הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

2.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62974

⸱

8 בספטמבר 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

במאמר זה נתאר את השימוש בשיטת ההדמיה של מולקולה בודדת, DNA Curtains, כדי לחקור את המנגנון הביופיזי של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על דנ"א.

תקציר

גני האיחוי הנובעים מטרנסלוקציה כרומוזומלית נמצאו בגידולים מוצקים רבים או בלוקמיה. EWS-FLI1, השייך למשפחת אונקופרוטאינים מסוג FUS/EWS/TAF15 (FET), הוא אחד מגני האיחוי המעורבים ביותר בסרקומה ע"ש יואינג. חלבוני היתוך אלה ממשפחת FET מכילים בדרך כלל תחום בעל מורכבות נמוכה (LCD) של חלבון FET ב-N-terminus שלהם ותחום קושר דנ"א (DBD) ב-C-terminus שלהם. EWS-FLI1 אושר כיוצר עיבוי ביומולקולרי במוקדי הקישור שלו עקב אינטראקציות LCD-LCD ו-LCD-DBD, ועיבויים אלה יכולים לגייס RNA פולימראז II כדי לשפר את שעתוק הגנים. עם זאת, עדיין לא ברור כיצד מרכיבים עיבויים אלה באתרי הכריכה שלהם. לאחרונה, שיטת ביופיזיקה של מולקולה אחת - DNA Curtains - יושמה כדי לדמיין את תהליכי ההרכבה האלה של עיבוי EWS-FLI1. כאן נדון פרוטוקול הניסוי המפורט וגישות ניתוח הנתונים ליישום וילונות דנ"א בחקר המעבים הביומולקולריים המרכיבים על דנ"א המטרה.

מבוא

ויסות שעתוק הוא צעד מכריע לביטוי גנים מדויק בתאים חיים. גורמים רבים, כגון שינוי כרומוזומלי, גורמי שעתוק (TFs) ורנ"א שאינם מקודדים, משתתפים בתהליך מסובך זה 1,2,3. בין גורמים אלה, TFs תורמים לספציפיות של ויסות שעתוק על ידי זיהוי וקשירה לרצפי DNA ספציפיים המכונים מקדמים או משפרים ולאחר מכן גיוס חלבונים פונקציונליים אחרים להפעלה או לדיכוי שעתוק 4,5,6,7. האופן שבו ה-TFs האלה מצליחים לחפש את אתרי המטרה שלהם בגנום האנושי ולתקשר עם דנ"א המצופה בהיסטונים ובחלבונים קושרי דנ"א שאינם היסטון מבלבל מדענים כבר עשרות שנים. בשנים האחרונות נבנו מספר מודלים קלאסיים למנגנון חיפוש המטרה של TFs כדי לתאר כיצד הם "מחליקים", "קופצים", "קופצים" או "מעבירים אינטרסגמנטים" לאורך שרשרת הדנ"א 8,9,10,11. מודלים אלה מתמקדים בהתנהגות החיפוש בדנ"א של מולקולת TF אחת ויחידה. עם זאת, מחקרים אחרונים מראים כי חלק מה-TFs עוברים הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS) לבד בגרעין או עם קומפלקס מתווך12. הטיפות הנצפות של TFs קשורות לאזורי המקדם או המשפר, ומדגישות את התפקיד של היווצרות עיבוי ביומולקולרי בשעתוק ואת הגנום התלת-ממדי13,14,15. עיבויים ביומולקולריים אלה קשורים לתאים חסרי ממברנה in vivo ו- in vitro. הם נוצרים באמצעות LLPS, שבו ביו-מקרומולקולות מודולריות ואזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) של חלבונים הם שני הכוחות המניעים העיקריים של אינטראקציות רב-ערכיות16. לפיכך, TFs לא רק מחפשים דנ"א אלא גם מתפקדים בסינרגיה בתוך עיבוייםאלה 4,17,18. נכון להיום, התכונה הביופיזית של עיבוי שעתוק אלה על דנ"א עדיין אינה ברורה.

לכן, מחקר זה נועד ליישם שיטה של מולקולה בודדת - DNA Curtains - כדי לדמות ישירות את היווצרות ודינמיקה של עיבוי שעתוק שנוצר על ידי TFs על DNA במבחנה. DNA Curtains, פלטפורמת הדמיה במבחנה בתפוקה גבוהה לחקר האינטראקציה בין חלבונים לדנ"א, יושמה בתיקון דנ"א 19,20,21, חיפוש מטרה22, ו- LLPS 17,23,24. תא הזרימה של וילונות הדנ"א מצופה בדו-שכבתי שומנים ביוטיניליים כדי לעבור את פני השטח ולאפשר לביומולקולות להתפזר על פני השטח. תבניות הזיג-זג הננו-מיוצרות מגבילות את תנועת הדנ"א. מצעי דנ"א למבדה שעברו ביוטינילציה יכולים להתיישר לאורך קצוות המחסום ולהימתח על ידי זרימת החיץ המכוון. אותם רצפי התחלה וסיום של כל המולקולות מאפשרים מעקב אחר החלבון בדנ"א ומתארים את התפלגות המיקום של אירועי הקישור25,26. יתר על כן, השילוב של וילונות DNA עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) מסייע למזער את רעשי הרקע ולזהות אותות ברמה של מולקולה אחת. לפיכך, וילונות דנ"א יכולים להיות שיטה מבטיחה לחקור את הדינמיקה של היווצרות עיבוי שעתוק על מוטיבים של דנ"א. מאמר זה מתאר את הדוגמה של אונקופרוטאין ממשפחת FUS/EWS/TAF15 (FET), EWS-FLI1, שנוצר על-ידי טרנסלוקציה כרומוזומלית. דנ"א למבדה המכיל 25× GGAA - רצף הקשירה של EWS-FLI127 - שימש כמצע הדנ"א בניסויי DNA Curtains כדי לבחון כיצד מולקולות EWS-FLI1 עוברות LLPS על דנ"א. כתב יד זה דן בפירוט בפרוטוקול הניסויי ובשיטות ניתוח הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תערובת מאסטר דו-שכבתית של שומנים

  1. שטפו בקבוקוני זכוכית במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) ו-99% אתנול וייבשו אותם בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו את תערובת השומנים על ידי המסת 1 גרם של 1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוקולין (DOPC), 100 מ"ג של פוליאתילן גליקול מגיב (PEGylated) ליפידים (18:1 של 1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין-N-[מתוקסי (פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום) (PEG2000 DOPE) ו-25 מ"ג של ליפידים ביוטינילטים (18:1 מתוך 1,2-דיאולאויל-sn-גליצרו-3-פוספוטאנולמין-N-(קאפ ביוטיניל) (מלח נתרן) (Biotinyl Cap DOPE)) לתוך 10 מ"ל של כלורופורם.
  3. הכינו 1 מ"ל של תערובת מאסטר שומנים לכל בקבוקון ואחסנו אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בבקבוקוני זכוכית נקיים.
    הערה: אחסנו את השומנים המומסים בבקבוקוני זכוכית וכסו את מכסה הבקבוקון בפרפילם במהלך האחסון.

2. הכנת תמיסת ליפוזום

  1. שטפו בקבוקון זכוכית 2 מ"ל עם ddH2O ו-99% אתנול וייבשו אותו היטב בתנור ייבוש בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס.
  2. שטפו מזרק זכוכית של 250 μL עם כלורופורם ולאחר מכן העבירו 200 μL מתערובת השומנים הראשית לתוך בקבוקון הזכוכית היבשה.
  3. השתמש באקדח ריסוס חנקן כדי להזרים N2 בעדינות תוך סיבוב רציף של הבקבוקון בכיוון אחד.
    הערה: N2 יעזור לאדות את הכלורופורם, והשומנים הנותרים ייצרו סרט דק על דופן בקבוקון הזכוכית. התאם את זרם החנקן להיות עדין מאוד בהתחלה והגבר את הזרימה כאשר סרט לבן מופיע בבקבוקון; השלם את תהליך האידוי תוך 5 דקות.
  4. מעבירים את בקבוקון הזכוכית לתנור לייבוש ואקום בטמפרטורת החדר (RT) למשך 16-24 שעות להסרה מלאה של הכלורופורם מהשומנים.
  5. הוסיפו 2 מ"ל של מאגר שומנים טריים (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ו-100 mM NaCl) לבקבוקון הזכוכית והמיסו את השומנים ב-RT למשך שעתיים. מערבבים את הפתרון מספר פעמים ומעבירים אותו לצינור תרבות פוליפרופילן 5 מ"ל.
  6. סוניקו את תמיסת השומנים על הקרח עם סוניקטור מיקרו-קצה כדי ליצור שלפוחיות חד-עיניות קטנות, תוך שימוש בהגדרות הבאות: 6 שניות על 12 שניות כבוי (20% משרעת) במשך 6 מחזורים, ואז 6 שניות על 6 שניות הנחה (30% משרעת) במשך 3 מחזורים, ולבסוף 10 שניות על (משרעת 40%).
    הערה: עליית הטמפרטורה במהלך הסוניקציה עלולה לגרום להתפוצצות קצף ולהרוס את הליפוזומים. לכן, בדוק את מצב הקצף ואת הטמפרטורה וחדש את הקרח לעתים קרובות.
  7. מסננים את הליפוזומים דרך מסנן מזרק ניילון בגודל 0.22 מיקרומטר, aliquot, ומאחסנים אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ככל שהניידות שלהם פוחתת עם אחסון ממושך, יש להשתמש בליפוזומים תוך 2-3 חודשים או להכין אותם טריים לפני השימוש.

3. שיבוט רצף וביוטינילציה של דנ"א למבדה

  1. החדרת המוטיבים הקושרים לדנ"א של למבדה
    1. עכלו את קטע המטרה המכיל את המוטיבים המחייבים ואת הדנ"א של למבדה עם NheI ו-XhoI. לשרטט את מקטע המטרה עם דנ"א למבדה באמצעות ליגאז T4 למשך הלילה ב-RT.
    2. תרבית E.coli VCS257 תאים במדיום LB ללא אנטיביוטיקה עד OD600 מגיע 0.6. אחסנו את החיידקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
    3. מחממים את תמיסת הקשירה בטמפרטורה של 65°C למשך 20 דקות כדי לנטרל את הליגאז T4.
    4. הפשירו את תמצית הפאג'ים של למבדה, ערבבו אותה בעדינות עם המוצר המקושר על ידי פיפטינג עם קצוות קהים, ודגרו את התערובת ב-RT למשך שעתיים.
    5. הוסיפו 500 μL של מאגר SM (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl ו-8 mM MgCl2, מסוננים דרך מסנן 0.22 מיקרומטר) ו-20 μL של כלורופורם לתערובת האריזה משלב 3.1.4, ערבבו היטב ועשו צנטריפוגה לתמיסה.
      הערה: ניתן לשמור על פעילות תמצית האריזה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לפרקי זמן ממושכים.
    6. הכינו את תערובת התגובה על ידי ערבוב של 10 μL של תמצית אריזה עם 90 μL של מאגר SM ו-100 μL של תאי VCS257 (משלב 3.1.2) יחד, ודגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: ריכוז תמיסת האריזה תלוי בצפיפות לוחות הפאגים ביום שלמחרת; ניתן לדלל או להוסיף אותו לפי הצורך.
    7. קח ~ 5 מ"ל של אגר עליון מומס (22 גרם / L מרק NZCYM עם 15 גרם / L אגר) בצינור 15 מ"ל. ברגע שהאגר העליון מתקרר ל~42°C, מוסיפים את תערובת התגובה (משלב 3.1.6) באיטיות באמצעות פיפטה קהה ויוצקים את הנוזל על צלחת אגר LB נטולת אנטיביוטיקה. שומרים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות למשך הלילה.
    8. אשר את הלוחות החיוביים בין לוחות הפאגים השקופים על צלחת האגר העליונה על ידי PCR. מעבירים את הלוחות החיוביים לצלחת אגר עליונה חדשה עם פיפטה ושומרים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות למשך הלילה.
    9. הוסף 400 μL של תאי VCS257 לתוך 400 μL של חיץ המכיל 10 mM MgCl 2 ו 10 mM CaCl2, לחסן רובד אחד לתוך תערובת תאים זו, ודגירה אותו בשייקר 37 °C ב 250 סל"ד במשך 15 דקות.
    10. הוסיפו 800 μL מתרחיף זה המכיל את לוחית הפאגים ל-200 מ"ל של ציר NZCYM בבקבוק 2 ליטר והדגירו אותו בשייקר של 37 מעלות צלזיוס ב-125 סל"ד.
    11. מדוד OD600 של ההשעיה החיידקית לאחר ~ 4 שעות של טיפוח. זכור שהערך OD600 יעלה תחילה ולאחר מכן יירד לשוקת ב~0.2. עצור את הדגירה כאשר ערך OD 600 עומד לעלות שוב, הוסף500 μL של כלורופורם, ונער ב 80 סל"ד במשך 5 דקות נוספות.
      הערה: העלייה ב- OD600 לאחר השוקת תתרחש במהירות; לפיכך, יש למדוד את ערך OD600 לעתים קרובות יותר כאשר הוא יורד ל-0.3 כדי למנוע צמיחת תאי VCS257 מוגזמת בתרבית.
    12. מעבירים את תרבית הפאגים לבקבוק של 500 מ"ל, מוסיפים 11.7 גרם של NaCl ומנערים את הבקבוק. לדגור את הבקבוק על הקרח במשך 10 דקות.
    13. העבר את המתלים באופן שווה לארבעה צינורות 50 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות.
      הערה: כל שלבי הצנטריפוגה הללו בסעיף 3.1 צריכים להיעשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    14. העבר את הסופרנאטנטים לארבעה צינורות חדשים של 50 מ"ל וצנטריפוגה שוב באותה מהירות למשך 5 דקות.
    15. אספו את הסופרנאטים, הוסיפו 10% (עם v) אבקת PEG8000 וסובבו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לדגור במשך 30 דקות.
    16. צנטריפוגה המתלים משלב 3.1.15 ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות כדי לקבל את כדורי הפאגים.
    17. יש להשעות את הכדורים ב-1 מ"ל של מאגר דילול פאגים (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl ו-10 mM MgCl2) בארבע שפופרות ולשפוך את כל 4 המ"ל של תערובות אלה לתוך צינור של 50 מ"ל.
    18. יש להוסיף את RNase A (10 מ"ג/מ"ל) ו-DNase I (4 מ"ג/מ"ל) לריכוזים הסופיים של 20 מיקרוגרם/מ"ל ו-5 מיקרוגרם/מ"ל ולדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לפרק את עודפי חומצות הגרעין.
    19. יש להוסיף 4.5 מ"ל של 300 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 2.76 מ"ל של 0.5 מ' אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), 1.67 מ"ל של 10% נתרן דודצילסולפט (SDS), ו-75 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) לתוך הצינור, ולדגור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    20. מוסיפים 4.5 מ"ל של אצטט אשלגן 3 M מקורר מראש, ודוגרים על קרח במשך 10 דקות.
    21. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 10 דקות, וסובבה את הסופר-נאטנט במשך 5 דקות נוספות ב-10,000 x גרם.
    22. הוסיפו נפח של 70% איזופרופנול לסופרנטנט שנאסף (משלב 3.1.21) עם ערבוב מספיק, דגירה ב-RT למשך 2 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 10 דקות. משליכים את האיזופרופנול ומסתובבים שוב למשך 5 דקות.
      הערה: גלולת הדנ"א תימרח לפני הצנטריפוגה הראשונה של 10 דקות; הכדור יהיה מרוכז בתחתית הצינור לאחר הצנטריפוגה השנייה של 5 דקות.
    23. שטפו את הדנ"א המואץ עם 2-3 מ"ל של 70% אתנול והסתחררו שוב למשך דקה אחת. יבשו את הכדור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ולאחר מכן החזירו את הדנ"א ל-500 מיקרון של חיץ TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ו-1 mM EDTA) למשך הלילה ב-RT.
    24. מעבירים את הדנ"א לצינור של 1.5 מ"ל ומסובבים אותו ב-18,000 x גרם למשך 3 דקות. מעבירים את הדנ"א לצינור חדש של 1.5 מ"ל. Aliquot את הדנ"א למבדה מטוהר ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת ביוטין-למבדה DNA
    1. המיסו 50 μL של דנ"א למבדה מטוהר עם מוטיבים משובטים בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות.
      הערה: מכיוון שאורכו של דנ"א למבדה הוא ~48 קילו-סיביות לשנייה, יש לחמם אותו לפני הפיפטינג כדי למנוע הפסקות דנ"א.
    2. מערבבים 50 μL של דנ"א למבדה, 1 μL של פריימר ביוטין (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) ו-54 μL של ddH2O יחד. דוגרים את התערובת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומשאירים אותה על הספסל כדי להתקרר ל-RT.
    3. הוסיפו 12 μL של חיץ ליגאז T4 10x ו-3 μL של ליגאז T4, ודגרו ב-RT למשך מספר שעות או למשך הלילה.
    4. הוסיפו נפח שווה של תערובת פנול-כלורופורם (1:1) למוצר הקשירה, ערבבו היטב מיד וצנטריפוגה בגודל 12,000 x גרם למשך 2 דקות ב-RT.
    5. מעבירים את הפאזה המימית העליונה המכילה את הדנ"א בזהירות לצינור חדש, מוסיפים נפח שווה של כלורופורם, מערבבים היטב, ואז צנטריפוגה בגודל 12,000 x גרם למשך 2 דקות.
    6. מעבירים את הפאזה המימית העליונה לצינור חדש, מוסיפים נפח שווה של איזופרופנול ו-10% מהנפח של 3 M נתרן אצטט, ודוגרים ב-RT למשך 2 דקות. צנטריפוגה התערובת ב 12,000 x גרם במשך 5 דקות.
    7. הסר את supernatant, לשטוף את הכדור עם 75% אתנול, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 5 דקות.
    8. הסר את 75% האתנול, ייבש באוויר את הדנ"א ב-RT למשך 10 דקות, והשתמש ב-120 μL של מאגר TE כדי להמיס את הדנ"א.
    9. הוסף 60 μL של Buffer A (30% (w/v) PEG8000 ו- 30 mM MgCl 2) ל- 120 μL של התמיסה משלב3.2.8, וסובב ב- 4 °C למשך 20-24 שעות.
    10. צנטריפוגה את התערובת ב 18,000 גרם במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
    11. יש להשתמש ב-180 μL של אתנול 75% מקורר מראש כדי לשטוף את הכדור, ולחזור על שלב 3.2.10.
    12. יבש את הכדור ב-RT, והשתמש ב-100 μL של מאגר TE150 כדי להמיס את הדנ"א.

4. מחסומי זיג-זג ננומטריים

  1. מנקים מגלשות באצטון למשך 20 דקות על ידי סוניקציה ומעבירים אותן למיכל זכוכית חדש עם 1 M NaOH לסוניקציה למשך 20 דקות נוספות. ערבבו 90 מ"ל של H 2 SO4 עם 30 מ"ל של H 2 O2, וטבלו את השקופיות בתערובת זו למשך 30 דקות. שוטפים את השקופיות עם אצטון ואיזופרופנול ומייבשים את השקופיות עם N2.
    הערה: ערבוב H 2 SO4 ו- H 2 O2הוא תהליך אקסותרמי; נקוט באמצעי בטיחות נאותים במהלך הפעולה.
  2. מצפים את המגלשה המנוקה בפולימתיל-מתקרילט (PMMA) 25 kDa, PMMA 49.5 kDa, ואת השכבה העליונה של ציפוי מגן מוליך ברצף. השתמשו בליתוגרפיה של קרן אלקטרונים כדי לכתוב את מחסומי הזיג-זג (איור 1A).
  3. שטפו את המגלשות עםddH 2 O כדי להסיר את ציפוי המגן המוליך ויבשו את המגלשות עם N2.
  4. הפקידו שכבה של 30 ננומטר של כרום (Cr) באמצעות מכונת התזת מגנטרון והסירו את שכבות ה-PMMA הנותרות עם אצטון.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בתא זרימה אחד עבור יותר מ-20 ניסויים ב-DNA Curtains. כדי לעשות שימוש חוזר בתא הזרימה, שטפו אותו באתנול, חומר ניקוי ו-NaOH.

5. טיהור חלבון EWS-FLI1

הערה: התצפית של 500 ננומטר EWS-FLI1 על דנ"א למבדה עם מוטיבים של 25× GGAA משמשת דוגמה טובה ליישום וילונות DNA ליצירת עיבוי. EWS-FLI1 הוא חלבון היתוך המשלב את מסוף ה-N של EWSR1 (1-265) ואת מסוף C של FLI1 (220-453). תג mCherry התמזג עם מסוף ה-N של חלבון ההיתוך EWS-FLI1 לצורך הדמיה.

  1. שכפלו את הגן EWS-FLI1 לווקטור pRSF משוחזר או לכל וקטור ביטוי פרוקריוט מתאים אחר.
  2. הפוך את קידוד הפלסמיד 7x His-mCherry-EWSFLI1 לזן E.coli BL21(DE3); לגדל מושבה אחת ב 5 מ"ל של LB בינוני ב 37 מעלות צלזיוס בן לילה. כאשר ערך OD600 מגיע ל-0.6-0.8 לאחר המעבר ל-2 ליטר של LB בינוני, הוסף 0.5 mM IPTG ונער את תרבית התאים ב-18 מעלות צלזיוס למשך 16-18 שעות.
  3. צנטריפוגה התרבית כדי להסיר את supernatant ו resuse את התאים עם חיץ תזה (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M KCl; 1 M אוריאה; 10 mM imidazole; 1.5 mM בטא-מרקפטואתנול (β-ME); ו 5% גליצרול).
  4. לאחר סוניקציה וצנטריפוגה ב 18000 × גרם במשך ~ 30 דקות, לטעון את supernatant על שרף Ni-NTA שיווי משקל בנפח של פי 5 של חיץ תזה, ולאחר מכן לשטוף את השרף עם נפח פי 10 של חיץ כביסה (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M אוריאה, 40 mM imidazole, 1.5 mM β-ME, ו 5% גליצרול).
  5. יש לאטום את החלבון הקשור עם 15 מ"ל של חיץ אלוציה (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M אוריאה, 500 mM אימידזול, 1.5 mM β-ME ו-5% גליצרול) ולרכז את האלוציה ל~500 μL.
  6. טען את תמיסת החלבון המרוכזת על עמודת סינון ג'ל ונתח את המוצרים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד. הקפיאו במהירות את החלבון המטוהר בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

6. הכנת וילונות DNA flowcell

  1. הכינו תא זרימה עם מחסומים ננומטריים של זיג-זג לניסוי וילונות דנ"א וקבעו את כיוון הזרימה. לשם כך, חבר את צינורות הקלט והפלט בכיוון הנכון.
  2. שטפו את תא הזרימה עם 2.5 מ"ל של חיץ שומנים באמצעות שני מזרקים של 3 מ"ל. ודא שאין בועה בתא הזרימה.
  3. הסר את המזרק מן הפלט, והזרקת 1 מ"ל של תמיסת ליפוזום (40 μL של מלאי ליפוזום מסעיף 2 ו 960 μL של חיץ שומנים) שלוש פעמים עם 5 דקות דגירה לאחר כל הזרקה.
  4. לשלב הריפוי, שטפו את תא הזרימה עם 2.5 מ"ל של חיץ שומנים באיטיות, ודגרו ב-RT למשך 30 דקות.
    הערה: זמן ההחלמה יכול להיות ארוך יותר במידת הצורך; אם מופיעות בועות כלשהן, בצע ריפוי כפול על-ידי חזרה על שלבים 5.3 ו- 5.4 כדי להסיר את הבועות.
  5. הכינו 30 מ"ל של חיץ אלבומין בסרום בקר (BSA) (40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, ו-0.5 mg/mL BSA עבור פסיבציה של פני השטח). לאחר 30 דקות של ריפוי, לשטוף את flowcell עם 2.5 מ"ל של חיץ BSA מצד הפלט.
    הערה: מלאי BSA הוא תמיסה של 20 מ"ג/מ"ל המאוחסנת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ויש להשתמש בה תוך שבוע-שבועיים. ניתן לכוונן את ריכוז ה-BSA בחיץ בהתאם למצב פני השטח.
  6. הזרימו 800 μL של מאגר סטרפטווידין (10 μL של מלאי סטרפטווידין של 1 מ"ג/מ"ל, 790 μL של מאגר BSA) לתוך תא הזרימה מצד הקלט בשני שלבים עם 10 דקות של דגירה לאחר כל שלב.
    הערה: הסטרפטווידין מעגן את הדנ"א על השומנים בשל ערכותו הרב-ערכית על ידי גישור בין השומנים הביוטינילטים לבין הדנ"א הביוטינילציה.
  7. שטפו את תא הזרימה עם 2.5 מ"ל של חיץ BSA כדי להסיר את כל מולקולות הסטרפטווידין החופשיות.
  8. לדלל את הדנ"א של ביוטין-למבדה עם מוטיבים משובטים מסעיף 3 באמצעות חיץ BSA (2.5 μL של דנ"א ו-998 μL של חיץ BSA). הזריקו דנ"א למבדה 4 פעמים באיטיות במרווחים של 5 דקות.
  9. הפעל את המיקרוסקופ ואת המערכת המדעית של מוליכים למחצה תחמוצת מתכת משלימה (sCMOS) במהלך ההזרקה. שטפו את הצינורות עם 10 מ"ל של ddH 2 O. שטפו את המנסרה ואת מחבר הצינורות במים,2% מנקה קובט נוזלי ו-99% אתנול. הכן את מאגר ההדמיה על ידי הוספת KCl וצבע DNA דו-גדילי למאגר BSA כדי להשיג ריכוזים סופיים של 150 mM ו- 0.5 nM, בהתאמה, ולתפוס לפחות 20 מ"ל של מאגר ההדמיה לתוך מזרק של 30 מ"ל.
  10. הניחו את תא הזרימה על במת המיקרוסקופ וחברו אותו למערכת המיקרופלואידית.
  11. השתמשו בקצב זרימה של 0.03 מ"ל/דקה כדי לשטוף את מולקולות הדנ"א למחסום למשך 10 דקות, דגרו במשך 30 דקות כשהזרימה הופסקה, ואז כבו אותה כדי לאפשר לדנ"א להתפזר לרוחב.
    הערה: מטרת הדגירה בת 30 הדקות היא לאפשר למולקולת הדנ"א להתפזר באופן שווה יותר מול המחסום באמצעות דיפוזיה פשוטה מכיוון שמולקולות דנ"א נוטות להצטבר בצד המחסום הסגור לקלט שבו הן נשטפות פנימה. ניתן להתאים את זמן הדגירה לפי הצורך.

7. הדמיה של היווצרות עיבוי EWS-FLI1 על וילונות DNA

  1. פתח את תוכנת ההדמיה, מצא וסמן את המיקומים של 3 × 3 תבניות זיג-זג תחת שדה בהיר.
  2. הפעל את הזרימה במהירות של 0.2 מ"ל/דקה כדי להכתים את הדנ"א בצבע הדנ"א הדו-גדילי למשך 10 דקות.
  3. יש לדלל את mCherry-EWS-FLI1 עם חיץ ההדמיה לריכוז של 100 ננומטר ב-100 מיקרון בצינור.
  4. טען את דגימת החלבון דרך השסתום באמצעות מזרק זכוכית של 100 μL, ושנה את קצב הזרימה ל-0.4 מ"ל/דקה.
  5. הפעל את הלייזר 488 ננומטר וסרוק מראש כל אזור כדי לבדוק את מצב התפלגות ה- DNA; בחר את האזור שבו מולקולות הדנ"א מתפזרות באופן שווה. הגדר את עוצמת הלייזר ל- 10% עבור הלייזר של 488 ננומטר ו- 20% עבור הלייזר של 561 ננומטר. השתמש במד הכוח כדי למדוד את עוצמת הלייזר האמיתית ליד המנסרה: 4.5 mW עבור לייזר 488 ננומטר ו- 16.0 mW עבור לייזר 561 ננומטר.
  6. רכישת תמונות
    1. התחל לרכוש תמונות במרווחים של 2 שניות עם לייזרים של 488 ננומטר ו- 561 ננומטר בו-זמנית.
    2. שנה את השסתום ממצב ידני למצב הזרקה כדי לאפשר למאגר ההדמיה לשטוף את דגימת החלבון לתוך תא הזרימה לאחר 60 שניות.
      הערה: תהליך זה ייקח ~ 30 שניות, ושדה הראייה יכוסה באותות mCherry ברגע שחלבוני EWS-FLI1 יגיעו לתא הזרימה.
    3. כדי להסיר EWS-FLI1 בחינם, המשיכו לשטוף את תא הזרימה עם מאגר ההדמיה למשך 5 דקות כאשר רק הלייזר של 561 ננומטר מופעל. עצרו את הזרימה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. הפעל את הזרימה במהירות של 0.4 מ"ל/דקה כדי לאפשר לדנ"א להתרחב, וקבל תמונות במרווחים של 2 שניות בין מסגרות שונות כדי לקבל נתוני תפוקה גבוהה של היווצרות עיבוי EWS-FLI1.

8. ניתוח עוצמה עבור mCherry-EWS-FLI1

  1. ייבא את הנתונים כרצפי תמונות לתוכנת ImageJ, בחר את הפונקטה ב 25× אתרי GGAA בריבוע של 8× 8 פיקסלים, ושמור את התמונה בפורמט .tif.
  2. חשב את העוצמה כסיכום העוצמה בריבוע 8×8 פיקסלים, כולל כל הפונקטה, והסר את הרקע על-ידי הפחתת עוצמת הרקע באזור באותו גודל ליד ריבוע 8 x 8 פיקסלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הסכימה של וילונות דנ"א מוצגת באיור 1A, איור 1B ואיור 1D. רצף המטרה המשוכפל המכיל 25 חזרות רצופות של GGAA נמצא במקדם NORB1 בסרקומה ע"ש יואינג. רצף יעדים זה הוא קריטי לגיוס EWS-FLI128. מולקולות EWS-FLI1 הודגמו על-ידי זיהוי אותות EWS-FLI1 בעלי תווית mCherry שהתקבלו באמצעות לייזר של 561 ננומטר (איור 1C ואיור 1E). לאחר שניסוי ב-DNA Curtains הוקם,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מכיוון שגישות של מולקולה בודדת רגישות ביותר לתכולת מערכת התגובה, יש להשקיע מאמץ נוסף כדי להבטיח איכות טובה של כל החומרים והתמיסות במהלך ניסויי וילונות הדנ"א, במיוחד השומנים שהוכנו בסעיפים 1 ו-2 והמאגרים המשמשים בסעיף 5. יש להשתמש בריאגנטים בעלי טוהר גבוה יותר להכנת חוצצים, ומאגרים חייבים להיות מוכנים טריים לבדיקה של מולקולה בודדת

כאשר EWS-FLI1 בעל התווית של 500 ננומטר mCherry נשטף לתוך התא, הופיעו מספר מגנטה פונקטה בדנ"א של למבדה המכיל את רצפי 25× ה-GGAA. שימו לב שהייתה התפלגות לא ספציפית רציפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NSFC מס '31670762 (Z.Q.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
488 ננומטר דיודה לייזר מצב מוצקקוהרנטיOBIS488LS
561 ננומטר דיודה לייזר מצב מוצקקוהרנטיOBIS561LS
אגרראוןR003215-50 גרם
ביוטיניל DOPEAvanti870273P
סרום בקר אלבומיןסיגמאA7030
כלורופורםאמרסקו1595C027
ציפוי Electra 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02ציפוי המגן המוליך
Deoxyribonuclease I בקרSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti 850375P
DTTSigmaD9779
כיסוי זכוכיתפישר סיינטיפיק12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S
תמציות אריזה למבדהEpicentreMP5120
MgCl2SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
מיקרוסקופ הפוךNikonEclipse Ti
NZCYM מרקSigmaN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000אמרסקו25322-68-3
PMMA 200K, אתיל לקטט 4%Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2%Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B מצלמת CMOSמדעית PHOTOMETRICSPrime95B
פרוטאינאז KNEBP8107S
שקופית זכוכית סיליקהG.Finkenbeiner
שסתום הזרקה שישה כיווניםIdexMXP9900-000
StreptavidinתרמוS888מדולל עם ddH2O
משאבת מזרקמשאבת מכשיר הרווארד11 Elite
T4 DNA LigaseNEBM0202S
Tris baseSigmaT6066
XhoINEBR0146V
YOYO-1 יודיד (491/509)InvitrogenY3601מדולל עם DMSO

מקורות

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מסכי DNAהפרדה פאזיתאונקופרוטאינים של היתוךקונדנסאטים של גורמי שעתוקקונדנסאטים ביו-מולקולרייםשינוי ניידות אלקטרופורטיתתא זרימה מיקרופלואידיסימון ב-mCherry
הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.