מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) או ספרואידיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מציעות את היתרונות של תוצאות דיפרנציאציה משופרות ומדרגיות. במאמר זה, אנו מתארים אסטרטגיה להיווצרות חזקה וניתנת לשחזור של כדוריות hPSC שבהן נעשה שימוש בהתקן מיקוד זרימה צירית משותפת כדי ללכוד hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה. תמיסת הליבה הכילה תרחיף של תאים בודדים של hPSCs ונעשתה צמיגת על ידי שילוב של פולי(אתילן גליקול) בעל משקל מולקולרי גבוה (PEG) ומדיה הדרגתית של צפיפות. זרם הפגזים כלל PEG-4 זרוע-מלימיד או PEG-4-Mal וזרם לצד זרם הליבה לעבר שני צמתי שמן רצופים. היווצרות טיפות התרחשה בצומת השמן הראשון כאשר תמיסת המעטפת עוטפת את עצמה סביב הליבה. הצלבה כימית של הקונכייה התרחשה בצומת השמן השני על ידי החדרת צלב די-תיול (1,4-dithiothreitol או DTT) לטיפות אלה. ההצלבה מגיבה עם קבוצות פונקציונליות של מאלימיד באמצעות כימיה של קליקים, וכתוצאה מכך נוצרת מעטפת הידרוג'ל סביב המיקרו-קפסולות. טכנולוגיית האנקפסולציה שלנו ייצרה כמוסות בקוטר 400 מיקרומטר בקצב של 10 כמוסות בשנייה. הכמוסות שהתקבלו היו בעלות קליפת הידרוג'ל ולייבה מימית שאפשרה לתאים בודדים להתקבץ במהירות לאגרגטים וליצור ספרואידים. תהליך האנקפסולציה לא השפיע לרעה על הכדאיות של hPSCs, כאשר הכדאיות >95% נצפתה 3 ימים לאחר האנקפסולציה. לשם השוואה, hPSCs עטופים במיקרו-חלקיקי ג'ל מוצקים (ללא ליבה מימית) לא יצרו כדוריות והיו בעלי כדאיות <50% 3 ימים לאחר האנקפסולציה. היווצרות כדורית של hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של קליפת ליבה התרחשה תוך 48 שעות לאחר האנקפסולציה, כאשר קוטר הספרואידים הוא פונקציה של צפיפות חיסון התא. באופן כללי, טכנולוגיית האנקפסולציה המיקרופלואידית המתוארת בפרוטוקול זה התאימה היטב לאנקפסולציה של hPSCs ולהיווצרות ספרואידים.
מבוא
יש עניין רב בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בשל הפלוריפוטנטיות המשופרת ופוטנציאל ההתמיינות שמעניקה תבנית תרבית זו 1,2,3. hPSCs נוצרים בדרך כלל לספרואידים או לפורמטים אחרים של תרבית תלת-ממדית באמצעות ביו-ריאקטורים, מיקרו-וולים, הידרוג'לים ופיגומים פולימריים 4,5,6. אנקפסולציה מציעה אמצעי נוסף לארגון hPSCs בודדים לספרואידים. לאחר עטיפת כדורי hPSC ניתן לטפל בקלות ולהעבירם ללוחות מיקרוטיטר לצורך התמיינות, מידול מחלות או ניסויים בבדיקת תרופות. עטיפת hPSCs בשכבת הידרוג'ל גם מגנה על התאים מפני נזקי גזירה ומאפשרת תרבית ספרואידים בביוריאקטור בקצבים גבוהים של ערבוב7.
המתודולוגיה שלנו לאנקפסולציה של תאי גזע התפתחה עם הזמן. ראשית, התמקדנו במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל מוצקים והדגמנו אנקפסולציה וטיפוח מוצלחים של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs)8. עם זאת, צוין כי לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הייתה יכולת קיום נמוכה כאשר הם עטופים במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל כאלה, ככל הנראה בשל הצורך הגדול יותר של תאים אלה ליצור מחדש את המגעים בין התא לתאים לאחר האנקפסולציה. סברנו כי מיקרו-קפסולות הטרוגניות, בעלות ליבה מימית, עשויות להתאים יותר לתמצות של תאים המסתמכים על התבססות מחדש מהירה של מגעים בין תאים לתאים. הרעיון של מכשיר מיקרופלואידי ממוקד זרימה צירית משותפת ליצירת מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה/הידרוג'ל מימית הותאם מ-He et al.9, אך במקום אלגינט שהופעל בגישה המקורית, הידרוג'ל מבוסס PEG שולב במעטפת. הדגמנו לראשונה אנקפסולציה מוצלחת והיווצרות כדורית של הפטוציטים ראשוניים במיקרו-קפסולות של קליפת ליבה10 ולאחרונה תיארנו אנקפסולציה של תאי hES ו-iPS7. כפי שמתואר באיור 1A, הקפסולות מיוצרות בהתקן למיקוד זרימה שבו זרמי הזרימה של המעטפת והליבה עוברים מצד לצד לזרימה קו-צירית לפני שהם נפלטים לתוך שלב השמן. זרימת הליבה מכילה תאים ותוספים המגבירים את צמיגות התמיסה (PEG MW 35kD שאינו תגובתי ויודיקסנול - שם מסחרי OptiPrep) בעוד שזרם הקליפה מכיל מולקולות תגובתיות (PEG-4-Mal). זרם זרימה קו-צירית רציפה מחולק בנפרד לטיפות השומרות על ארכיטקטורת מעטפת הליבה. מבנה הליבה-מעטפת הופך לקבוע על ידי חשיפה ל-di-thiol crosslinker (DTT), המגיב עם PEG-4-Mal באמצעות כימיה של קליקים ומביא להיווצרות של עור או מעטפת הידרוג'ל דקים (כ-10 מיקרומטר). לאחר שהאמולסיה נשברת והקפסולות מועברות לשלב מימי, מולקולות של PEG מתפזרות מהליבה ומוחלפות במולקולות מים. התוצאה היא מיקרו-קפסולות של ליבה מימית ומעטפת הידרוג'ל.
להלן הוראות שלב אחר שלב כיצד ליצור התקנים מיקרופלואידיים, כיצד להכין תאים וכיצד לבצע אנקפסולציה של hPSCs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור מכשירים
- בצע את העיצובים עבור התקן המיקרו-אנקפסולציה והתקן הדיסוציאציה באמצעות תוכנת CAD10,11.
- ספין-ציפו את שלוש השכבות של הפוטורסיסט SU-8 ברצף על פרוסת סיליקון (איור 2A) כדי להשיג מבנים בגבהים הרצויים: 60, 100 ו-150 מיקרומטר.
הערה: התהליך עבור התבניות העליונות והתחתונות זהה.- ספין ציפו פרוסת סיליקון נקייה בקוטר 10 ס"מ עם פוטוריסט שלילי SU-8 2025 ב-1,100 סל"ד כדי ליצור את שכבת ה-60 מיקרומטר הראשונה. לאחר אפייה רכה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על צלחת חמה, חשפו את התבנית באמצעות קשת ללא מסיכה על ידי העלאת קובץ העיצוב של תבנית ערוץ הליבה למחשב μPG 101. לאחר מכן, המשיכו עם האפייה לאחר החשיפה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ובטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- סובב את השכבה השנייה של SU-8 2025 (40 מיקרומטר) ב-1,500 סל"ד וחשוף על-ידי העלאת קובץ ה-CAD המתאים לתבנית ערוץ המעטפת.
הערה: אפיות רכות ולאחר חשיפה היו דומות לשלב הקודם. - ספין מצפה את השכבה השלישית של SU-8 2025 ב-1,400 סל"ד כדי להגיע לגובה של 50 מיקרומטר ולחזור על התהליך הנ"ל אך לחשוף את המבנים של שלב השמן.
- פתח את התבנית עם כל שלוש השכבות בצעד אחד על ידי טבילה במפתח SU-8 עד שכל הפוטורסיסט שלא נחשף יוסר.
- קשה לאפות את התבנית על צלחת חמה ב 160 °C (66 °F) במשך 10 דקות כדי לשפר את ההדבקה ולאטום סדקים קלים שיכולים להופיע לאחר הפיתוח.
- יש לחשוף את העובש לכלורוטרימתילסילן כדי למנוע הדבקת אלסטומר בשלב הבא ולהניח אותה בכלי פטרי בקוטר 15 ס"מ עד לשימוש.
- הכינו את תבנית התקן הדיסוציאציה באותו אופן, כפי שמתואר באיור 1D ובאיור 2B. ספין מצפה שכבה אחת של פוטוריסט SU-8 על פרוסת סיליקון, כפי שתואר קודם לכן בשלב 1.2.3, כדי להשיג מבנים עם הגובה הרצוי: 50 מיקרומטר. נהלו את האפייה הרכה שלאחר החשיפה, ההתפתחות והאפייה הקשה בדומה לשלב הקודם.
הערה: מערך של עמודים בצורת משולש כיסה את כל התא, כאשר המרווח בין העמודים הלך ופחת ככל שרוחב התא ירד לכיוון השקע. עמודי המשולש היו 200 מיקרומטרים לכל צד עם גובה שנע בין 400 מיקרומטר (בכניסה) ל-30 מיקרומטר (בשקע). - הכן את התבניות על ידי ליתוגרפיה רכה באמצעות פולידימתילסילוקסן (PDMS).
- ערבבו את בסיס האלסטומר PDMS ואת חומר הריפוי האלסטומר ביחס של 10:1 w/w בצנטריפוגה פלנטרית. יוצקים את התערובת הן על תבניות מאסטר של מיקרו-אנקפסולציה והן על תבנית ראשית של דיסוציאציה כדי ליצור שכבה של 3-4 מ"מ.
הערה: מספיקה תערובת של 50 גרם של בסיס אלסטומר עם 5 גרם של חומר ריפוי כדי לכסות תבנית ראשית בעובי 3 מ"מ. - הניחו את צלחות הפטרי המכילות את התבניות במפענח ואקום למשך 15 דקות כדי לנטרל את הגז של ה-PDMS הלא מרוסן.
- העבירו את כלי הפטרי לתנור ואופים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות.
- מוציאים את תבניות המאסטר מהתנור ומאפשרים להן להתקרר. באמצעות סכין מדויקת, חתכו בזהירות את ה-PDMS בהתאם לצורת הוופל וקילפו את חלקי ה-PDMS מהתבנית הראשית.
- חותכים את לוחות ה-PDMS על ידי חיתוך הקצוות של כל מכשיר עם אזמל, ואז מנקבים יציאות נוזלות כניסה/שקע בהתקן הדיסוציאציה ורק בהתקן המיקרופלואידי העליון באמצעות מחטי נירוסטה. מכסים את המכשירים בקלטת קסם כדי למנוע זיהום.
הערה: מד המחט הוא 14 G ו- 15 G עבור יציאות כניסה ויציאה, בהתאמה. - לצורך ההדבקה, טפלו בצדדים המעוצבים של חלקי ה-PDMS העליונים והתחתונים עם פלזמהO 2 על תחריט פלזמה למשך 2 דקות.
- יישרו את שני חלקי ה-PDMS מתחת לסטריאוסקופ לאחר הוספת שכבה מפרידה דקה של מים מזוקקים ישירות במיקרו-ערוצים (2 μL).
- הניחו את מכשיר ה-PDMS המיושר בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים את ההידבקות ולהחזיר את ה-PDMS למצבו ההידרופובי המקורי. אחסן את המכשירים עד לשימוש נוסף.
הערה: התוצאה היא התקן ממוקד זרימה קואקסיאלי עם שלושה גבהים שונים של 120 מיקרומטר לליבה, 200 מיקרומטר עבור מעטפת ו- 300 מיקרומטר עבור תעלות שמן. - על מנת להשתמש במכשיר מיד לאחר הדבקת הפלזמה, להזריק בזהירות אך בתקיפות 30 μL של תמיסת ציפוי הידרופובית לתעלות הנוזליות כדי להשיג ציפוי הידרופובי. לאחר מכן, מיד לטהר את האוויר לתוך התעלות עד שלא שאריות של תמיסת הציפוי ההידרופובית נצפו במכשיר.
- קשרו את מכשיר הדיסוציאציה על ידי טיפול תחילה בצד המעוצב של המכשיר ובזכוכית החלקה מנוקה עם פלזמת O2 למשך 2 דקות, ולאחר מכן הרכיבו אותם לריפוי נוסף בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: ניתן לאחסן התקנים עד לשימוש נוסף.
- ערבבו את בסיס האלסטומר PDMS ואת חומר הריפוי האלסטומר ביחס של 10:1 w/w בצנטריפוגה פלנטרית. יוצקים את התערובת הן על תבניות מאסטר של מיקרו-אנקפסולציה והן על תבנית ראשית של דיסוציאציה כדי ליצור שכבה של 3-4 מ"מ.
2. הכנת פתרונות
- פתרונות מלאי. ראשית, הכינו פתרונות מלאי (פתרונות מרוכזים) שידוללו לריכוזים נמוכים יותר לשימוש בפועל.
הערה: פתרונות מלאי משמשים כדי לחסוך זמן הכנה, לחסוך בחומרים, לצמצם את שטח האחסון ולשפר את הדיוק בעת הכנת פתרון עובד בריכוזים נמוכים יותר.- הכן 30 מ"ל של תמיסת ליבה של 2x (16% PEG ו- 34% מדיית גרדיאנט צפיפות): ערבב 4.8 גרם של 35 kDa PEG, 10.2 מ"ל של מדיית שיפוע צפיפות ו- 19.8 מ"ל של מדיית DMEM/F12. סנן פתרון ליבה זה באמצעות מסנן מזרקים של 0.22 מיקרומטר.
- הכינו 50 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% חומרים פעילי שטח: ערבבו 48.5 מ"ל של שמן מינרלי ו-1.5 מ"ל של חומרים פעילי שטח. שמור במצב סטרילי לאחר סינון דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- הכן 50 מ"ל של שמן מינרלי עם 0.5% פעילי שטח: לערבב 49.75 מ"ל של שמן מינרלי ו 0.25 מ"ל של פעילי שטח. שמור במצב סטרילי.
- הכן 1 M Dithiotheritol (DTT): להמיס 1.5425 גרם של DTT במים מזוקקים 10 מ"ל. שמור במצב סטרילי.
- מכינים 1 M טריאתנולמין (TEA): מוסיפים 66.4 μL של TEA ב-433.6 μL של מים מזוקקים. שמור במצב סטרילי.
- הכן 1% Pluronic F127 (PF127): להמיס 100 מ"ג של PF127 ב 10 מ"ל של מים מזוקקים. שמור במצב סטרילי.
- פתרונות עבודה
- הכינו תחליב קרוסלינקר על ידי ערבוב של 4.5 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% פעילי שטח ו-300 μL של 1 M DTT (יחס של 1:15). וורטקס את הפתרון במשך 2 דקות ו sonicate במשך 45-60 דקות באמבטיה קולית ב 20 °C (86 °F). טען פתרון זה למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
הערה: תחליב נוצר על ידי תערובת שמן/מים. - הכן תמיסת שמן מיגון על ידי העמסת השמן המינרלי בחומר פעילי שטח של 0.5% למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
- הכן תמיסת מעטפת (8% w/v PEG-4-Mal ו-15 mM TEA) על ידי הוספת 32 מ"ג של PEG-4-Mal ב-400 μL של 1x DPBS כדי ליצור תמיסה של 8% w/v, ומערבולת את התמיסה למשך 2 דקות. לאחר מכן, הוסף 6 μL של 1 M TEA (ריכוז סופי 15 mM TEA). לבסוף, צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 5 דקות באמצעות מסנן ספין ולשמור אותו בחושך על הנדנדה במשך 30 דקות. לאחר מכן, טען פתרון זה למזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G.
הערה: השאירו את מיכל PEG-4-Mal לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לפני פתיחת המכסה, ופוצצו גז N2 כדי להחליף את ה-O2 ב-N2 לפני סגירת המכסה. וורטקס TEA לפני הוספת הפתרון.
- הכינו תחליב קרוסלינקר על ידי ערבוב של 4.5 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% פעילי שטח ו-300 μL של 1 M DTT (יחס של 1:15). וורטקס את הפתרון במשך 2 דקות ו sonicate במשך 45-60 דקות באמבטיה קולית ב 20 °C (86 °F). טען פתרון זה למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
- הכן את מתלה התא בתמיסת הליבה
- טפלו ב-hPSCs עם טריפסין למשך 5 עד 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאסוף אותם מצלחות. מרווים את הטריפסין עם המדיום לאחר ניתוק התא, ולאחר מכן מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את תרחיף התא בתפזורת (400 x g, 5 דקות). בזהירות לשאוף את supernatant ולאחר מכן resuspened את גלולת התא באמצעות נפח מינימלי של מדיום גדילה. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
הערה: אליקוטים טיפוסיים של תאים מכילים תאים בגודל 12-20 x 106 ומספיקים כדי ליצור 400 μL של תמיסת הליבה. - קח 12-20 x 106 תאים מתרחיף התא בתפזורת והצנטריפוגה של תרחיף התא / המדיה (400 x גרם, 5 דקות).
- שאפו בזהירות מדיה מכדור התא. לאחר מכן, הוסיפו 200 μL מדיה ו-200 μL של תמיסת PEG 2x (ריכוז סופי 30-50 x 106 תאים/מ"ל) וערבבו בעדינות.
הערה: ריכוזי תאים נמוכים (פחות מ-20 x 106 תאים/מ"ל) גרמו לכמוסות ריקות רבות. - הוסף 30 μL של 1% PF127 לפתרון.
- הכנס מוט מערבל מיקרו (2 מ"מ x 7 מ"מ) למזרק של 1 מ"ל, ולאחר מכן טען את התא המכיל תמיסת ליבה למזרק עם מחט של 27 גרם. שמור על הפתרון קר עם קרח במהלך כל תהליך האנקפסולציה.
3. מערך ניסיוני
- מניחים מכשיר טיפות PDMS מלוכד, ארבע חתיכות באורך 20 ס"מ וחתיכה אחת של מיקרו-צינורות כניסה באורך 5 ס"מ (0.38 מ"מ I.D. x 1.1 מ"מ O.D.), חתיכה אחת של צינור מוצא 10 ס"מ (0.5 מ"מ I.D. x 1.5 מ"מ O.D.), ושש חתיכות של צינורות מתאימים בקוטר 0.5 ס"מ (1 מ"מ I.D. x 1.8 מ"מ O.D.) מתחת למקור אור חיידקי (בדרך כלל מובנה בארונות בטיחות ביולוגיים) ומעקרים עבור 30 דקות.
- השתמש במלקחיים כדי להתאים את הצינורות ליציאות הכניסה הנוזליות וליציאות הדיסוציאציה.
- השתמש בשלושת החלקים של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 20 ס"מ עבור הקונכייה, שמן, פתחי תחליב קרוסלינקר וחתיכה אחת לכניסת התקן הדיסוציאציה. לאחר מכן, הכנס את הקצה הנגדי של הצינורות למחט של המזרק עם הפתרון המתאים. בינתיים, חברו את כניסת הליבה של המכשיר המיקרופלואידי ואת היציאה של התקן הדיסוציאציה באמצעות מיקרו-צינורית אחת בקוטר 5 ס"מ (איור 1C).
הערה: יש לאבטח היטב את המיקרו-צינורות הכניסה בתוך צינורות ההתאמה, שהוכנסו בשלב האחרון. - הכנס צינור מוצא אחד לתוך יציאת היציאה הנוזלית והכניס את הקצה הנגדי למאגר איסוף.
- מניחים את המכשיר על במת מיקרוסקופ ומחברים את הצינורות כדי להימנע מתנועה. יישמו את המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ על זרבובית המכשיר לצורך בדיקת זרימה.
- הניחו כל מזרק על משאבות מזרק שונות והבטיחו כראוי (איור 1B). תכנת כל משאבה על פי פרוטוקולי היצרן לקצבי הזרימה הבאים: ליבה (3-5 μL/min), מעטפת (3-5 μL/min), שמן מיגון (20-80 μL/min) ושמן crosslinking (40-60 μL/min). התחל את הזרימה בכל המשאבות.
- המתן עד שכל נוזל ייכנס למכשיר ומלא את הערוצים תוך כדי דחיפת האוויר הנותר.
הערה: אם יש כמות גדולה של אוויר בצינורות הכניסה, הגדל באופן זמני כל קצב זרימה עד להסרת האוויר לחלוטין. שים לב שקצב זרימה מופרז עלול להוביל לכשל באג"ח PDMS ל- PDMS. - כאשר מייצבים את היווצרות הקפסולה (איור 3), הניחו את הקצה הנגדי של צינור האיסוף לצינור חרוטי חדש עם 5 מ"ל של מדיית mTeSR.
הערה: המדיה מכילה מעכב 10 μM ROCK, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. - לאחר מספר מספיק של כמוסות נאספים, דגירה ב 37 °C (84 °F) עם 5% CO2 במשך 10 דקות. כמוסות הנמצאות בשלב השמן יהיו בחלק העליון של הצינור (ראו איור 4A). הקשה עדינה על הצינור גורמת לכמוסות משקעים לתחתית. לאחר מכן, רוב הנפט והתקשורת עשויים להיות שאפתניים.
- אספו את הכמוסות מתחתית הצינור החרוטי, הניחו אותן על מסננת תאים (בגודל נקבובית של 100 מיקרומטר) ושטפו בכמויות אדירות של מדיה. לאחר מכן, אספו מיקרו-קפסולות באמצעות מדיה של 2 מ"ל בצלחת תרבית של 6 בארות על-ידי העברת המדיה דרך המסנן כשהיא הפוכה על גבי לוח הבאר (ראו איור 4A).
4. תרבית וניתוח hPSC במיקרו-קפסולות
- תרבות בסיסית
- הדגירו את כמוסות תאי הגזע בצלחת תרבית של 6 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- שנה את המדיה כל יומיים על ידי איסוף הכמוסות על מסנן מסננת תאים, שטיפתן במדיה עודפת, והחזרתן לבאר חדשה בצלחות 6 בארות עם מדיה של 2 מ"ל כפי שנעשה בשלב 3.10.
- תרבית את הכמוסות במשך 10 ימים לפחות.
- בצע את הבדיקה החיה/מתה כדי לקבוע את הכדאיות של תאי גזע עטופים.
- להפשיר פתרונות בדיקה חיים/מתים (אתידיום הומודימר-1 וקלצין AM).
- הוסף 4 μL של 2 μM ethidium homodimer-1 ו 1 μL של 4 μM calcein AM פתרונות 2 mL של DPBS סטרילי. מערבולת כדי להבטיח ערבוב מלא.
- אספו כ-100 מיקרו-קפסולות על מסננת תאים ושטפו אותן ב-DPBS סטרילי כדי לאפשר דיפוזיה של מדיום החוצה מהכמוסות.
- אסוף אותם שוב לצלחת תרבית של 12 בארות באמצעות 1 מ"ל של הפתרון שהוכן בשלב 4.2.2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
הערה: יכולת הכדאיות של התאים ניתנת לכימות על-ידי חישוב אחוז התאים החיים, המוצגים כירוקים, בין המספר הכולל של התאים.
- אפיון גודל ספרואידי.
- בעת הצורך, הניחו את לוחית הבאר עם מיקרו-קפסולות מתחת למיקרוסקופ ומדדו את קוטר הספרואידים המוצגים בתוכנה הקשורה עם פסי קנה מידה מתאימים.
- למדוד ולנתח את גודל הספרואיד.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על ידי ביצוע הפרוטוקול הנ"ל, הקורא יוכל לייצר התקנים מיקרופלואידיים ולייצר מיקרו-קפסולות נושאות תאים. איור 3A מציג דוגמאות למיקרו-קפסולות אופטימליות ולא אופטימליות שיוצרו באמצעות יצירת טיפות מיקרופלואידיות. פורמולציות שונות של PEG-4-Mal הביאו לכמוסות בעלות מורפולוגיות שונות - כמוסות מקומטות היו קשורות לג'לציה לקויה, לשלמות מכנית נמוכה, ולא עמדו בטיפוח בביוריאקטור מעורבב. כמוסות חלקות שנצפו בתכולת PEG של >6% ייצגו את המורפולוגיה הרצויה של הקפסולה והיו חזקות מספיק לגידול תאים. מבנה הליבה-מע...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תהליך האנקפסולציה המתואר כאן מביא להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות hPSC. פורמט המיקרו-קפסולה מקל על חלוקת הספרואידים לבארות של צלחת מיקרוטיטר לניסויים שמטרתם לשפר/למטב פרוטוקולי התמיינות או לבדוק טיפולים. ניתן להשתמש בספרואידים של תאי גזע עטופים גם בתרביות תרחיפים שבהן מעטפת הידרוג'ל מגנה על התאים מפני נזק שנגרם על ידי גזירה7.
ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. חשוב לשמור על קצבי הזרימה של זרמי הליבה, המעטפת והנפט בטווח המתואר בסעיף הפרוטוקול. אם קצב זרימת הקליפה ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים ממרכז מאיו קליניק לרפואה רגנרטיבית, קרן J. W. Kieckhefer, קרן אל נהיאן, רפואה רגנרטיבית מינסוטה (RMM 101617 TR 004) ו- NIH (DK107255).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.22 ומיקרו; m מסנני מזרק | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 מ"ל מזרק קצה נעילת לואר | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4 זרועות PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 מ"ל מזרק קצה נעילה | BD | 309646 | |
| צלחת לא מטופלת 6 בארות | ארה"ב Scientific | CC7672-7506 | |
| חבילת אפליקטור Aquapel | טיפול בזכוכית | Aquapel 47100 | |
| תוכנת CAD | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| מסננת תאים 100 ומיקרו; m גודל נקבוביות | קרדינל | 335583 | |
| כלורוטרימתילסילן | אולדריץ' | 386529-100 מ"ל | |
| רוזנת II FL טכנולוגיית מונה תאים אוטומטית | A27974 | ||
| פלטה חמה | דיגיטלית לוחית | ||
| מערבל מערבולת דיגיטלי | פישר סיינטיפיק | 215370 | |
| מים מזוקקים | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 מדיה | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | פישר מדעי | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 מיקרוצנטריפוגה | חיה | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 חממה | תרמו מדעי | 50144906 | |
| מיקרוסקופ ממונע פלואורסצנטי הפוך | אולימפוס אולימפוס | IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| ערכת צביעה של יונקים חיים/מתים | פישר | L3224 | |
| סרט קסם | סיכות | 483535 | |
| צינורות מיקרו רפואיים (0.015 אינץ' תעודת זהות x 0.043 אינץ' OD) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| מיקרו מוט | ערבוב Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma מסנן מלקחיים | פישר | XX6200006P | |
| שמן מינרלי | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 בזאלי בינוני | טכנולוגיית תאי גזע | 85850 | |
| מחטים-נירוסטה 14 מד | אספקת CML | 901-14-025 | |
| מחטים-נירוסטה אספקת CML 15 מד | 901-15-050 | ||
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| תנור | תרמו מדעי | HERA THERM תנור | |
| פניצילין: סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין G, 10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין) | תאומים | 400-109 | |
| פטרי צלחת 150X20 אוורור סטרילי | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| מערכת ניקוי פלזמה | מערכת הנדסת תפוקה, בע"מ | YES-G500 | |
| פלורוניק F-127 | סיגמא | P2443-250G | |
| פולי (אתילן גליקול) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| מחט PrecisionGlide 27G | BD | 305109 | |
| מעכב רוק Y-27632 דיהידרוקלוריד | SELLECK CHEM | S1049-10 מ"ג | |
| פרוסת סיליקון 100 מ"מ | רקיק אוניברסיטאי | 452 | |
| זכוכית שקופית (75 מ"מ וחריפה; 25 מ"מ) | CardinalHealth | M6146 | |
| טווח 80 | סיגמא | S6760-250 מ"ל | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X מסנן צינור צנטריפוגה (0.22 & מיקרו; m) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku חומרים מתקדמים | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 מפתח | Kayaku חומרים מתקדמים | Y020100 4000L1PE | |
| עיצוב כירורגי Royaltek נירוסטה להבי אזמל כירורגיים | פישר מדעי | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 ערכת אלסטומר סיליקון (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| משאבת מזרק | מערכת משאבות עידן חדש, בע" | NE-4000 | |
| טריאתנולאמין | סיגמא-אולדריץ' | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| צינורות טיגון (0.02 אינץ' מזהה x 0.06 אינץ' OD) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| צינורות טיגון (0.04 אינץ' תעודת זהות x 0.07 אינץ' OD) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| שואב אולטרסאונד FS20D | פישר סיינטיפיק | CPN-962-152R | |
| מייבש ואקום | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 מיקרוסקופ סטריאו 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μ כותב לייזר PG 101 | היידלברג אינסטרומנטס | HI 1128 |
מקורות
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70(2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
