מאמר שיטה

בידוד ותרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים ראשוניים באמצעות Y-27632

5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62978

⸱

6 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים שיטה מותאמת לבידוד ולתרבות של תאי אפיתל חניך אנושיים על ידי הוספת מעכב הסלע, Y-27632, לשיטה המסורתית. שיטה זו קלה יותר, גוזלת פחות זמן, משפרת את תכונות תאי הגזע ומייצרת מספר גדול יותר של תאי אפיתל בעלי פוטנציאל גבוה הן עבור המעבדה והן עבור יישומים קליניים.

תקציר

רקמת החניכיים היא המבנה הראשון המגן על רקמות חניכיים וממלא תפקידים משמעותיים בתפקודים אוראליים רבים. אפיתל חניכיים הוא מבנה חשוב של רקמת חניכיים, במיוחד בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לחקר הפונקציות של תאי אפיתל חניכיים יש ערך מדעי מכריע, כגון תיקון פגמים אוראליים וזיהוי התאימות של ביו-חומרים. מכיוון שתאי אפיתל חניכים אנושיים הם תאים קרטין מובחנים מאוד, תוחלת החיים שלהם קצרה, וקשה לעבור. עד כה, יש רק שתי דרכים לבודד לתרבות תאי אפיתל חניכיים, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית. עם זאת, הזמן הנדרש כדי להשיג תאי אפיתל באמצעות שיטת explant ישיר הוא ארוך יותר, ואת שיעור ההישרדות התא של השיטה אנזימטית נמוך יותר. מבחינה קלינית, רכישת רקמת חניך מוגבלת, ולכן יש צורך בבידוד ומערכת תרבות יציבה, יעילה ופשוטה. שיפרנו את השיטה האנזימטית המסורתית על ידי הוספת Y-27632, מעכב קינאז הקשור לרו (ROCK), אשר יכול לקדם באופן סלקטיבי את הצמיחה של תאי אפיתל. השיטה האנזימטית המותאמת שלנו מפשטת את צעדי השיטה האנזימטית המסורתית ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל פולחניים פולחניים, שיש לה יתרונות משמעותיים על פני שיטת ההסבר הישיר והשיטה האנזימטית.

מבוא

הגינגיבה האנושית, מבנה ההגנה הקו הראשון המגן על רקמת חניכיים, הוא לא רקמחסוםפיזי וכימי 1 , אלא גם מפריש סוגים שונים של מתווכים דלקתיים המשתתפים בתגובות חיסוניות ומהוויםמחסוםחיסוני 2,3. האפיתל חניכיים ממלא תפקיד חשוב בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים. לכן, לימוד ההגנה והחסינות של האפיתל חניכיים הוא בעל משמעות רבה להבנת התרחשות, אבחון וטיפול של חניכיים. הבידוד והתרבות של תאי אפיתל חניך מרקמת חניך אנושית הוא הצעד הראשון הנדרש לחקר האפיתל חניך. הליך כזה דורש פעולות בסיסיות כגון ייצור תאי זרעים להנדסת רקמות, מודלים במבחנה של מחלות חניכיים, וחומרים לתיקון פגמים חניכיים.

תאי אפיתל חניכים ראשוניים מאופיינים בשיעור חלוקה נמוך במבחנה4 , חוקרים מחפשים שיטת בידוד וטיפוח אופטימלית במשךעשרותשנים. עד כה, שתי טכניקות שונות, שיטת explant ישירה ושיטה אנזימטית, משמשים בדרך כלל במעבדות כדי להשיג תאי אפיתל חניכיים ראשוניים במבחנה4,5. לשיטת explant ישיר יש יתרונות כגון הדרישה של כמות נמוכה יותר של דגימות רקמה והליך בידוד פשוט, אבל יש לו את החסרונות של זמן תרבות ארוך יותר ורגישות לזיהום5. למרות שהשיטה האנזימטית מקצרת את זמן התרבות הנדרש, היעילות נמוכה יחסית ומשתנה בהתאם לאנזימים ובינוני המשמש. Kedjarune ואח' 6 הראה כי שיטת explant ישיר, אשר דורש יותר זמן לפני תת תרבות (2 שבועות), נראה מוצלח יותר עבור כת תאי אפיתל חניכיים לעומת השיטה אנזימטית. עם זאת, בהשוואה לשתי שיטות אלה, Klingbeil ואח'7 מצא כי השיטה אנזימטית היו התוצאות הטובות ביותר עבור תרביות ראשוניות של תאי אפיתל אוראלי, וניתן היה להשיג את תפוקת התא האופטימלי בתוך פרק הזמן הקצר ביותר (11.9 ימים לעומת 14.2 ימים).

לכן, היה חשוב לפתח שיטה נוחה ויעילה יותר לבידוד ותרבות של תאי אפיתל אוראלי4. דיווחנו בעבר כי הוספת Y-27632, מעכב של קינאז חלבון הקשורים Rho (ROCK), מפשט את הליך הבידוד של תאי אפידרמיס ראשוניים אנושיים וקרטינוציטים מרקמות עור בוגרות8,9,10. פיתחנו G-medium, מדיום חיסון מותנה חדש המפריד באופן ספונטני אפידרמיס מתאי עור ותומך בצמיחה ובתשואה של תאי אפידרמיס ראשוניים8,9,10. במחקר הנוכחי, פיתחנו טכניקת בידוד ותרבות חדשה ללא סרום לתאי אפיתל חניך על ידי שילוב G-medium עם Y-27632. בעיקרו של דבר, השיטה שלנו מבוססת על פישוט של השיטה אנזימטית דו-שלבה המסורתית, ולכן השווינו את השיטה החדשה שלנו עם שיטת explant ישיר. שיטה אנזימטית שונה זו מקצרת באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להפריד תאי אפיתל חניכים מרקמת חניך ומגבירה את היעילות של תאי אפיתל חניך פולחני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

רקמות אנושיות המשמשות בפרוטוקול זה הן רקמות חניך בוגרות טריות שהושלכו מיצוי שיניים מושפעות במחלקה לכירורגיה מקסילופסיאלית על פי הנחיות ועדת האתיקה למחקר אנושי של המכון (פרוטוקול מס '. GR201711, תאריך: 02-27-2017).

1. הכנות

  1. לאסוף רקמות חניכיים למבוגרים טריים ב 15 mL צינורות המכילים 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) בתוספת 3% פניצילין / סטרפטומיצין (P/S) ולשמור על הרקמות ב 4 °C (5 °F).
    הערה: התייחסו לרקמות כמפורט להלן תוך 24 שעות לאחר כריתה.

2. הכן ריאגנטים ומדיום תרבות

  1. הכן את פתרון הכביסה: 3% P/S. לערבב 50 מ"ל של PBS עם 1.5 מ"ל של פניצילין (100 U/ML) ו 1.5 מ"ל של סטרפטומיצין (100 מ"ג / ליטר).
  2. הכן 500 מ"ל של מדיום המכיל גורם גדילה (הנקרא G-medium): DMEM/F12 (3:1) בינוני המכיל 1% P/S, תוספת B27 2%, 20 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה אפידרמיסי (EGF), 40 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה פיברובלסט 2 (FGF2), ו 40 מיקרוגרם /mL של fungizone.
  3. הכן פתרונות לעיכול אנזימים לשיטה החדשה: יש להמיס 125 מ"ג אבקת Dispase ו-125 מ"ג אבקת קולגנאז מסוג I ב-50 מ"ל של DMEM.
    הערה: לסנן את כל פתרונות האנזים באמצעות מסננת 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 °C (70 °F).
  4. הכן 500 מ"ל של המדיום כדי לנטרל את העיכול אנזימטי: 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% P /S במדיום DMEM.

3. שיטת הסבר ישירה

  1. טיפול מקדים ברקמת חניכיים
    1. לשטוף רקמת חניך עם 5 מ"ל של 75% אתנול עבור 30 s. לאחר מכן, יש לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל של תמיסת הכביסה (שלב 2.1) למשך 5 דקות.
      הערה: בצע את כל הכביסות בצלחות תרבית התא עם קוטר של 50 מ"מ.
  2. תרבית תאי אפיתל חניך
    1. חותכים את רקמת חניך ל 1 מ"מ3 חתיכות ולפזר אותם בצלחת תרבית תאים 100 מ"מ. השתמש מלקחיים מחודדים עדינים ומספריים עיניים לפעולות חיתוך.
    2. מוסיפים את ה-G-medium (שלב 2.2) למנת התרבות. לאחר מכן, לדגור על צלחת התרבות באינקובטור5% CO 2 ב 37 °C (5 °F). השתמש במיקרוסקופ הפוך (40x) כדי לבחון את הרקמות כל 24 שעות.
    3. הסר את חתיכות רקמת חניך כאשר תאי האפיתל הופצו לקוטר 2-5 מ"מ סביב חתיכות הרקמה. לשנות את G-בינוני כל 2-4 ימים.

4. השיטה האנזימטית החדשה שהשתנתה

  1. טיפול מקדים ברקמת חניכיים
    1. עבור זאת, בצע את אותם שלבים כמתואר עבור שיטת explant ישיר, שלב 3.1.1.
  2. עיכול רקמת חניך
    1. חותכים את רקמת חניך לחתיכות זעירות, בגודל של כ -<1 מ"מ, עם שני להבים מעוקרים. חזור על תהליך הגריסה עם שני להבים כירורגיים.
    2. הוסף 1 מ"ל של 2.5 מ"ג / מ"ל dispase + פתרון collagenase לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל את חתיכות רקמת חניך, ולאחר מכן לדגור על הצינור במשך 15-20 דקות באינקובטור ב 37 °C (5 °F).
    3. כאשר הרקמה הופכת שקופה ו flocculent, להוסיף 1 מ"ל של פתרון נטרול כדי לסיים את העיכול. מערבבים היטב את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה 10-15 פעמים. להעביר את הפתרון דרך מסנן רשת 100 מיקרומטר.
    4. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות.
    5. הסר את supernatant ו resuspend את גלולה התא בתחתית 10 מ"ל של מדיום המכיל גורם צמיחה (שלב 2.2). העבר את ההשעיה התאית לצלחת תרבית תאים 100 מ"מ. הוסף 10 מיקרומטר של Y-27632 לצלחת תרבית התא.
    6. תרבית התאים ב 37 °C בחממה5% CO 2. החליפו את הג'י-מדיום הישן בג'י-מדיום הטרי כל יומיים. שימו לב לתאים ביום הראשון וביום השלישי.

5. העברת תאים

  1. מוציאים את המנה מהאינקובטור, מוציאים את המדיום המושקע ושוטפים פעמיים עם PBS. יש להוסיף 2 מ"ל של טריפסין 0.05% לכל מנה של 100 מ"מ.
    הערה: לנער את המנה כדי לוודא שיש מספיק מגע בין פתרון טריפסין לתחתית המנה.
  2. השאירו את המנה באינקובטור סביב 5 דקות ב 37 °C (37 °F) לתהליך העיכול.
  3. השתמש במיקרוסקופ (40x) כדי לבחון את התאים ולוודא שרוב התאים נפרדו מתחתית המנה.
  4. הוסף 2 מ"ל של פתרון הנטרול כדי לעצור את העיכול ולהעביר את התאים לתוך צינור 15 מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה 10-15 פעמים. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 5 דקות.
  5. הסר את supernatant לאט. תגדיל מחדש את התאים עם 10 מ"ל של G-medium וספור את מספר התאים.
  6. הוסף כ 1 x 106 תאים ב 10 מ"ל של G-בינוני ו 10 ΜM Y-27632 לכל צלחת 100 מ"מ.
  7. לחדש את G-medium ו- Y-27632 כל יומיים. הצג את התאים ביום הראשון וביום החמישי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג תרשים סכמטי של שיטת ההסבר הישירה ושל השיטה האנזימטית שהשתנתה. שיטת explant ישיר אינו צריך שום אנזים עיכול במהלך כל התהליך. לעומת זאת, השיטה אנזימטית המסורתית בדרך כלל צריך שני סטים של אנזימי עיכול, dispase ו collagenase, כדי להפריד את גיליון האפיתל מן השכבה פיברובלסט הבסיסית, ולאחר מכן trypsin לשחרר את תאי האפיתל לתוך השעיה. השיטה החדשה שלנו משמיטה את שלב ההפרדה והיא שיטה אנזימטית פשוטה. יתר על כן, הוספת Y-27632 ל- G-בינוני מקדמת ביעילות צמיחת תאי אפיתל. שיטת explant ישירה בדרך כ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רקמת החניכיים היא מבנה מפתח השומר על שלמות ובריאות חניכיים. לתאי אפיתל חניכיים יש תפקידים משמעותיים בתיקון והתחדשות של רקמת חניכיים וניתן להשתמש בהם במחקר מדעי וביישומים קליניים ובתחומים קשורים, כולל ביולוגיה אוראלית, פרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה, וליקויים ברירית הפה18. לכן, יש צורך לפתח שיטה יציבה ויעילה לקצור תאי אפיתל אוראלי19. תאי אפיתל ראשוניים הם סוג של תאים מובחנים לחלוטין עם כמה מעברים ותוחלת חיים קצרה. פולחן תאי אפיתל הוכיח להיות מורכב יותר מאשר פולחן פיברובלסטים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי התוכנית המרכזית של הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2019ZD36) ותוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) ל- X.W.; תוכנית המחקר והפיתוח העיקרית של מחוז שאנדונג (2018GSF118240) לג'יי ג'י; פרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2018WS163) ל- Z.X., ופרויקט מדעי הרפואה והבריאות ופיתוח הטכנולוגיה של מחוז שאנדונג (2019WS045) ל- J.S.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שמות, קיצורים וקיצורים תגובות
מונה סלולרי אוטומטישל הרוזנת שנחאי Ruiyu Bio-science& טכנולוגיה Co.Ltd.BBA0218ACאוטומטי ספירת תאים
CO2 חממהתרמו מדעי51026333לדגירה של תאים
Sorvall ST 16R צנטריפוגהתרמו מדעית75004380צנטריפוגה תאים
צלחת תרבית תאיםEppendorf30702115לתרבית תאים
50 מ"ל צינור צנטריפוגהKIRGEN171003לצנטריפוגה תאים
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהKIRGEN190691Jלעיכול תאים
מסננת תאיםקורנינג משולב431792סינון תאים
תמיסה חוצצת פוספטSolarbio Life ScienceP1020-500תמיסת כביסה
DMEMThermo ScientificC11995500רכיב של מדיום נטרול
מוגדר K-SFMחיים טכנולוגיות10785-012אפיתל חניכיים  מדיום תרבית תאים
פניצילין סטרפטומיציןתרמו סיינטיפיק15140-122אנטיביוטיקה
סרום בקרעוברי תעשיות ביולוגיות04-001-1AC5מרכיב של מדיום נטרול
0.05% טריפסיןטכנולוגיות חיים25300-062עבור HGGEPCs
דיסוציאציה מדיום דילולLife Technologies50-9701לציפוי מטריצת
DispaseGibco17105-041לבידוד HGGEPCs
קולגנאז סוג ILife Technologies17100-017לבידוד HGGEPCs
F12 Nutrient Mix, HamsLife Technologies31765035רכיב של
תוסף G-medium B27Life Technologies17504044גורם גדילה ב-G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595גורם גדילה ב-G-medium
Y-27632מעכב ROCKIAD1011
FungizoneGibco15290026הכנת
חלבון אנושי רקומביננטיG-medium GibcoPHG0311גורם גדילה בערכת
ספירת תאים G-medium -8Dojindo Molecular TechnologiesCK04לבדיקת התפשטות תאים
ארנב אנטי-אנושי CK18Abcamab82254לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HGGEPCs
ארנב אנטי-אנושי Cytokeratin10Abcamab76318לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HGGEPCs
טכנולוגיית איתות תאיוימנטין אנטי-אנושית בעכבר3390לצביעה אימונופלואורסצנטית של פיברובלסטים חניכיים
ארנב אנטי-אנושי פאן-קBD550951לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HGGEPCs
ארנב אנטי-Ki67Abcam15580לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HGGEPCs
ארנב אנטי-p63Biolegend619002לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HGGEPCs
ארנב anti-p75NGFRAbcamab52987לצביעה אימונופלואורסצנטית לבדיקת סמן התמיינות של HGGEPCs

מקורות

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ROCK

מאמרים קשורים