מאמר שיטה

פינצטה מגנטית בפורמט Microplate

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62994

⸱

9 בפברואר 2022

 , 
1Department of Oncology and Metabolism, University of Sheffield

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים את השימוש בבדיקת מיקרו-פלטות חדשה כדי לאפשר מניפולציה מכנית של ביומולקולות תוך ביצוע בדיקות ביוכימיות אנסמבל. זה מושג באמצעות מכסה מיקרו-פלטה ששונה עם מגנטים ליצירת פינצטה מגנטית סטטית מרובה על פני המיקרו-לוח.

תקציר

מכאנוביולוגיה מתארת כיצד הכוחות הפיזיקליים והתכונות המכניות של חומר ביולוגי תורמים לפיזיולוגיה ולמחלות. בדרך כלל, גישות אלו הן שיטות מוגבלות של מולקולה אחת, מה שמגביל את זמינותן. כדי לענות על צורך זה, פותחה בדיקת מיקרופלייט המאפשרת מניפולציה מכנית תוך ביצוע בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות. זה מושג באמצעות מגנטים המשולבים במכסה מיקרופלייט ליצירת פינצטה מגנטית מרובה. בפורמט זה, מופעל כוח על פני ביומולקולות המחוברות לחרוזים פרמגנטיים, שווה ערך לפינצטה מגנטית טיפוסית. המחקר מדגים את היישום של כלי זה עם מבחנים מבוססי FRET לניטור קונפורמציות חלבון. עם זאת, גישה זו ישימה באופן נרחב למערכות ביולוגיות שונות, החל ממדידת פעילות אנזימטית ועד להפעלת מסלולי איתות בתאים חיים.

מבוא

המכנוביולוגיה מתמקדת בהבנת האופן שבו התפשטות הכוחות הפיזיקליים בתוך התאים וביניהם, מווסתת את הפעילות התאית 1,2 וכיצד זה מתאם עם הארגון והדינמיקה של חלבונים ותאים כאחד.

מדידות כוח של מולקולה בודדת חשפו כיצד משתמשים בכוח במערכות ביולוגיות, מחלבונים בודדים ועד תאים ורקמות שלמות 3,4,5,6,7. ניסויים מאתגרים אלה דורשים ציוד מיוחד ומומחיות טכנית. לעומת זאת, ניתן לבצע בדיקות ביוכימיות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה יותר בציוד מסחרי זמין.

כאן, המחקר מתאר מבחן מכניביולוגיה המאפשר לבצע מניפולציה מבוססת פינצטה מגנטית ובדיקות ביוכימיות יחד8. מגנטים מונחים על מכסה מיקרו-לוח מודפס בתלת מימד (איור 1A-D), המאפשר שימוש בקוראי לוחות מסחריים עבור הבדיקות. כוח מופעל על פני הביו-מולקולה המעניינת על ידי צימוד המולקולה לחלקיקים פרמגנטיים. לאחר מכן המגנטים מפעילים מתח על פני המולקולה. שינוי המרחק בין החלקיקים למגנטים מתאים את הכוח המופעל על פני הביו-מולקולה (איור 1E).

אנו מייצגים את השימוש בבדיקה זו באמצעות המנוע המולקולרי מבוסס האקטין, מיוזין VI. מיוזין VI מווסת על ידי קיפול לאחור תוך מולקולרי9. הוכח כי מיוזין VI קיים במצב מעוכב עצמי, לפיו קשירת חלבונים שותפים, כגון NDP52, מעוררת את התפתחות המיוזין VI10,11. כדי לבצע בדיקות אלה, נשתמש במבנה בעל תווית כפולה של תחום הזנב של מיוזין VI עם GFP N-terminal ו-C-Terminal RFP לפיו קיפול חוזר של החלבון מייצר העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) בין GFP ל-RFP. מסוף ה-N נושא גם תג ביוטינילציה כדי לשתק את החלבון על פני השטח. אנו משתמשים בבדיקה זו בשילוב עם מדידות FRET כדי להראות כיצד כוח יכול להשפיע על קיפול לאחור של מיוזין VI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

חלבונים לדוגמה הנדרשים לניסוי זה ורשימת ריאגנטים נמצאים בטבלת החומרים. יש לייצר חלבונים שווי ערך למערכת המחקר של המשתמש כדי למדוד שינויים בקונפורמציה.

מכסה מגנטי מודפס 1. 3D

  1. תכנן מכסה מיקרו-פלטה כדי לאכלס את המגנטים בתוך מיקרו-פלטה של 24 בארות. ניתן להוריד קובץ CAD לדוגמה מ-GitHub12. המדידות מוצגות באיור 1.
    הערה: ניתן לשנות את גובה הכן כדי לשנות את המרחק בין מגנטים למשטח כדי לשנות את הכוח המופעל. בנוסף, הכוח הסופי המופעל על החלקיק תלוי בגודל החלקיקים ובמרווח בין זוג המגנטים. משוואות לחישוב הכוח המופעל עבור חלקיקים של 1 מיקרומטר ו-2.8 מיקרומטר במרווחים של 0.5 מ"מ, 1 מ"מ ו-2 מ"מ ניתנות ב-Dos Santos et al.8. עבור הניסויים המתוארים כאן עם חלקיקים של 2.8 מיקרומטר ופער של 2 מ"מ, השתמש במשוואה 1.
    משוואה 1: figure-protocol-1
  2. הדפס בתלת מימד מכסה מיקרופלייט באמצעות פוליאתילן טרפתלט גליקול (PETG) על מערכת מדפסת תלת מימד.
    הערה: השתמש במדפסת עם רזולוציית שכבה של 0.02 מ"מ כדי לאפשר דיוק ושחזור. ההשפעה של דיוק המדפסת נדונה ב- Dos Santos et al.8.
  3. חבר זוגות של מגנטים Neodymium N42 קובייה 5 מ"מ באמצעות דבק אל הכן כאשר הקטבים המגנטיים מכוונים ליצירת השדה המכוון לתחתית המיקרו-פלטה.
  4. השאר לפחות עמדה אחת ריקה כדי לשמש כבקרה ללא מגנט.
  5. יש לאחסן בכלי אטום בגודל מספיק כדי להניח ולהסיר את המכסה בקלות.

2. שינוי משטח מיקרופלייט

  1. קח מיקרופלייט נקי ולא מטופל עם תחתית זכוכית עם 24 בארות.
  2. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפה (50 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5) ו-50 מ"מ NaCl) בטמפרטורת החדר.
  3. הוסיפו 200 מיקרוליטר של ביוטין-BSA (0.2 מ"ג/מ"ל) למאגר הכביסה והשאירו אותו ללא הפרעה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ביוטין-BSA משמש הן לפסיבציה והן לחיבור. ניתן להשתמש באסטרטגיות אחרות של פסיבציה והתקשרות פני השטח. לשימוש ראשון ואופטימיזציה, ניתן לשנות את ריכוז הביוטין-BSA עד 1 מ"ג/מ"ל.
  4. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
  5. הוסף 200 מיקרוליטר של סטרפטווידין (20 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר הכביסה והשאיר אותו ללא הפרעה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: לשימוש בפעם הראשונה, ניתן לשנות את ריכוז הסטרפטווידין עד 1 מ"ג/מ"ל.
  6. הסר את התמיסה ולאחר מכן שטוף את הבארות פי 3 עם מאגר כביסה.
  7. מכסים את הבארות במאגר כביסה של 500 מיקרוליטר.
  8. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שמוכן לשימוש. יש להשתמש בצלחות באותו יום.

3. הכנת דגימה: קיבוע חלבון

  1. אפשר למיקרו-פלטת שהשתנתה על פני השטח להגיע לטמפרטורת החדר.
  2. שוטפים את הבארות עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
  3. הוסף 100 ננומטר ביוטין-eGFP-Myosin VI Tail-mRFP (חלבון דגימת מלאי) ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר במאגר הכביסה.
    הערה: חלבון לדוגמה זה מיוצר כמתואר על ידי Dos Santos et al.8. הריכוזים וזמני הדגירה יכולים להשתנות בהתאם לחלבון.
  4. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
  5. הגדר את קורא הלוחות כדי להקליט ספקטרום פלואורסצנטי עבור GFP (עירור 490 ננומטר ופליטה 510-600 ננומטר) ו-RFP (עירור 560 ננומטר ופליטה 580-650 ננומטר) כדי לאשר את נוכחותם של חלבוני ההיתוך.
  6. אם יש מחסור בחלבון, הגדל את הריכוז בשלב 3.3.
    הערה: קשירה לקויה יכולה להיות קשורה לקשירת ביוטין-BSA ו/או סטרפטווידין לא מספקת, ולכן ניתן להגדיל את הכמויות פי 10.
  7. במידת האפשר, בצעו מדידת סריקה היטב כדי לקבוע אם חלבון ההיתוך קשור על פני המיקרו-לוח (איור 2).
    הערה: מדידה זו תתעד את עוצמת הקרינה בנקודות ספציפיות על פני באר המיקרו-לוחית. זה יגלה אם החלבון קשור על פני הבאר.
  8. ודא שהאות אחיד (בטווח של 5%) במרכז הבאר שבה מתרחשת מדידת הבדיקה.

4. הכנת חרוזים מגנטיים

  1. מערבולת הבקבוקון של חרוזים פרמגנטיים של 2.8 מיקרומטר עם חלבון רקומביננטי A (טבלת חומרים) למשך 30 שניות כדי להשעות מחדש את החרוזים.
  2. העבירו את הנפח המתאים ל -1 מ"ג חרוזים פרמגנטיים לצינור של 1.5 מ"ל.
  3. הנח את הצינור במבודד מגנטי (טבלת חומרים) ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.
  4. השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של PBS על ידי פיפטינג עדין של התמיסה למעלה ולמטה.
  5. הנח את הצינור במבודד המגנטי ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט.
  6. חזור על שלב הכביסה 3x.
  7. לדלל 10 מיקרוגרם של נוגדן Anti-RFP ב-200 מיקרוליטר של PBS.
  8. בודד את החרוזים במבודד המגנטי ולאחר מכן השהה מחדש בתמיסת הנוגדנים.
  9. סובב ב -20 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב ספסל.
  10. הנח את הצינור במבודד המגנטי והסר את הסופרנטנט.
  11. שטפו 3 פעמים ב-PBS.
  12. השעו מחדש את החרוזים ב -200 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
  13. כדי לאשר קיבוע נוגדנים על החרוזים, דגרו את החרוזים העמוסים בנוגדנים בתמיסה של חלבון היתוך RFP של >1 מיקרומטר.
    הערה: ודא חזותית אם החלבון מבודד על ידי החרוזים.
  14. לחלופין, מדוד את עוצמת הקרינה של הסופרנטנט (עירור 560 ננומטר ופליטה 580-650 ננומטר) עבור RFP בספקטרומטר פלואורסצנטי.

5. הכנה לדוגמא: חיבור חרוזים

  1. הוסף 10 מיקרוגרם של היתוך החרוזים-נוגדנים הפרמגנטיים המדולל במאגר הכביסה (200 מיקרוליטר) לבארות המיקרו-פלייט הקשורות לחלבון.
  2. אל תניח חרוזים בבאר בקרה אחת כדי לבדוק את השפעת החרוזים על האות הפלואורסצנטי. הכן דגימת בקרה ללא נוגדנים כדי לקבוע אינטראקציות לא ספציפיות עם החרוזים.
  3. דגרו את המיקרופלטה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. שטפו את הבארות פי 3 עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה.
  5. אם זמין באופן מקומי, בדוק שהחרוזים קשורים לפני השטח במיקרוסקופ שדה בהיר. אם יש מחסור בחרוזים, הגדל את הריכוז בשלב 5.1 עד 500 מיקרוגרם/מ"ל.

6. רכישת נתונים

  1. הנח את המיקרופלייט, ללא מכסה, לקורא צלחות פלורסנט בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
  2. הגדר את קורא הצלחות כדי להקליט ספקטרום פלואורסצנטי עבור GFP (עירור 490 ננומטר ופליטה 510-600 ננומטר) ו-RFP (עירור 560 ננומטר ופליטה 580-650 ננומטר) כדי לאשר את נוכחותם של חלבוני ההיתוך.
    הערה: מדוד/הקלט את ספקטרום הקרינה דרך החלק התחתון של המיקרופלייט כדי להניח את המכסה מעל. לכן, יש לבחור קורא מיקרו-פלטות מתאים.
  3. רשום ספקטרום פלואורסצנטי FRET (עירור 490 ננומטר ופליטה 510-650 ננומטר), או עקוב אחר הקרינה ב-510 ננומטר ו-610 ננומטר עם עירור ב-490 ננומטר. זה מוגדר בהתאם להנחיות היצרן.
  4. הסר את המיקרו-פלטת מהקורא והוסף את המכסה המגנטי.
  5. חזור לקורא הצלחות והשאיר את הדגימה למשך 2 דקות.
  6. חזור על מדידת ה-FRET, כמו בשלב 6.3.

7. ניתוח נתונים

  1. ייצא את הנתונים לייבוא לגיליון אלקטרוני (למשל, Excel).
  2. חלץ ידנית את הנתונים עבור תורם GFP ב-510 ננומטר ומקבל RFP ב-610 ננומטר.
  3. חשב FRET יחסי באמצעות משוואה 2 עבור כל תנאי.
    משוואה 2: figure-protocol-2
    A: עוצמת המקבל (RFP 610 ננומטר), D: עוצמת התורם (GFP 510 ננומטר).
    הערה: השתמש ב-RFP הרקומביננטי באותם תנאי עירור ופליטה כדי לשלוט בעירור הרקע של המקבל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2 מציג דוגמה למדידת סריקת באר שבה עוצמת הקרינה של GFP נרשמה במרווחים של 1 מ"מ על פני באר המיקרו-לוחית. מדידות פלואורסצנטיות אופייניות מבוצעות במיקום המרכזי של באר המיקרופלייט (מיקום 8,8 באיור 2); לכן חשוב שיהיה חלבון קשור במיקום זה. כפי שמוצג באיור 2, העוצמה היא הגבוהה ביותר במרכז הבאר ברדיוס של כמה מילימטרים. בדרך כלל, קיבוע עדיף הרחק משולי הבאר, אולי בגלל קשירת חלבון לדפנות הצדדיות. האות הגרוע עקב חוסר קשירת חלבון או פגמים בב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

גישה זו מאפשרת ליישם בקלות מדידות מבוססות כוח במיקרופלייט באמצעות קוראי לוחות פלורסנט. חשוב לציין, פורמט בדיקה זה מניח שיש חלבון פונקציונלי כאשר הוא קשור למשטח. לכן, נדרש ידע מוקדם לפני תחילת המדידות הללו כדי להבטיח פעילות חלבון. כדאי גם לוודא שקשירת המולקולות לחרוזים הפרמגנטיים ולמשטח מותאמת לכל מערכת.

ניתן לשנות מושג זה כך שיתפקד על פני כל סוגי המיקרו-לוחות; עם זאת, יהיה צורך להתאים את בחירת המגנט למיקרו-לוחות מעל 24 בארות, מכיוון שמגנטים אינם יכולים להיכנס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים ל-Cancer Research UK (A26206), ל-MRC (MR/M020606/1) ולחברה המלכותית (RG150801) על המימון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
24 בארות מיקרופלייט עם תחתית זכוכיתCellvisP24-1.5H-Nמקורות מרובים זמינים. אלא אם כן יש צורך, עדיף להימנע ממשטחים מטופלים ואנו משתמשים בזכוכית בדרגת הדמיה N1.5.
נוגדן נגד RFPAbcamab290מקורות מרובים זמינים אך חייבים להבטיח שיש תגובתיות מינימלית עם GFP.
מיקרוסקופ אור עליון ספסלOptikaIM-3
ספסל עליון מסובבקול-פאלמר-סטיוארטSB3
ביוטין-BSAסיגמא אולדריץ'A8549
תוכנת CAD - Sketch Up EducatorSketch Upניתן להשתמש בתוכנות CAD חלופיות. על המשתמשים לוודא שפורמטי הקבצים תואמים למדפסת התלת מימד שלהם.
Dynabeads חלבון AFisher Scientific107467132.8 ומיקרו; m חרוזים פרמגנטיים עם חלבון רקומביננטי A
דבק מגע אימפקטEVO-STIK
MagnaRack מתלה הפרדה מגנטיThermoFisher ScientificCS15000מבודד מגנטי
NaClFisher Scientific10316943
Neodymium N42 5 מ"מ קובייה מגנטיםSupermagneteW-05-N
קורא צלחות - ClarioStarBMG Labtechניתן להשתמש בכל מערכות קורא הלוחות כאשר ניתן לבצע מדידות מתחת למיקרופלייט. מכסה המגנט אינו כולל מדידות סטנדרטיות מלמעלה
StreptavidinSigma Aldrich189730
Tris-HClFisher Scientific10142400
Ultimaker PETG נימהUltimaker
Ultimaker S3 - מדפסת תלת מימדUltimaker

מקורות

  1. Jansen, K. A., et al. A guide to mechanobiology: Where biology and physics meet. Biochimica et Biophysica Acta. 1853, 3043-3052 (2015).
  2. Dos Santos, A., Toseland, C. P. Regulation of nuclear mechanics and the impact on dna damage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 3178(2021).
  3. Dos Santos, A., et al. DNA damage alters nuclear mechanics through chromatin reorganization. Nucleic Acids Research. 49 (1), 340-353 (2020).
  4. Elosegui-Artola, A., et al. Force triggers YAP nuclear entry by regulating transport across nuclear pores. Cell. 171, 1397-1410 (2017).
  5. Lherbette, M., et al. Atomic force microscopy micro-rheology reveals large structural inhomogeneities in single cell-nuclei. Scientific Reports. 7, 8116(2017).
  6. Seo, D., et al. A mechanogenetic toolkit for interrogating cell signaling in space and time. Cell. 165, 1507-1518 (2016).
  7. Yao, M., et al. The mechanical response of talin. Nature Communications. 7, 11966(2016).
  8. Dos Santos, A., Fili, N., Pearson, D. S., Hari-Gupta, Y., Toseland, C. P. High-throughput mechanobiology: Force modulation of ensemble biochemical and cell-based assays. Biophysical Journal. 120, 631-641 (2021).
  9. Fili, N., Toseland, C. P. Unconventional myosins: How regulation meets function. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 67(2019).
  10. Fili, N., et al. Competition between two high- and low-affinity protein-binding sites in myosin VI controls its cellular function. Journal of Biological Chemistry. 295, 337-347 (2020).
  11. Fili, N., et al. NDP52 activates nuclear myosin VI to enhance RNA polymerase II transcription. Nature Communications. 8, 1871(2017).
  12. MagPlate at GitHub. , Available from: https://github.com/cptoseland/MagPlate (2021).
  13. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6, 85-95 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FRET
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים