פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.
מאמר שיטה
הדמיה של מיקרוטובול פלוס-אנד דיינמיקס במודל מחלת הנטינגטון המבוססת על פיברובלסטים של העור העיקרי האנושי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
טרנספקטיון עם חלבון סמן שכותרתו פלואורסצנטית של עניין בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן היא שיטה קלאסית של לימוד המאפיינים הדינמיים של ציטוסקלטון. פרוטוקול זה מציע טכניקה עבור טרנספקט פיברובלסט ראשוני אנושי, אשר יכול להיות קשה בגלל הפרטים של תנאי טיפוח התא העיקריים. בנוסף, תחזוקת הנכס הדינמי של ציטוסקלטון דורשת רמה נמוכה של טרנספקטציה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מבלי לגרום לייצוב מיקרוטובול. חשוב לנקוט באמצעים כדי להגן על התאים מפני מתח המושרה באור ודחיכת צבע פלואורסצנטי. במהלך עבודתנו, בדקנו שיטות ופרוטוקולים שונים של טרנספקטיישן, כמו גם וקטורים שונים כדי לבחור את השילוב הטוב ביותר של תנאים המתאימים למחקרי פיברובלסט ראשוניים אנושיים. ניתחנו את הסרטונים שהתקבלו בזמן וחישוב דינמיקת המיקרו-קוטביות באמצעות ImageJ. הדינמיקה של המיקרוטובולים בחלקי התא השונים אינה דומה, ולכן חילקנו את הניתוח לתת-קבוצות - אזור המרכז, הלאמלה וזנב הפיברובלסטים. ראוי לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח במבחנה של דינמיקת cytoskeleton בדגימות המטופל, המאפשר את הצעד הבא לקראת הבנת הדינמיקה של התפתחות המחלה השונה.
מבוא
מחלת הנטינגטון (HD) היא פתולוגיה נוירודגנרטיבית חשוכת מרפא הנגרמת על ידי חלבון קידוד גן מוטציה (HTT). HTT קשורה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות והוא מעורב כנראה בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול1,2. כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה HTT על דינמיקת microtubule, השתמשנו בהדמיה חוץ גופית של חלבון EB3, המווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כריכה וייצוב הפלוס-קצוות הגדלים. כדי לטעון פלואורסצנטית שכותרתו EB3 לתוך פיברובלסטים בעור אנושי, transfection plasmid הוחל. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית שהתקבלה מהביופסיה של העור של חולי HD למחקר זה.
המוטציה בגן חלבון HTT מובילה להארכה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המרכז הפדרלי למחקר ולרפואה קלינית של רפואה פיזית-כימית של הסוכנות הביולוגית הרפואית הפדרלית מיום 08 בספטמבר 2015.
הערה: איור 1 מספק מבט כולל על הפרוטוקול.
1. השגת תרבות עיקרית של פיברובלסטים בעור האדם (איור 2)
- לספק את הביופסיה למעבדה בתוך כמה שעות במדיום הנשר המשונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל של פניצילין ו 50 U / mL של סטרפטומיצין.
הערה: ביופסיה לעור חייבת להתבצע בתנאים סטריליים על ידי רופא לאחר שחולה חותם על הסכמה מדעת. - מניחים את רקמת הביופסיה בצלחת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סרטי GFP-EB3 שנוצרו באמצעות הפרוטוקול (איור 1) ממחישים את המאפיינים הדינמיים של המיקרוטובולות. מיקרוטובולות מעורבות בתהליכים שונים של תאים, ומאפייניהם הדינמיים משפיעים על מאפייני חיים שונים של תרבית התאים האנושיים העיקרית מחומר הביופסיה של המטופלים (איור 2).
הפרמטרים הבאים קובעים את חוסר היציבות הדינמית של microtubules: שיעורי הצמיחה (פילמור) וכיווץ (depolymerization); תדירות האסונות (מעבר מפיפולימריזציה לדפולימריזציה); תדירות ההצלות .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתן להשיג תוצאות באיכות טובה יותר לניתוח הדינמיקה של microtubules מתמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה. חשוב לבחון את כל התנאים הדרושים להדמיה של תאים חיים בזמן ולהתאים נכונה את פרמטרי ההדמיה. שימוש במנות מיוחדות לתרבות תאים עם תחתית זכוכית (מנות קונפוקליות) חשוב, שכן זכוכית יש אינדקס שבירה שונה של אור מאשר פלסטיק. עובי הזכוכית ואחידותה על פני כל שטחה הוא גם חשוב ביותר, שכן פרמטרים אלה חיוניים עבור התמקדות מדגם נורמלי. הפרה של פרמטרים אלה מובילה בהכרח לכישלון של מערכת המיקוד המושלמת וכתוצאה מכך התמקדות גרועה ובכך הופכת את .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מס '075-15-2019-1669 (טרנספקטים של פיברובלסטים), על ידי הקרן הרוסית למדע, מענק מס '19-15-00425 (כל שאר העבודות על טיפוח פיברובלסטים במבחנה). זה נתמך חלקית על ידי Lomonosov מוסקבה המדינה האוניברסיטה פיתוח תוכנית PNR5.13 (הדמיה וניתוח). המחברים מכירים בתמיכת מרכז ניקון למצוינות במכון א.נ. בלוצרסקי לביולוגיה פיזיקו-כימית. אנחנו רוצים להודות במיוחד ליקטרינה טארן על עזרתה במשחק קול. המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>מכשורחזק> | |||
| מצלמה iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf צנטריפוגה 5804 R | Eppendorf | ||
| HYQ FITC | Nikon | אלטרנטיבה: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | חממת מיקרוסקופ L40002 | |
| לצילום לכל החיים | Okolab | בקר טמפרטורה H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| בקר גז CO2-O2-UNIT-BL | |||
| עדשת אובייקטיבית CFI תוכנית Apo Lambda 60x שמן 1.4 (WD 0.13) | חלופת ניקון | : לייקה, אולימפוס, | |
| מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי Zeiss Widefield Eclipse Ti-E | Nikon | אלטרנטיבהLeica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (תמונה J גרסה 2.1.0/1.53c) | תוכנת | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| ריאגנטים נוספים | |||
| שמן מינרלי (שמן לבן בהיר) | MP | צלחת תרבית תאים 151694 | |
| <חזקה>חזקה> | |||
| צלחת תרבית תאים | SPL Lifesciences | 20035 | |
| צלחת קונפוקלית (עובי זכוכית 170 ומיקרו; m) | SPL Lifesciences | 211350 | חלופה: |
| צינור צנטריפוגה חרוטי | SPL Lifesciences | 50015 | |
| בקבוקונים קריוגניים | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| <חזק>טיפוחחזק> | |||
| מגיב ליפופקטמין 3000 טרנספקציה | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| דימתיל סולפוקסיד | PanEko |  135 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 | |
| DPBS (Dulbecco's תמיסת מלח פוספט) | PanEko | P060 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| ג'לטין (עור בקר) | PanEko | 070 | |
| GlutaMAX | תרמו פישר Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | PanEko | A063 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| DNA פלסמיד עם EB3-GFP | מתנה חביבה של ד"ר א. קברינה [אוניברסיטת ונדרבילט, נאשוויל] באישור ד"ר א. אחמנובה [אוניברסיטת ארסמוס, רוטרדם] | סטפנובה ואחרים, 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
מקורות
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה