ייצור עכבר אנושי באמצעות השתלת קפסולת כליה תימית, הזרקת תאי CD34+ ואספקת ציטוקינים

סיכום

מודלים של עכברים אנושיים מספקים ייצוג מדויק יותר של המיקרו-סביבה החיסונית האנושית. כתב יד זה מתאר את התהליך שבו מודלים אלה נוצרים באמצעות השתלת כליה של בלוטת התימוס האנושית, הזרקת תאי CD34⁺ אנושיים ואספקה ממוקדת של טרנסגנים של ציטוקינים אנושיים כדי לקדם התפשטות והתמיינות של תאי CD34⁺ .

תקציר

מודלים של בעלי חיים מספקים תרגום חיוני בין מחקר ביו-רפואי in vitro למחקר in vivo . מודלים של עכברים מואנשים מספקים גשר בייצוג של מערכות אנושיות, ובכך מאפשרים מחקר מדויק יותר של פתוגנזה, סמנים ביולוגיים ושאילתות מדעיות רבות אחרות. בשיטה זו המתוארת, עכברי NOD-scid IL2Rγnull (NSG) חסרי חיסון מושתלים בתימוס אוטולוגי, מוזרקים עם תאי CD34⁺ שמקורם בכבד ואחריהם סדרה של משלוחי ציטוקינים מוזרקים. בניגוד למודלים אחרים בעלי אופי דומה, המודל המתואר כאן מקדם בנייה מחדש משופרת של תאים חיסוניים על ידי העברת ציטוקינים וגורמי גדילה באמצעות טרנסגנים המקודדים בווקטורים מבוססי DNA AAV8 או pMV101. יתר על כן, הוא מציע יציבות לטווח ארוך עם עכברים משוחזרים בעלי תוחלת חיים ממוצעת של 30 שבועות לאחר זריקות CD34⁺ . באמצעות מודל זה, אנו מקווים לספק שיטה יציבה ומשפיעה לחקר אימונותרפיה ומחלות אנושיות במודל עכברי, ובכך להדגים את הצורך במודלים פרה-קליניים מנבאים.

מבוא

בעוד שמודלים של בעלי חיים יצרו הבנה עמוקה יותר של מערכות תאיות ומולקולריות, האתגר נותר בהבהרת המורכבויות של מערכות ספציפיות למין, כגון חסינות, פיזיולוגיה ותחומים אחרים של פתולוגיה. פרימטים לא אנושיים (NHP), כמו שימפנזים, שימשו לאורך ההיסטוריה כדי לפצות על הפערים הנדרשים במחקר המודלים; עם זאת, מודל ה-NHP יכול להיות יקר למדי ובלתי נגיש, במיוחד מכיוון שהשימוש בהם נאסר באירופה¹.

לאחר הליך השתלה מוצלח, מערכת העכברים משכפלת את מערכת החיסון האנושית, כפי שהוכח באמצעות אכלוס מחדש של איברי הלימפה. התפתחותם של עכברים עם מערכת חיסון אנושית מתפקדת מספקת את ההזדמנות לערוך מחקר תרגומי על חסינות אנושית במגוון הקשרים. עכברים חסרי חיסון המושתלים בתאים ורקמות אנושיות שיכולים לשכפל בהצלחה מערכת חיסון אנושית פעילה מקלים על חקר המטופואיזה, חסינות, טיפול גנטי², מחלות זיהומיות³, סרטן⁴ ורפואה רגנרטיבית⁵. הקבוצה שלנו וחלק ממשתפי הפעולה שלנו פרסמו תוצאות באמצעות מודל זה המדגים מודלים פרה-קליניים של מלנומה עורית⁶. מודל זה הוא רב תכליתי מספיק כדי להיות מיושם באינספור תחומים מעבר להקשר של מחקר מלנומה ואימונותרפיה.

תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) משמשים בדרך כלל להאנשה מכיוון שהם מביאים לבנייה מחדש חזקה של תאי T, שיש להם תפקידים מבוססים בסבילות חיסונית; עם זאת, בגלל שיעור ההתחדשות העצמית הנמוך שלהם והשיעור הגבוה של תאים בוגרים המחויבים לשושלת, PBMCs מוחלפים לעתים קרובות במוצרים מבוססי תאי גזע אנושיים (HSC), שניתן להפיק מכבד עוברי⁷. בשילוב עם מוצרי HSC נגזרים אלה, תוספת השתלת התימוס האנושי מתחת לכמוסות הכליה של עכברי NSG יוצרת מערכת המסוגלת לתמוך בהתפתחות תאי T אנושיים. מודל זה, המכונה מח עצם-כבד-תימוס (BLT), הוא יתרון רב מכיוון שהוא מאפשר המטופואיזיס רב-שושלתית, חינוך תאי T בתימוס האוטולוגי והגבלת HLA⁸.

המודל המוצע בכתב יד זה הוא מודל BLT מותאם עם אספקת ציטוקינים נוספים. ציטוקינים פרו-דלקתיים הוכחו כמחזקים את היכולות של תאי חיסון אפקטיביים, במיוחד באמצעות אימונותרפיה מבוססת IL-15⁹. לימפוציטים CD45⁺ נצפים בדם ההיקפי של עכברים מואנשים (עכברי Hu) כ-8-12 שבועות לאחר הזרקת תאי CD34⁺ אנושיים, ומציגים עלייה ניכרת בבנייה מחדש בהשוואה לדם במחזור של עכברי NSG רגילים. באמצעות וקטור Adeno-Associated להעברת IL-3, IL-7 ו-GM-CSF אנושיים, רמות תאי CD45⁺ אנושיים עלו במחזור הדם בהשוואה לעכברים שאינם מקבלים את הציטוקינים. התוספת של ציטוקינים DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT ו-THPO) משפרת את תאי T ואת התמיינות התאים המיאלואידים¹⁰. התוספת של אספקת ציטוקינים מבדילה שיטה זו בין מודלים אחרים של עכברי Hu, כפי שנתמך על ידי נתונים שפורסמו¹⁰.

פיתוח מודל זה עם תגובה חיסונית אנושית מולדת ונרכשת איפשר לפרסם נתונים לגבי עמידות לטיפול ומיקרו-סביבת הגידול¹⁰. בתנאי שמעבדות יכולות לגשת לדגימות רקמה כדי להשתמש בשיטה זו; למודל Hu-mice זה יש פוטנציאל גדול למעבדות אחרות לחקור תחומים דומים וכן להתרחב לתחומים אחרים של אימונותרפיה ומחקרים פרה-קליניים.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים הקשורים לשימוש בבעלי חיים מנוטרים מקרוב על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ומשתמשים בבעלי חיים (IACUC) של מכון וויסטאר. המעבדה מקפידה על ההנחיות שנקבעו על ידי ועדה זו והווטרינר המטפל כדי להבטיח את בריאותם, בטיחותם ורווחתם של בעלי החיים המעורבים. לפני ביצוע פרוטוקול זה, נדרש אישור וטרינר ו-IACUC, ואנשים עשויים להיות בעלי וריאציות בטכניקות הכירורגיות הספציפיות ובטיפול בבעלי חיים בהשוואה לפרוטוקול בהתאם לעצת הצדדים הנ"ל המעורבים ברווחת בעלי חיים.

הערה: ניתן להקפיא דגימות רקמה עד שהן מוכנות לשימוש. בנוסף, ניתן לבצע בידוד CD34⁺ באותו יום או למחרת כמו ניתוח השתלת הכליה. מידע זה יודיע מתי יוזרק בוסולפן: אם מתכוונים לבצע ניתוח באותו יום של בידוד, יש להזריק בוסולפן מראש כהכנה לרקמה מקבלת. לטפל בשלושים עכברי NSG נקבות בני 5-7 שבועות עם 30 מ"ג/ק"ג (100 מיקרוליטר, PBS 1x) של תרופה טרייה מדלדלת מיאלו; בוסולפן הזריק IP 24 שעות לפני הניתוח.

1. בידוד תאי CD34⁺

1. הכן את תמיסת העיכול על ידי המסת 100 מ"ג קולגנאז/דיספאז ב-50 מ"ל RPMI1640. השתמש במסנן ואקום של 0.22 מיקרומטר כדי לעקר את תמיסת העיכול.
2. כבד עוברי (>גיל 20 שבועות) מסופק ב-50 מ"ל של מדיום RPMI1640. שאפו והשליכו את המדיה, והשאירו 10 מ"ל בתוך הצינור המכיל את הכבד.
3. שטפו את הטישו עם 45 מ"ל של RPMI1640 + 100 מיקרוגרם/מ"ל של האנטיביוטיקה פרימוצין פעמיים בצינור חרוטי של 50 מ"ל, ושאבו את המדיה בין כל שטיפה. הקפד לתת לרקמה להתיישב בתחתית הצינור לפני שאיבת האמצע.
4. מניחים מסננת רקמות סטרילית בכוס סטרילית של 200 מ"ל.
5. יוצקים את כבד העובר דרך המסננת ומשתמשים בקצה מזרק פלסטיק סטרילי של 10 מ"ל כדי לטחון את הרקמה.
6. שטפו את תאי הכבד שנותרו במסננת באמצעות 50 מ"ל של RPMI1640 + 100 מיקרוגרם/מ"ל של האנטיביוטיקה פרימוצין ואחריה 50 מ"ל של RPMI1640 קולגנאז/דיספאז מדיה (2 מ"ג/מ"ל). הכוס בנפח 200 מ"ל מכילה כעת את RPMI1640 עם פרימוצין, RPMI1640 קולגנאז/דיספאז וכבד הומוגני.
7. מכניסים את התערובת לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל ודוגרים אותם באמבט מים (37 מעלות צלזיוס) למשך שעה. לנער את הצינורות החרוטיים כל 15 דקות.
8. הוסף 15 מ"ל של פיקול בארבעה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
9. שכבו בזהירות את תמיסת הכבד ההומוגנית מעל, והפיצו כ-35 מ"ל בין כל צינור. אל תפריע לממשק.
10. הנח את הצינורות בצנטריפוגה וסובב ב-800 x גרם למשך שעה עם תאוצה/בלם מינימלית.
11. הסר את הצינורות מהצנטריפוגה ואסוף את התאים מהממשק (10-15 מ"ל) לשני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
12. הוסף PBS 1x עד 50 מ"ל כדי לשטוף את הגלולה, וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
13. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של מאגר ליזה ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) ודגרו למשך 5-10 דקות. מלאו את הצינור ב-1x PBS.
14. ספרו ידנית את התאים תחת המיקרוסקופ באמצעות טריפן כחול והמוציטומטר. צנטריפוגה של התאים ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
    הערה: ניתן להזריק את התאים החד-גרעיניים של הכבד ישירות מכאן אם רוצים, למשל, אם ספירת התאים נמוכה מ-50 מיליון תאים.
15. שואב את ה-PBS והשהה מחדש את גלולת התא ב-300 מיקרוליטר של מאגר ההפרדה (2 מ"מ EDTA, 5 מיקרוגרם/מ"ל של BSA ב-1x PBS) עבור 100 x 10⁶ תאים או פחות. עבור יותר מ-100 x 10⁶ תאים, השתמש ביחס המבוסס על כמות התאים לעיל כדי לקבוע את כמות המאגר (כלומר, הכפל את התאים, הכפל את המאגר).
16. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב חוסם FcR ודגר 2-5 דקות.
17. מוסיפים 100 מיקרוליטר של נוגדנים למיקרו-חרוזים CD34, מערבבים היטב ודוגרים על קרח למשך 30 דקות; יש לנער ידנית באופן מכני לאחר 15 דקות.
18. הוסף 7-10 מ"ל של חוצץ ההפרדה וסנן דרך מסנני תאים של 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר בסדר זה.
19. הנח מפריד תאים מבוסס עמודות במפריד מגנטי. הנח צינור חרוטי של 15 מ"ל מתחת למפריד כדי לאסוף את הזרימה והמאגר.
20. מלא את העמודה ב-500 מיקרוליטר של מאגר ההפרדה.
21. יוצקים את מתלה התא דרך העמודה.
22. מלאו את העמוד בזרימה ובמאגר שנאסף בצינור החרוטי.
23. שטפו את העמוד 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר ההפרדה.
24. השליכו את הזרימה והחליפו את הצינור בצינור פוליסטירן בנפח 15 מ"ל.
25. מלאו את העמודה ב -1 מ"ל של מאגר ההפרדה, הסירו את העמוד מהמגנט ושטפו את הבוכנה כלפי מטה בלחיצה אחת.
26. ספור את התאים והשהה מחדש ב-PBS 1x להזרקה. מניחים על קרח עד השימוש.

2. עיבוד תימי

1. שטפו את בלוטת התימוס האוטולוגית (>גיל 20 שבועות) על ידי הוספת 5-8 מ"ל RPMI1640, אפשרו לרקמה להתייצב. הסר בזהירות את המדיום על ידי ואקום תוך הימנעות ממגע עם התימוס. חזור על זה פעם נוספת.
2. השעו ב-10 מ"ל טמפרטורת החדר RPMI1640 עם פרימוצין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
3. העבירו את בלוטת התימוס לצלחת פטרי שטופלה ברקמות. ודאו שבלוטת התימוס מצופה במלואו במצע פרימוצין.
4. דגירה למשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שואב את ה-Primocin-media. שטפו את בלוטת התימוס עם 5-8 מ"ל RPMI1640, הסירו את המדיה בוואקום וחזרו על כך פעם נוספת.
6. השעו את התימוס ב 5-8 מ"ל של RPMI1640.
7. הכן את התימוס המודגר להשתלה על ידי חיתוך מקטעים בגודל 1 מ"מ על 2 מ"מ באמצעות שני אזמלים.
   הערה: זה יושתל בעכברים; לכן, ודא שניתן לשאוב את פרוסות התימוס הן פנימה והן החוצה מהמזרק וממחט המילטון 22 G המחוברת בקלות יחסית.

3. השתלת קפסולה תת כלייתית והזרקת תאי CD34

1. בדוק את העכברים לבריאותם הכללית לפני הניתוח. גלח את העכברים כדי לחשוף אזור (כ-3 אינץ' x 2 אינץ') בגוף הצדדי השמאלי.
2. להרדים את העכברים באמצעות איזופלורן (אינדוקציה 5%, תחזוקה 2%-3%) בתא ולאחר מכן להעביר עכברים בודדים מהתא לשלב כירורגי עם חרוט אף.
3. חטאו את האזור המגולח עם כלורוהקסדין ומקלוני הכנה לאלכוהול. הקפידו על הרדמה פרטנית באמצעות בדיקת צביטה.
4. בצע חתך גדול (5-7 מ"מ) אחורי, לרוחב עמוד השדרה של העכבר, וקפל את העור לאחור.
5. ודא שבשלב זה, הטחול נראה מתחת לפאשיה. בצע חתך קטן יותר של ~2 מ"מ בפאשיה. ודא שהחתך קטן ככל האפשר תוך מתן אפשרות לחשיפה מלאה של הכליה.
6. קבע את מיקום החתך הזה, זיהוי חזותי של הטחול ושימוש בו כסמן לכליה, שאינו נראה לעין.
   הערה: כליית העכבר ממוקמת מאחורי קבוצת שומן ברבע הצפון-מזרחי לטחול.
7. מכאן, מקם את היד (המנתח) מתחת לצד העכבר מול החתך ולחץ כדי לחשוף את הכליה. מקם מחדש את כל השומן כדי לחשוף את הכליה במלואה.
8. השתמש באצבעות באותה יד כדי לייצב את הכליה החשופה. במידת הצורך, השתמש ב-PBS סטרילי 1x כדי לשמן את הכליה החשופה.
   הערה: חשוב לציין כי על המנתח להשתמש באצבעות שונות מאלו שטיפלו בצד העכבר כדי להחזיק את הכליה כדי לשמור על סטריליות. יש להתייעץ עם הווטרינר של המכון לגבי שמירה נכונה על סטריליות.
9. במקביל, תן לעוזר להכין מזרק קהה עם רקמת התימוס העוברי. מצצו בעדינות 2-3 גושי תימוס בגודל בינוני (1 מ"מ על 2 מ"מ) עם מדיה מינימלית לקצה המחט ולאחר מכן העבירו אותם למנתח לביצוע ההליך.
   הערה: מספר גושי התימוס תלוי בגודל הרקמה, בדרך כלל 2 גושים מספיקים כדי לקבל עכברים אנושיים.
10. תן למנתח להכניס את המחט דרך הקצה הזנבי של קפסולת הכליה עד שמגיעים לקצה הדיסטלי (~2 מ"מ), עד לנקודה שבה המחט נראית לעין, אך היא אינה פורצת את הצד הגולגולתי של קפסולת הכליה. תן לעוזר לצלול את המזרק.
11. הנח את הכליה, יחד עם כל שומן חשוף, בחזרה לצפק. יש להניח תפר נספג אחד (מידה 4) ולסגור את החתך השטחי עם דבק וטרינר.
12. לאחר הניתוח, יש לתת מנה של התרופה לשיכוך כאבים, 25 מיקרוליטר של בופרנורפין בשחרור מושהה (1 מ"ג/מ"ל) באמצעות הזרקה תת עורית (1 מ"ג/ק"ג).
13. בדוק שהעכברים מתחילים להתאושש תוך 5 דקות לאחר הניתוח.
14. בין הכלובים יש להחליף את הכפפות ולעקר את המכשירים במעקר חרוזי זכוכית.
15. בין 1-3 שעות לאחר הניתוח, יש להזריק 100 מיקרוליטר של תאי CD34⁺ אנושיים (כ-100,000 תאים) לעכבר על ידי הזרקה תוך ורידית (IV).
16. ערכו בדיקת בריאות כללית לעכברים לאחר סיום הניתוח (בדרך כלל שעתיים לאחר הכלוב הראשון), ולאחר מכן 24 שעות ו-48 שעות לאחר מכן.
17. אם יש חריגות כלשהן בנטייה או בסימנים חיוניים, עקוב אחר העכברים עוד יותר. לאחר שהם עברו את המחסומים הללו, עקוב אחר העכברים בצורה פחות קפדנית (2x-3x בשבוע).
18. שבוע לאחר הניתוח, יש להזריק לעכברים 100 מיקרוליטר של ציטוקין אנושי AAV8 (IL-3, IL-7 ו-GM-CSF; 2 x 10⁹ עותקי גנום/מ"ל).
19. שבועיים לאחר הניתוח, בצע זריקות IM של הפלסמיד DNA Combo II.
    1. השתמש במכונת אלקטרופורציה לביצוע הזרקות IM של פלסמיד DNA Combo II: SCF, FLT3, CKIT ו-THPO. עבור כל עכבר, שלב 25 מיקרוליטר של SCF (2 מ"ג/מ"ל), 25 מיקרוליטר של THPO (2 מ"ג/מ"ל), 25 מיקרוליטר של FLT3 (2 מ"ג/מ"ל) ו-25 מיקרוליטר של CKIT (10 מ"ג/מ"ל).
    2. בצע הזרקה אחת לכל רגל אחורית, כלומר שתיים בסך הכל, עם 50 מיקרוליטר לכל רגל, ולאחר מכן אלקטרופורציה בכל אתר הזרקה.

תוצאות

לאחר ניתוח מוצלח וזריקות מתאימות לאחר הניתוח, ניתן לאשר התמיינות CD34⁺ באמצעות ציטומטריית זרימה. כ-8 שבועות לאחר הניתוח, עכברים מדממים כהכנה ל-FACS, וחוזרים על עצמם כל שבועיים עד להשגת סף ספציפי של תאי חיסון אנושיים כפי שתואר קודם לכן¹⁰. בקצרה, 100 מ"ל דם נאספו בצינורות איסוף דם מצופים בליתיום והפרין. לאחר ליזה של כדוריות דם אדומות באמצעות מאגר ליזה ACK, התאים נשטפו עם מאגר FACS (מי מלח עם פוספט, 2% FBS ו-0.1% נתרן אזיד) וצנטריפוגה. לאחר מכן כדור התא הושעה מחדש ב-100 מ"ל של מאגר FACS וה...

דיון

כתב יד זה מתאר כאן יצירת עכברים מואנשים באמצעות תימוס עוברי אנושי שהושתל מתחת לקפסולת הכליה ולאחר מכן הזרקת CD34⁺ כדי ליצור מחדש מערכת חיסון אנושית.

בעוד שהפרוטוקול מתפקד כדי ליצור את המודל הטוב ביותר האפשרי, שלבים מסוימים חיוניים לכדאיות. לדוגמה, במהלך בידוד CD34⁺ , חיוני שמי שמסתכל דרך המיקרוסקופ יוכל לזהות תאי CD34⁺ . למרות שזה עשוי להיראות מיותר, מכונות ספירה אוטומטיות לא תמיד מזהות תאים אלה בשל המורפולוגיה שלהם, והמכונה עצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מאגר ליזה ACK	Life Technologies Corporation
BD Microcontainer	BD		צינורות איסוף דם
Busulfan	Sigma	B2635-25g	תרופה מקרינה;
לאור CD34 Microbeads	Miltenyi Biotec	130-046-702	ערכת חרוזי נוגדנים; מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
CKIT	Aldevron	ציטוקין מותאם אישית	; מאוחסן ב-20 מעלות; C
Collagenase/Dispase	Roche Diagnostics	11097113001	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
FcR מגיב חוסם	Miltenyi Biotec	130-046-702	ערכת חרוזי נוגדנים; מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
רקמת עובר (כבד ובלוטת התימוס)	משאבי		נמסר באותו יום או בלילה
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03	מאוחסן בטמפרטורת החדר
FLT3	Aldevron	125964	ציטוקין; מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
מלקחיים	שונים
מחט מזרק המילטון	שונים		שונים 22 גרם; 3 נקודות; אורך 2 אינץ'
המוסטטים עמודי		שונים
	Miltenyi Biotec	130-042-201	מפריד מגנטי
PBS	Gibco	14190-136	מאוחסן בטמפרטורת החדר
פרימוצין	אנטיביוטיקה Invivogen	amt-pm1	; מאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות; C
RPMI	Corning	10-040-CM	מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
SCF	Aldevron	125962	ציטוקין; מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
מספריים כירורגיים	שונים
THPO	Aldevron	125963	ציטוקין; מאוחסן ב -20 & deg; C
צלחת פטרי מטופלת ברקמות	Corning	430167
דבק VetBond	3M	1469SB	דבק
Visorb תפר	Stoelting Co	5046	תפר נספג, גודל 4, חיתוך 19 מ"מ

רגיש מדע ביולוגי מתקדמים MS