Method Article

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר שיטת הכנה לדוגמה המבוססת על אי-פעולת חום כדי לשמר פפטידים אנדוגני הימנעות השפלה לאחר המוות, ואחריו כמות יחסית באמצעות תיוג איזוטופי בתוספת LC-MS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטידומיקה יכולה להיות מוגדרת כניתוח איכותי וכמותי של פפטידים במדגם ביולוגי. היישומים העיקריים שלה כוללים זיהוי סמנים ביולוגיים פפטיד של מחלות או מתח סביבתי, זיהוי נוירופפטידים, הורמונים, פפטידים תאיים ביואקטיביים, גילוי פפטידים מיקרוביאליים ו nutraceutical מחלבון הידרוליזטים, וניתן להשתמש בהם במחקרים כדי להבין את התהליכים הפרוטאוליטיים. ההתקדמות האחרונה בהכנת מדגם, שיטות הפרדה, טכניקות ספקטרומטריית מסה וכלים חישוביים הקשורים לרצף חלבונים תרמה לעלייה במספר הפפטידים והפפטידום המזוהים המאופיינים. מחקרים פפטידום לעתים קרובות לנתח פפטידים שנוצרים באופן טבעי בתאים. כאן, פרוטוקול הכנה מדגם המבוסס על אי-פעילות חום מתואר, אשר מבטל פעילות פרוטאז, ומיצוי עם תנאים קלים, כך שאין מחשוף קשרים פפטיד. בנוסף, כמות יחסית של פפטידים באמצעות תיוג איזוטופ יציב על ידי מתילציה מופחתת של אמינים מוצג גם. שיטת תיוג זו יש כמה יתרונות כמו ריאגנטים זמינים מסחרית, זול בהשוואה לאחרים, יציב מבחינה כימית, ומאפשר ניתוח של עד חמש דגימות בריצה אחת LC-MS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדעי "Omics" מאופיינים בניתוח עמוק של ערכת מולקולות, כגון DNA, RNA, חלבונים, פפטידים, מטבוליטים וכו '. ערכות נתונים בקנה מידה גדול אלה (גנומיקה, תמלול, פרוטאומיה, פפטידומיקה, מטבולומיה וכו ') חוללו מהפכה בביולוגיה והובילו להבנה מתקדמת של תהליכים ביולוגיים1. המונח פפטידומיקה החל להיות מוצג בתחילת המאה ה -20, וכמה מחברים התייחסו אליו כענף של פרוטאומיקס2. עם זאת, לפפטידוזיקה יש פרטים ברורים, כאשר האינטרס העיקרי הוא לחקור את תוכן הפפטידים שנוצר באופן טבעי במהלך תהליכים תאיים, כמו גם את אפיון הפעילות הביולוגית של מולקולות אלה3,4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך הבא להפקת פפטיד ומתילציה מופחתת הותאם מהליכים שפורסמו בעבר24,25,26,27. פרוטוקול זה פעל בהתאם להנחיות המועצה הלאומית לבקרת ניסויים בבעלי חיים (CONCEA) ואושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים (CEUA) במכון הביו-מדעי של אוניברסיטת סאו פאולו. שלבי הפרוטוקול מוצגים באיור 1.

הערה: הכינו את כל הפתרונות המימיים במים אולטרה-תכשירים.

1. מיצוי פפטיד

  1. תרבית תאים
    1. טפח תאי SHSY5Y בצלחת של 15 ס"מ ב-37 °C (5% CO2 ) במדיום....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המתקבלות מהריצות שבוצעו בספקטרומטר המסה מאוחסנות בקבצי נתונים גולמיים שניתן לפתוח בתוכנת ספקטרומטר המסה. בספקטרום MS, ניתן לצפות בקבוצות שיא המייצגות פפטידים מסומנים על פי ערכת התיוג המשמשת, החל 2-5 תוויות. לדוגמה, באיור 2, זוגות פסגות שזוהו בזמן כרומטוגרפי מיוצגים בניסוי שבו נעשה שימוש בשתי תוויות איזוטופיות בלבד בשתי דגימות שונות באותה ריצה. איור 3 מציג אפשרויות אחרות לתוצאות חיוביות, תוך שימוש ב- 3 ו- 4 תוויות שונות בכל הפעלת LC-MS. בעת שימוש ב- 4 או .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברוב המחקרים פפטידום, אחד הצעדים הקריטיים הוא, ללא ספק, הכנת המדגם כי צריך להתבצע בקפידה כדי למנוע נוכחות של שברי פפטיד שנוצר על ידי פרוטאזים לאחר כמה דקות לאחר המוות. המחקרים הראשוניים על תמציות מוח שהוכנו מדגימות שאינן במיקרוגל הראו מספר רב של שברי חלבון להיות נוכחים 10-kDa microfiltrates. גישות שונות תוארו כדי למנוע ספקטרום פפטיד מהשפלת חלבון: הקרבת בעלי חיים בהקרנת מיקרוגל ממוקדת6,8, ניתוח קריוסטט ואחריו חיץ מיצוי רותח31, וה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים קיימים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח והשימוש בטכניקות המתוארות כאן נתמכו על ידי מענק המועצה הלאומית הברזילאית 420811/2018-4 (LMC); Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) grants 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ו-21/01286-1 (MEME). למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, ההחלטה לפרסם או הכנת המאמר.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מסנני חיתוך 10 kDaMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, ממברנת PLGC Ultracel-PL, 10 kDa
אצטוןסיגמא-אולדריץ'179124
אצטוניטרילסיגמא-אולדריץ'1000291000
אמוניום ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'11213
טור אנליטי (EASY-Column)EASY-Column(SC200)  10 ס"מ, ID75 ומיקרו; m, 3 ומיקרו; m, C18-A2
אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאטסיגמא-אולדריץ'E10521MS-222
פלואורסקמיןסיגמא-אולדריץ'F9015
תמיסת פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'252549
פורמלדהיד-13C, d2, תמיסהסיגמא-אולדריץ'596388
פורמלדהיד-d2 תמיסהSigma-Aldrich492620
חומצה פורמיתSigma-Aldrich33015
קולט אדיםQuimisQ216
חומצה הידרוכלורית - HClSigma-Aldrich258148
צינורות שימור חלבון LoBindEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher Scientificתנור מיקרוגל LTQ Velos
PanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBioinformatics Solutions Inc.גרסה 8.5
מלח חוצץ פוספטInvitrogen3002טבליות
precolumn (EASY-Column)תרמו פישר מדעי(SC001)2 ס"מ, ID100 ומיקרו; m, 5 ומיקרו; m, C18-A1
צנטריפוגה מקוררתHermleZ326Kלצינורות חרוטיים
צנטריפוגה מקוררתVision VS15000CFNIIלמיקרו-צינורות
עמודי ניקוי שלב הפוך    (מחסנית Oasis HLB 1 סמ"ק)Waters186000383Oasis HLB 1 סמ"ק מחסנית
נתרן ציאנובורודוטריד - NaBD3CNSigma-Aldrich190020
נתרן ציאנובורוהידריד - NaBH3CNSigma-Aldrich156159
נתרן פוספט דו-בסיסיSigma-AldrichS9763הערה: 0.2 M PB = 0.1 M מאגר פוספט pH 6.8 (26.85 מ"ל Na2HPO3 1M) בתוספת 0.1 M מאגר פוספט pH 6.8 (23.15 מ"ל של NaH2PO3 1M) עד 250 מ"ל מים
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichS3139
SonicatorQsonicaQ55-110
פפטידProteimax: מאגר טריאתילאמוניום LTLRTKL
- TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
- TFASigma-AldrichT6508
מים מטוהרים במיוחדMilli-QDirect-Q 3UV
צנטריפוגת ואקוםGeneVacMiVac רכז DNA
אמבט מיםCientec266
Xcalibur תוכנהThermoFisher ScientificOPTON-30965
מירצף חומצות אמינו סטנדרטי חומצה טריפלואורואצטית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptidomics StudiesReductive MethylationIsotopic LabelingPeptide QuantitationSample PreparationMass SpectrometryPeptide ExtractionHeat InactivationNeuroblastoma CellsPeptide Biomarkers

Related Articles