינות את הכיסויים לגזרים כדי ליצור סרט דק על שני הכיסויים.
      הערה: שלב זה הוא מסובך בכך שהחלקה של טיפה חייבת להתרחש בזמן agarose הוא עדיין בצורה מותכת.
    2. עבור GUVs משולב חלבון: Pipette תערובת חלבון / אגרוז למעלה ולמטה עוד פעם אחת, ולאחר מכן להפקיד 20 μL של 2% agarose על כיסוי ניקה פלזמה. בצע את הוראות הליהוק החלקה כמתואר לעיל.
    3. אפשר לאגורוז לג'ל מוגן מפני אור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להפקיד את השומנים טיפה על גבי שכבת אגרוז. השתמש בסך הכל 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל של 1-פלמיטויל-2-oleoyl-גלייצרו-3-פוסכולין (POPC) עם 0.4 מול% 1,2-דיפלמיטויל-sn-גליצרי-3-פוספוטנולמין (DPPE) המסומן עם ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (או תערובת שומנים של עניין) בכלורופורם על גבי סרט אגרוז. להפקיד את הטיפות באמצעות מחט כרומטוגרפיה גז ולהפיץ טיפה אחת בכל פעם סביב באמצעות זרם אוויר עדין.
      הערה: יש צורך בזהירות עם צעד זה כדי להפוך שכבה אחידה יחסית של שומנים על גבי הידרוג'ל. כמו כן, כלורופורם רעיל ויש לטפל בו במכסה כימי מתאים.
    5. להרכיב את תאי סייקס-מור (S-M) על ידי הצבת טבעת O על גבי כיסוי, ולאחר מכן הצבת הרכיב העליון של התא על גבי טבעת O. השתמש במפתח שסופק על ידי היצרן כדי להרכיב את התא על ידי הברגת רכיבי התא יחד כדי לאטום את התא ולמנוע כל דליפה.
      הערה: יש להדק את החלק העליון של התא על טבעת ה- O אך יש צורך בזהירות כדי להבטיח שהכיסוי יישאר שלם מכיוון שהכיסוי יכול להיסדק אם טבעת ה- O אינה יושבת כראוי בתא. כמו כן, ודא כי התא אטום חזק מספיק, כך התא לא לדלוף כאשר פתרון הנפיחות מתווסף. אי הידוק התא מספיק יגרום דליפות ואובדן מדגם.
  5. נפיחות וקציר של שלפוחיות
    1. יש להרטיב את המערכת כולה על ידי צנרת עדינה של 450 μL של 200 מ"ר סוכרוז ב-1x PBS והקשה עדינה על התאים כדי להבטיח כיסוי חיץ הולם של שכבות השומנים ההידרוג'ל.
      הערה: פתרון סוכרוז ניתן להחליף עם מאגר rehydration המכיל בדיקות ביולוגיות של עניין.
    2. מניחים את התאים ב 45 °C (5 °F) לכסות את החלק העליון של התא עם כיסוי כדי למנוע אידוי. אפשר לדגימה להתנפח, מוגן מפני פסולת ואור במשך שעה.
    3. הוסף 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל BSA במים אולטרה-דור לכל באר של צלחת 96 באר שנועדה לשמש. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה.
    4. יש לשטוף שלוש פעמים במים טהורים במיוחד ופעם אחת עם סוכרוז 200 מ"מ ב-1x PBS.
    5. לבסוף, להוסיף 200 mM של גלוקוז ב 1x PBS עד לתוספת של פתרון מדגם GUV.
      הערה: BSA שימש לחסימת ספיעת GUV.
    6. לאחר מתן ההידרוג'ל להתנפח, לנער בעדינות ולהקיש על התא כדי לנטרל את כל GUVs שעשוי להישאר מחובר משטח הידרוג'ל. לאחר מכן, בזהירות pipette את פתרון GUV-סוכרוז.
      הערה: כצעד אופציונלי כדי להבטיח שכל שללנות מנותקות מפני השטח, בעדינות pipette חלק מתלה סוכרוז בחזרה על פני ההידרוג'ל.
    7. העבר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge שהוכן בעבר המכיל 700 μL של גלוקוז 200 mM ב 1x PBS.
      הערה: שיפוע הצפיפות יוביל ליישב את שלל לתחתית צינור הצנטריפוגה.
    8. אפשר שלשלות להסתפק במשך שעה נוספת כדי להבטיח כי שלל יכול לשקוע לתחתית צינור microcentrifuge, המאפשר איסוף אופטימלי.
    9. לאחר יישוב של GUVs גלוקוז, להעביר 300 μL מתחתית צינור הצנטריפוגה (שלפוחיות התיישבו) לתוך צלחת 96-באר מוכן מראש שטופלו BSA כדי לבחון את שלפוחיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.
      הערה: הקפד להימנע מהתחתית של צינור microcentrifuge כדי למזער את כמות הפסולת שנאספו במדגם הסופי.
  6. תבדוק את הדגימות מתחת למיקרוסקופ.
    1. הברק לייזר 488 ננומטר על המדגם (המאפשר לנו לדמיין את הממברנה, כמו bilayer כבר מסומן עם ATTO-488-DPPE).
    2. הברק לייזר 561 ננומטר על המדגם (המאפשר לנו לדמיין את החלבון, שכן הוא כבר מסומן עם NHS-רודמין).
      הערה: יש צורך בזהירות בעת הדמיית המדגם כמו פוטוקסידיקציה יכול לערער את שלפוחיות. שלל נצפו באותו היום.

figure-protocol-1
איור 1: איור של שלבי הפרוטוקול המפורטים. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ריכוז החלבון נמדד, ומידת התיוג חושבה כיחס הטוחנת בין הצבע לחלבון להיות 1:1. על ידי בחינת ה- GUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הצלחנו לאשר היווצרות מוצלחת ושילוב חלבונים של שלשלות. השומנים סומנו עם 0.4 מול% ATTO 488-DPPE, והחלבון תויג באופן קוולנטי באמצעות שינוי רודמין NHS-אסתר של אמינים ראשוניים. איור 2a ואיור 2b מציגים ארסית משולבת חלבונים בערוצי ATTO 488 ורודמין, בהתאמה. כל המיקרוגרפים תוקנו בזרם כהה ושפל השדה תוקנו. איור 2c

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זיהינו שני שלבים קריטיים להצלחת הפרוטוקול הכולל: טיפול בפלזמה ותצהיר שומנים. ניקוי פלזמה של כיסויים חיוני כדי להבטיח שיש כיסוי נאות והידבקות של הידרוג'ל אגרוז לכיסוי הזכוכית. ניקוי פלזמה משיג שני דברים: ראשית, הוא מסיר עקבות של חומר אורגני מפני השטח של הזכוכית; שנית, הוא מפעיל את משטח הכיסוי, ומאפשר עלייה בגשימות ככל שהידופיליות משטח הזכוכית עולה 62,63. נגיעה במשטח הכיסוי לאחר הפלזמה תנטרל ותזהם את המשטח האולטרה-דק ומומלץ מאוד נגדו. ההמלצה שלנו היא לגעת רק בקצוות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים למת'יו בלוסר על דיון ועצות יקרות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד למחקר ימי (N00014-16-1-2382) והקרן הלאומית למדע (PHY-1915017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids, אלבסטר, AL850375C-25mg
  מיקרוסקופ הפוך TI-Eclipseניקון, מלוויל, ניו יורקליקוי חמה Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ טבעות O סיליקון ODחותם סטרלינג & אספקה, נפטון, IN5-003-8770
16 סיביות Cascade II 512 מצלמת מכשיר מצמד מטען כפולאלקטרונים פוטומטריה, הנטינגטון ביץ', קליפורניה  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL850457C-25mg
50 mW לייזרים במצב מוצק ב-488 ננומטר ומסנן פליטה מרוכז ב-525 ננומטר, ו-561 ננומטר עם מסנן פליטה מרוכז ב-595 ננומטרקוהרנטי, סנטה קלרה, קליפורניה488/561-50-LS
5-HT1AR שברי ממברנהפרקין אלמר, וולת'אם, MARBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE)ATTO-TEC, זיגן, גרמניהAD 488-155
מנקה פלזמה ספסל עליוןהאריק פלזמה, איתקה, ניו יורקPDC-32G
סרום בקר אלבומין (BSA)סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MOA9418
כלורופורם (CHCl3)Millipore Sigma, ברלינגטון, MACX1055
כולסטרול (כול)סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MOC8667-5G
קורנינג 96-באר שטוח שקוף תחתון, קורנינג, ניו יורק3904
Elmasonic E-Series E15H אולטרסאונדאלמה, סינגן, גרמניה[כבר לא נמכר באתר הראשי]
גלוקוזסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MOG7528
מתנול (MeOH)Millipore Sigma, ברלינגטון, MAMX0485
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MAND-1000
NHS-RhodamineThermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA46406
מי מלח חוצץ פוספט (PBS) (10x PBS)קורנינג, קורנינג, ניו יורק21-040
ראש קונפוקלי CSUX מסתובב דיסקיוקוגאווה, טוקיו, יפןCSU-X1
כיסויי זכוכית סטנדרטיים 25 מ"מ מס' 1ChemGlass, Vineland, NJCLS-1760
סוכרוזסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MOS7903
Sykes-Moore chambersBellco, Vineland, NJ1943-11111
טמפרטורת התכה נמוכה במיוחד אגרוזסיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MOA5030
VWR Heatblock אנלוגיVWR International, רדנור, פנסילבניה[כבר לא נמכר באתר הראשי]
VWR Tube RotatorVWR International, Radnor, PA10136-084
עמודי התפלה של Zeba Spin, 7K MWCO, 0.5 מ"לThermo Fisher Scientific, Waltham, MA89882

מקורות

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622(2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804(2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101(2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33(2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270(2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004(2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

שלפוחיות ענק חד-שכבתיותחלבונים ממברנתיים אינטגרלייםאינטראקציות חלבון-ממברנהנפיחות הידרוג'לשילוב חלבונים ממברנתייםקולטן 5-HT1Aממברנות ביומימטיותלוקליזציה של חלבונים
בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.