כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית
במאמר זה
סיכום
תקציר
האורגנויד המוחי שמקורו ב- iPSC הוא טכנולוגיה מבטיחה למידול במבחנה של הפתולוגיות של מערכת העצבים והקרנת סמים. טכנולוגיה זו התפתחה לאחרונה. הוא עדיין בחיתוליו ויש לו כמה מגבלות שעדיין לא נפתרו. הפרוטוקולים הנוכחיים אינם מאפשרים להשיג organoids להיות עקבי מספיק לגילוי סמים ומחקרים פרה קליניים. ההתבגרות של organoids יכול לקחת עד שנה, דוחף את החוקרים להשיק תהליכי בידול מרובים בו זמנית. היא מטילה עלויות נוספות עבור המעבדה מבחינת שטח וציוד. בנוסף, אורגנוידים במוח לעתים קרובות יש אזור נמק במרכז, אשר סובל ממחסור בחומרים מזינים וחמצן. לפיכך, רוב הפרוטוקולים הנוכחיים להשתמש במערכת במחזור עבור מדיום תרבות כדי לשפר את התזונה.
בינתיים, אין מערכות דינמיות זולות או bioreactors לטיפוח organoid. מאמר זה מתאר פרוטוקול לייצור אורגנוידים במוח במיני-רה-קטרים ביתיים קומפקטיים וזולים. פרוטוקול זה מאפשר קבלת organoids באיכות גבוהה בכמויות גדולות.
מבוא
מודלים אנושיים נגזר iPSC נמצאים בשימוש נרחב במחקרים של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירודגנרטיביות1. במהלך העשור האחרון, מודלים של רקמת מוח תלת-ממדית, מה שמכונה organoidsהמוח, השלימו למעשה תרביות עצביות 2D מסורתיות . האורגנוידים מסכמים במידה מסוימת את הארכיטקטורה התת-ממדית של המוח העוברי ומאפשרים מידול מדויק יותר. פרוטוקולים רבים מתפרסמים עבור הדור של organoids המייצגים אזורי מוח שונים: קליפת המוח3,4,5, המוח הקטן6, המוח האמצעי, המוח הקדמי, ההיפותלמוס7,8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: השתמש בטכניקה סטרילית לאורך הפרוטוקול, למעט שלבים 1.2 ו- 1.3. לחמם את כל מדיה תרבותית ופתרונות ל 37 °C (7 °F) לפני החלת על תאים או organoids. לטפח תאים באינקובטור CO2 ב 37 °C ב 5% CO2 על 80% לחות. ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
1. הפיכת מנות פטרי למיני ביו-ריאקטורים
- לחתוך סטרילי 15 mL צינורות צנטריפוגות בטבעות של 7-8 מ"מ גובה; תבודד את הטבעות באופן אוטומטי.
- לשבור דבק נמוך, לא מטופל או מנות פטרי מיקרוביולוגיות לפירורים. ממיסים כ 1 גרם של פירורי פלסטיק ב 10 מ"ל של כלורופורם לילה כדי להכין פלסטיק נוזלי.
זהירות: תעבדו במכסה המנוע. - בדוק כי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ערכת הפרוטוקול מוצגת באיור 1. הפרוטוקול כלל חמש מדיה שבה IPSCs נבדלו לאורגנואידים במוח במהלך חודש אחד לפחות. ההבחנה החלה ואז IPSCs הגיעו למפגש של 75-90%(איור 2A,B). הסימנים הראשונים של בידול כלפי נוירונים נצפו בימים 10-11 של טיפוח iPSC במצב בינוני A כאשר תאים החלו להתקבץ לתוך "rosettes" (איור 2C). בימים 14-15, IPSCs נבדל לאבות נוירו-אפיתל. 99% מהתאים היו חיוביים על סמן נוירו-אפיתל SOX1 ולא הביעו סמני תאים פלוריפוטנט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים מכריעים המאפשרים יצירת אורגנוידים באיכות גבוהה בגודל אחיד. ראשית, האורגנוידים גדלים מפרואידים שהם כמעט זהים במספר התא ובבגרות התא. שנית, הביו-ראקטורים תוצרת בית מספקים לכל אורגנויד סביבה אחידה, שבה האורגנוידים אינם מצטופפים או נשארים זה לזה.
איכות התא ומצב הבשלת התא חיוניים לביצוע הפרוטוקול. זה קריטי להתחיל בידול עצבי ב 75-90% מפגש של IPSCs. אם צפיפות התאים נמוכה מדי, ה- iPSCs יכול להבדיל לכיוונים שאינם עצביים. חשוב לא לחרוג משבועיים של אינדוקציה עצבית של IPSCs .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק 075-15-2019-1669 ממשרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית (ניתוח RT-PCR) ועל ידי מענק מס '19-15-00425 מקרן המדע הרוסית (לכל עבודה אחרת). המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מתקדם DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | צלחת תרבית 24 בארות עם מיקרווולות |
| תוסף B-27 | תוסף Gibco | 17504044 | תוסף עצבי B |
| תוסף GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין |
| BDNF אנושי | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| FGF-2 אנושי | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| GDNF אנושי | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| החלפת סרום נוקאאוט | Gibco | 10828028 | החלפת סרום |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | מדיום תאי גזע פליפוטנטי |
| N2 תוסף | Gibco | ||
| מדיום נוירובזאלי | Gibco | 21103049 | מדיום בזאלי לתחזוקת תאי עצב |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140130 | |
| פלסמוצין | InvivoGen | ant-mpt-1 | אנטי מיקרוביאלים |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 מ"מ EDTA ב-PBS |
| &בטא;-מרקפטואתנול | Gibco | 31350010 |
מקורות
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
