פרוטוקול זה משתמש נפיחות agarose כטכניקה רבת עוצמה להכללה לשילוב חלבונים ממברנה אינטגרלית (IMPs) לתוך שלפוחיות שומנים חד-צדדיות ענקיות (GUVs), כפי שתואר כאן עבור שחזור של חלבון קולטן סרוטונין האדם 1A (5-HT1AR), אחד מסוגי קולטני חלבון G חשובים מבחינה פרמקולוגית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בניית מודל ממברנות שומנים המשלבות קולטנים מצמידים של חלבון G (GPCRs)
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חקירות במבחנה איתנה של המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה אינטגרליים היוו אתגר בשל המורכבות של קרום הפלזמה והגורמים הרבים המשפיעים על התנהגות החלבון בתאים חיים. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם מערכת מודל מימטיקה וטופילית מאוד במבחנה לחקירת אינטראקציות בין קרום חלבון וחיקור התנהגות חלבונים באופן מדויק ותלוי גירוי. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה זולה ויעילה לייצור GUVs עם קולטן סרוטונין 1A האנושי (5-HT1AR) משולב ביציבות בממברנה. אנו מייצרים ג'וונים בשיטת נפיחות הידרוג'ל מותאמת; על ידי הפקדת סרט שומנים על גבי תערובת של agarose ו 5-HT1AR ולאחר מכן לחות המערכת כולה, שלל ניתן ליצור עם כוון כראוי ופונקציונלי 5-HT1AR משולב לתוך הממברנה. לאחר מכן ניתן להשתמש ב- GUVs אלה כדי לבחון אינטראקציות בין קרום חלבון והתנהגות לוקליזציה באמצעות מיקרוסקופיה. בסופו של דבר, פרוטוקול זה יכול לקדם את הבנתנו את הפונקציונליות של חלבוני ממברנה אינטגרליים, ומספק תובנה פיזיולוגית עמוקה.
מבוא
ממברנות מודל סינתטי הם כלים רבי עוצמה בחקירה של המאפיינים הבסיסיים ואת הפונקציות של biomembranes. שלטי ענק חד-צדדי (GUVs) הם אחת הפלטפורמות הבולטות ביותר לחקר מגוון תכונות קרום פלזמה וניתן להנדסן כדי לחקות מצבים פיזיולוגיים שונים1,2,3,4,5,6,7,8. הוא מבוסס היטב כי קרום הפלזמה והארגון שלה לשחק תפקיד מפתח בהמון של תהליכים תאיים, כגון העברת אותות, הידבקות, אנדוציטוזיס, ותחבורה9,10,11,12,13,14,15.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תיוג חלבונים
- אפשר NHS-רודמין, שברי ממברנה 5-HT1A , ועמוד התפלה אחד 7 K MWCO ספין להתפלש בטמפרטורת החדר.
- יש להמיס 1 מ"ג NHS-רודמין ב-100 מיקרו-לן של דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
- הוסף 5 μL של פתרון 1 M נתרן ביקרבונט כדי להגדיל את ה- pH של פתרון 5-HT1AR ל- pH 8.
- הוסף 3.66 μL של פתרון NHS-רודמין ל 50 μL של פתרון 5-HT1AR ו pipette בעדינות למעלה ולמטה בצינור microcentrifuge.
הערה: יש להקפיד על עודף טוחן של NHS-רודמין פי 10 לפחות. - שומרים על התערובת מוגנת מפני אור ומניחים על סיבוב בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
- לשטוף עמוד ספין 7 k MWCO עם 200 μL של תמיסת מלח פוספט 1x (1x PBS) שלוש פעמים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ריכוז החלבון נמדד, ומידת התיוג חושבה כיחס הטוחנת בין הצבע לחלבון להיות 1:1. על ידי בחינת ה- GUVs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, הצלחנו לאשר היווצרות מוצלחת ושילוב חלבונים של שלשלות. השומנים סומנו עם 0.4 מול% ATTO 488-DPPE, והחלבון תויג באופן קוולנטי באמצעות שינוי רודמין NHS-אסתר של אמינים ראשוניים. איור 2a ואיור 2b מציגים ארסית משולבת חלבונים בערוצי ATTO 488 ורודמין, בהתאמה. כל המיקרוגרפים תוקנו בזרם כהה ושפל השדה תוקנו. איור 2c
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זיהינו שני שלבים קריטיים להצלחת הפרוטוקול הכולל: טיפול בפלזמה ותצהיר שומנים. ניקוי פלזמה של כיסויים חיוני כדי להבטיח שיש כיסוי נאות והידבקות של הידרוג'ל אגרוז לכיסוי הזכוכית. ניקוי פלזמה משיג שני דברים: ראשית, הוא מסיר עקבות של חומר אורגני מפני השטח של הזכוכית; שנית, הוא מפעיל את משטח הכיסוי, ומאפשר עלייה בגשימות ככל שהידופיליות משטח הזכוכית עולה 62,63. נגיעה במשטח הכיסוי לאחר הפלזמה תנטרל ותזהם את המשטח האולטרה-דק ומומלץ מאוד נגדו. ההמלצה שלנו היא לגעת רק בקצוות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים למת'יו בלוסר על דיון ועצות יקרות ערך. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד למחקר ימי (N00014-16-1-2382) והקרן הלאומית למדע (PHY-1915017).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, אלבסטר, AL | 850375C-25mg | |
| מיקרוסקופ הפוך TI-Eclipse | ניקון, מלוויל, ניו יורק | ליקוי חמה Ti | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ ID, 1″ טבעות O סיליקון OD | חותם סטרלינג & אספקה, נפטון, IN | 5-003-8770 | |
| 16 סיביות Cascade II 512 מצלמת מכשיר מצמד מטען כפול | אלקטרונים פוטומטריה, הנטינגטון ביץ', קליפורניה | Cascade II 512 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 50 mW לייזרים במצב מוצק ב-488 ננומטר ומסנן פליטה מרוכז ב-525 ננומטר, ו-561 ננומטר עם מסנן פליטה מרוכז ב-595 ננומטר | קוהרנטי, סנטה קלרה, קליפורניה | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR שברי ממברנה | פרקין אלמר, וולת'אם, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, זיגן, גרמניה | AD 488-155 | |
| מנקה פלזמה ספסל עליון | האריק פלזמה, איתקה, ניו יורק | PDC-32G | |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO | A9418 | |
| כלורופורם (CHCl3) | Millipore Sigma, ברלינגטון, MA | CX1055 | |
| כולסטרול (כול) | סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO | C8667-5G | |
| קורנינג 96-באר שטוח שקוף תחתון | , קורנינג, ניו יורק | 3904 | |
| Elmasonic E-Series E15H אולטרסאונד | אלמה, סינגן, גרמניה | [כבר לא נמכר באתר הראשי] | |
| גלוקוז | סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO | G7528 | |
| מתנול (MeOH) | Millipore Sigma, ברלינגטון, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA | ND-1000 | |
| NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA | 46406 | |
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS) (10x PBS) | קורנינג, קורנינג, ניו יורק | 21-040 | |
| ראש קונפוקלי CSUX מסתובב דיסק | יוקוגאווה, טוקיו, יפן | CSU-X1 | |
| כיסויי זכוכית סטנדרטיים 25 מ"מ מס' 1 | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO | S7903 | |
| Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| טמפרטורת התכה נמוכה במיוחד אגרוז | סיגמא אולדריץ', סנט לואיס, MO | A5030 | |
| VWR Heatblock אנלוגי | VWR International, רדנור, פנסילבניה | [כבר לא נמכר באתר הראשי] | |
| VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| עמודי התפלה של Zeba Spin, 7K MWCO, 0.5 מ"ל | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
מקורות
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
- Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane q....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
