הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת הידרולאזות נוקלאוזיד טריפוספט בטוקסופלזמה גונדי ו-Neospora caninum להקרנה בתפוקה גבוהה באמצעות זרוע רובוט

816 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62874

⸱

22 ביולי 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Education and Research Center for Pharmaceutical Sciences, Faculty of Pharmacy, Osaka Medical and Pharmaceutical University, 2Independent Scholar, Tokyo, Japan, 3Division of Functional Genomics and Therapeutic Innovation, Research Center for Advanced Genomics, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University, 4School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, School of Materials and Engineering, Wuhan University of Technology, 5Data Science Center, Jichi Medical University, 6Department of Cardiovascular Medicine, The Cardiovascular Institute, 7Department of Immunology and Parasitology, University of Occupational and Environmental Health, 8Division of Cardiology and Metabolism, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 9Department of Cardiovascular Medicine, Graduate School of Biomedical Sciences, Nagasaki University Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

זיהומי טוקסופלזמה גונדי ו-Neospora caninum נמצאים בבני אדם ובבעלי חיים ומובילים לבעיות בריאותיות חמורות. שני הטפילים חולקים הידרולזים דומים של נוקלאוזיד טריפוספט וממלאים תפקידים חשובים בהתפשטות ובהישרדות. הקמנו בדיקה ברמה גבוהה של האנזימים הדורשים שימוש בזרוע רובוטית.

תקציר

טפילי פרוטוזואים מדביקים בני אדם ובעלי חיים רבים בעלי דם חם. טוקסופלזמה גונדי, טפיל פרוטוזואי עיקרי, נמצא בדרך כלל בחולים חיוביים ל-HIV, מושתלי איברים ונשים בהריון, וכתוצאה מכך המצב הבריאותי החמור, טוקסופלזמוזיס. פרוטוזואן עיקרי נוסף, Neospora caninum, הנושא קווי דמיון רבים לטוקסופלזמה גונדי , גורם למחלות קשות בבעלי חיים, וכך גם אנצפלומליטיס ומיוזיטיס-פולירדיקוליטיס בכלבים ופרות, וכתוצאה מכך עגלים מתים. כל אלה הציגו נוקלאוזידים טריפוספטים הידרולאזים דומים (NTPase). ל-Neospora caninum יש NcNTPase, בעוד שלטוקסופלזמה גונדי יש TgNTPase-I. האנזימים נחשבים כממלאים תפקידים מכריעים בהתפשטות ובהישרדות. על מנת לבסס תרכובות ו/או תמציות המונעות זיהום פרוטוזואה, כיוונו את האנזימים הללו לגילוי תרופות. השלב הבא היה לקבוע בדיקה חדשנית, רגישה מאוד ומדויקת ביותר על ידי שילוב של בדיקת אנזים ביוכימי קונבנציונלית עם בדיקת פלואורסצנט לקביעת תכולת ADP. כמו כן, אימתנו כי הבדיקה החדשה עומדת בקריטריונים לביצוע סקר תפוקה גבוהה (HTS) בשני האנזימים הפרוטוזואניים. ביצענו HTS, זיהינו 19 תרכובות ושש תמציות משתי ספריות תרכובות סינתטיות וספריית תמציות שמקורן בחיידקים ימיים, בהתאמה. במחקר זה הוצג הסבר מפורט כיצד לבצע HTS, כולל מידע על הכנת ריאגנטים, מכשירים, זרוע רובוט וכו '.

מבוא

הרובוטיקה התבססה ככלים מתוחכמים ורבי עוצמה להשגת פריצות דרך משמעותיות בתחומים שונים מעבר לתעשייה והנדסת ייצור, כגון ביוכימיה, ביולוגיה מולקולרית ומחקר קליני, ובמיוחד HTS 1,2,3. טוקסופלזמה גונדי הוא טפיל עיקרי ואאוקריוט טפילי חד-תאי4 הגורם לבעיות בריאותיות חמורות בבני אדם5 ובבעלי חיים הומותרמיים רבים4, וכתוצאה מכך זיהומים המובילים לטוקסופלזמוזיס, מצב חמור במיוחד בחולי איידס6, מושתלי איברים7 ונשים הרות8. Neospora caninum השייך ל-Phylum Apicomplexa9 מדביק בעיקר כלבים ופרות6, מה שגורם לדלקת המוח ודלקת שריר-פולירדיקוליטיס בכלבים10,11 ולהפלות בפרות12,13. יתר על כן, Neospora caninum מציג קווי דמיון מורפולוגיים ופילוגנטיים קרובים לטוקסופלזמה גונדי 9,14. בנוסף, יש להם נוקלאוזיד טריפוספט הידרולאז (NTPase; EC3.6.1.15)14. האנזימים שונים למדי מאקטו-ATPase14 קונבנציונלי. טפילים אלה מייצרים כמות ניכרת של חלבוני NTPase, 2%-8% מכלל החלבון וממלאים תפקיד חשוב כאנזימים רדומים בשלב15 של הטכיזואיט שלהם. יש לציין כי בגרגירי הפרשה צפופים, אלה מתעבים16 ומופרשים לתוך הוואקואול הטפילי16. כאופי אנזימטי ביוכימי, NTPase מופעל על ידי דיתיותרייטול17. צפוי כי המשרים כגון תרכובת הדיתיול, אנזים לא מזוהה כגון דיתיול-דיסולפיד אוקסידורדוקטאז, ואחר מציגים את אותו אופי. הם עדיין לא זוהו בטפילים. עם זאת, האנזים ממלא תפקיד חשוב בשחרור טכיזואיט מתאי מארח נגועים17.

לטוקסופלזמה גונדי יש שני איזופורמים של NTPase18: אנזים מסוג I TgNTPase-I, ואנזים מסוג II TgNTPase-II18. הראשון משתמש באופן מועדף בנוקלאוזידים של טריפוספט כסובסטרט18. האחרון מבצע הידרוליזה של נוקלאוזידים טריפוספט ודיפוספט18. ההומולוגיה היא 97% ברמות חומצות אמינו18. ל-Neospora caninum יש גם אורתולוג של TgNTPase-I בשם NcNTPase19. ההומולוגיה היא 73% ברמות חומצות אמינו19. פרופ' אסאי ופרופ' הרדה יצרו רקומביננטים של שני ה-NTPase באמצעות E. coli. ושינו את המוטציות הפעילות מבחינה מכוננת של אלה כפי שדווח קודם לכן20. הם העניקו במתנה לשני המוטאנטים הפעילים. שני האנזימים יכולים להמיר ATP ל-ADP במבחנה20. לאחרונה מדדנו את הפעילות של NTPase באמצעות תכולת ADP שעברה הידרוליזה על ידי האנזימים. לבסוף, הצלחנו לבסס את הבדיקה הסטנדרטית הגבוהה באמצעות תהליך קביעת תכולת ADP עם שילוב של פלואורסצנטיות ותגובה אנזימטית כפי שדווח בעבר21,22. עשינו גם בדיקות סקר בתפוקה גבוהה (HTS)22.

מחקר זה מציג נהלים מפורטים של מבחן חדש ברמת דיוק גבוהה וטווח דינמי21 והסבר מפורט כיצד להכין ריאגנטים למדידת פעילות האנזים ולפתח עוצמת פלואורסצנט באמצעות זרוע רובוטית עבור HTS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ביטוי וטיהור של TgNTPase-I ו-NcNTPase רקומביננטיים

  1. הכן את הביטוי פלסמיד והכנס אותו ל - E. coli. זן BL21.
    הערה: מידע מפורט על מבנים ונהלים מוצג בדוח קודם14. במחקר זה, הן מוטציות TgNTPase-I והן NcNTPase הפעילות באופן מכונן, הוענקו במתנה על ידי פרופ' אסאי ופרופ' הראדה.

2. הכנה והנחת תמיסת תגובה ביו-פלואורסצנטית על הצלחת

  1. הכן תמיסת תגובה ביו-פלואורסצנטית פי 2 כמתואר בטבלה 1 עבור 2 מ"ל של תערובת מאסטר לבדיקה של 400 בארות בפורמט של 384 בארות.
  2. הכן תמיסות מלאי באמצעות מים מזוקקים (DW) עבור כל ריכוז מצוין למעט רזזורין ו-N-אתילמלימיד. ממיסים את שני הריאגנטים הנותרים עם DMSO בריכוז המתאים. לאחר מכן, אחסן את הריאגנטים בטמפרטורה של -30 מעלות צלזיוס עד למועד ביצוע הניסויים.
  3. הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת תגובה ביו-פלואורסצנטית פי 2 לכל אחת מ-368 הבארות (פורמט 384 בארות).
    הערה: הצלחת הראשונה משמשת כמאגר כדי שיהיה מספיק מהמגיב לביצוע ניסויים פעמיים.

3. שים תרכובות בדיקה או תמציות על תחתית כל באר בצלחת הבדיקה

  1. שים 0.5 מיקרוליטר מכל תרכובת על תחתית הצלחת באמצעות זרוע רובוט מלוח האם של הספרייה, כולל תרכובות בדיקה.
  2. הוסף 0.5 מיקרוליטר של DMSO לבקרה שלילית וחיובית כאחד.

4. הכנת תערובת תגובת אנזימים ותחילת התגובה

  1. הכן תמיסת תגובת אנזים כמפורט בטבלה 2.
  2. מוסיפים NTPase (הריכוז הסופי הוא 0.0002 מיקרוגרם/מ"ל) ל-50 מ"ל מתערובת תגובת האנזים, מערבבים במהירות ומעבירים למאגר פלסטיק.
  3. המשך להזריק בו זמנית 4.5 מיקרוליטר לכל באר למעט קו הבקרה השלילי באמצעות זרוע הרובוט.
  4. הוסף את אותה כמות של תערובת תגובת האנזים עם PBS במקום האנזים שקדם להזרקה בו זמנית.
  5. מניחים את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

5. לבצע מדידה בזמן אמת של פעילויות אנזימטיות באמצעות קורא מיקרו-פלטות

  1. לאחר 10 דקות של דגירה, הוסף בו זמנית 5 מיקרוליטר של תמיסת תגובה ביו-פלואורסצנטית פי 2 לכל באר מיד באמצעות זרוע הרובוט.
  2. עצור זמנית את זרוע הרובוט כדי להחזיק את התמיסה בכל קצה מעל המיקום שבו יש למקם את הצלחת.
  3. לאחר שלוחית הבדיקה נמצאת במקומה, הפעל מחדש את זרוע הרובוט.
    הערה: כדי למנוע רוויה של ה-ADP שנוצר, מדוד מיד את עוצמת הפלואורסצנט.
  4. סובב במהירות (200 x גרם למשך דקה) את הצלחת, והנח את הצלחת בקורא הצלחות.
  5. התחל את המדידה בזמן אמת של הקרינה ב-540 ננומטר/590 ננומטר (עירור/פליטה) בכל דקה למשך שעה.

6. ניתוח תוצאות

  1. לחשב ערכים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM) מהדגימות המצוינות והמשוכפלות בכל קבוצת ניסוי; שכפל ניסויים כדי להבטיח עקביות.
  2. בצע מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t של סטודנט.
  3. חשב ערכים כמובהקים סטטיסטית אם ערכי P הם P < 0.05.
  4. חשב יחס אות לרקע (S/B), יחס אות לרעש (S/N) וגורם Z' באמצעות הנוסחאות הבאות:
    S/B = ליגנד ממוצע/רכב ממוצע
    S/N = (ליגנד ממוצע - רכב ממוצע)/רכב סטיית תקן
    Z'-factor = 1 - (3 x ליגנד סטיית תקן + רכב סטיית תקן)/(ליגנד ממוצע - רכב ממוצע)
  5. ודא שגורם S/B, S/N ו-Z גדול מ-3, 10 ו-0.5, בהתאמה.
    הערה: ודא אם כל ניסוי עומד בקריטריון הכללי המספיק לביצוע HTS כפי שצוין בדוחות קודמים23,24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עקרון הבדיקה מסוכם באיור משלים 1 ומבוסס על דוח קודם12,18. הבדיקה תוכננה בפורמט של 384 בארות, כפי שמוצג באיור 1. הקווים הימניים והשמאליים הקיצונים נמנעו על הצלחת. שני הקווים שליד הקווים השמאליים והימניים הרחוקים שימשו אז כבקרה שלילית ובקרה חיובית עם או בלי האנזים, בהתאמה (n = 16). זה איפשר לבחון בקלות את 320 התרכובות שעל הצלחת. איור 1B מציין את הצלחת, המיכל, זרוע הרובוט, קצותיו וקורא המיק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצלחנו לבסס טווח דינמי גבוה ובדיקת דיוק חדשה עם שילוב של בדיקת אנזים קלאסית ובדיקת פלואורסצנט עבור ADP, שהיא התוצר הסופי באמצעות ATPase, כולל Tg ו-Nc ATPase22. על מנת לבצע HTS, חשוב שלבדיקה יהיו ערכים טובים יותר של גורם S/B, S/N ו-Z' מאשר בדיקת אנזים קלאסית15,22. בנוסף, השמטת השלב של עצירת תגובת האנזים עם חומצה כגון HCl ושימוש במדידה בזמן אמת של הקרינה בכל הבארות כל דקה למשך שעה, מביאה לטיפול קל יותר והטעי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרס כלכלי במחקר זה.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הפלטפורמה לגילוי תרופות, אינפורמטיקה ומדעי החיים המבניים, מענק סיוע למחקר מדעי (C) מהאגודה היפנית לקידום המדע (JSPS-21K06566). המחברים מודים מקרב לב לאסאי (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קיאו) ולהראדה (המכון הטכנולוגי של קיוטו) ולסטיבן סטראטון על המתנה לשני מוטאנטים פעילים רקומביננטיים של NTPase ועל תרומתו בהכנת כתב היד הזה, בהתאמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תחנת עבודה 12 שלבים EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXזרוע רובוט מערכת צנרת
384 טיפים לבארBiotech Co., Ltd.
ADP-hexokinaseבהתאמה אישית Asahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPשמרים אוריינטליים, ושות', בע"מ45140000
BSAוואקו תעשיות כימיות טהורות בע"מ011-15144
דיאפוראז-ייוניטיקה בע"מDi-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P דהידרוגנאזשמרים אוריינטליים, ושות', בע"מ306-50143
גלוקוזוואקו תעשיות כימיות טהורות בע"מ049-31165
Greiner 384 באר מיקרו-צלחת לא מחייבת באר רדודה שחור#784900
HEPESWako תעשיות כימיות טהורות, בע"מ.342-01375
מ"ג(CH<תת>3COO)<תת>2וואקו תעשיות כימיות טהורות בע"מ130-00095
NADPשמרים מזרחיים ושות', בע"מ44332000
N-ethylmaleimideWako תעשיות כימיות טהורות בע"מ056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.קורא מיקרו-פלטותPHERAstar FS
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well מאגריםS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
טריטון X-100נקלאי טש, בע"מברקוד 35501-02
Multimode בפרופיל נמוך

מקורות

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34(2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218(2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121(2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194(2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352(2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437(2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161(2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Toxoplasma gondiiבדיקת אנזיםבדיקה פלואורסצנטיתזיהוי ADPגילוי תרופותאוטומציה באמצעות זרוע רובוטיתטפילים פרוטוזואים

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.