פרוטוקול זה מציג בדיקת ספיגת חומצות אמינו עם תווית רדיו, אשר שימושית להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים ראשוניים או בעצמות מבודדות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ובצירי עצם מבודדים
במאמר זה
סיכום
תקציר
התפתחות העצם וההומאוסטזיס תלויה בהתמיינות ובפעילות של אוסטאובלסטים יוצרי עצם. התמיינות אוסטאובלסט מאופיינת ברצף על ידי התפשטות ואחריה סינתזת חלבונים ובסופו של דבר הפרשת מטריצת עצם. התפשטות וסינתזת חלבונים דורשות אספקה מתמדת של חומצות אמינו. למרות זאת, מעט מאוד ידוע על צריכת חומצות אמינו באוסטאובלסטים. כאן אנו מתארים פרוטוקול רגיש מאוד שנועד למדוד צריכת חומצות אמינו באמצעות חומצות אמינו מסומנות ברדיו. שיטה זו מותאמת לכימות שינויים בספיגת חומצות אמינו הקשורים להתרבות או התמיינות של אוסטאובלסט, טיפולים תרופתיים או גורמי גדילה, או מניפולציות גנטיות שונות. חשוב לציין שניתן להשתמש בשיטה זו לסירוגין כדי לכמת את צריכת חומצות האמינו בקווי תאים בתרבית או בתאים ראשוניים במבחנה או בפירי עצם מבודדים ex vivo. לבסוף, השיטה שלנו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי למדוד את ההובלה של כל חומצות האמינו, כמו גם גלוקוז וחומרים מזינים אחרים radiolabeled.
מבוא
חומצות אמינו הן תרכובות אורגניות המכילות קבוצות פונקציונליות של חומצות אמינו (-NH2) וקרבוקסיל (-COOH) עם שרשרת צדדית משתנה הספציפית לכל חומצת אמינו. באופן כללי, חומצות אמינו ידועות כמרכיב הבסיסי של חלבון. לאחרונה הובהרו שימושים חדשים ותפקודים של חומצות אמינו. לדוגמה, חומצות אמינו בודדות יכולות לעבור מטבוליזם כדי ליצור מטבוליטים ביניים התורמים לביו-אנרגיה, מתפקדים כקופקטורים אנזימטיים, מווסתים מיני חמצן תגובתי או משמשים לסינתזה של חומצות אמינו אחרות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הליכי העכבר המתוארים כאן אושרו על ידי ועדות המחקר בבעלי חיים במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס. פרוטוקול הקרינה אושר על ידי הוועדה המייעצת לבטיחות קרינה במרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן בדאלאס.
1. ספיגת חומצות אמינו בתאים (פרוטוקול I)
- צלחת 5 x 104 תאי ST2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה 12 בארות. תאי צלחת ב-α-MEM המכילים 10% FBS, 100 U/mL פניצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (Pen/Strep). צלחת בארות נוספות של תאים כדי לכמת את מספר התא לכל תנאי עבור הנורמליזציות בשלב 1.12. דגירה של תאים באינקובטור של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- ת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הובלת חומצות אמינו מווסתת על ידי מובילי חומצות אמינו רבים הקשורים לממברנה אשר סווגו למערכות הובלה נפרדות המבוססות על מאפיינים רבים, כולל ספציפיות מצע, קינטיקה, כמו גם תלות יונים ו- pH25. לדוגמה, ספיגת גלוטמין יכולה להיות מתווכת על ידי מערכות ההובלה התלויות Na+ A, ASC, γ+L ו- N או מערכת L הבלתי תלויה ב- Na+-. המערכות התלויות ב-Na+ נבדלות על ידי היכולת להחליף את Li+ ב-Na+ (מערכת N) או ברגישות לחומצה האנלוגית 2-(מתילאמינו)איזובוטירית (MeAIB) (מערכת A)........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה מהירה ורגישה להערכת ספיגת חומצות אמינו בתגובה לתמורות ניסיוניות שונות במבחנה או ex vivo. בהשוואה לערכות הזמינות מסחרית (למשל, גלוטמין וערכת קביעת גלוטמט), שיטה זו הרבה יותר רגישה, מהירה ופחות דורשתעבודה של 16,17,25. בפרוטוקול שלנו, אנו מעריכים קליטה במאגר קרבס רינגרס HEPES. אנו משתמשים במדיה זו מכיוון שהיא נוסחה בסיסית המאפשרת שינויים מהירים וקלים כדי לבחון מגוון רחב של תנאים לאפי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין גילויים.
תודות
מעבדת קרנר נתמכת על ידי מענקי R01 של המכון הלאומי לבריאות (AR076325 ו-AR071967) ל-C.M.K.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% טריפסין | Gibco | 25200 | |
| צלחת 12 בארות | Corning | 3513 | |
| 1 מ"ל מזרק | BD דיוק | 309628 | |
| 30G מחט | BD דיוק | 305106 | |
| ארגינין מונוהידרוכלוריד L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 מונה נצנוץ | |||
| סידן כלורי | סיגמא | C1016 | |
| כולין כלוריד | סיגמא | C7077 | |
| D-(+)-תמיסת גלוקוז | סיגמא | G8769 | |
| מלקחיים לכלי | , מספריים, סקייפלס | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית | סיגמא | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-גלוטמין | Perkinבקבוקוני | ||
| Sigma | Z190535 | ||
| תמיסת ליתיום כלוריד, 8M | Sigma | L7026 | |
| מגנזיום כלוריד | Sigma | M8266 | |
| MEMα | צינור מיקרוצנטריפוגה Gibco | 12561 | |
| 15 מ"ל | ביוטיקס | 89511-256 | |
| NP-40 | סיגמא | 492016 | |
| אשלגן כלורי | סיגמא | P3911 | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא | S6014 | |
| נתרן כלורי | סיגמא | S9888 | |
| נתרן דאוקסיכולאט | סיגמא | D6750 | |
| נתרן דודציל סולפט | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& חומרים: | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (תמיסת נצנוץ) | PerkinElmer | 6013329 | |
| &-(Methylamino), חומצה איזובוטירית | Sigma | M2383 |
מקורות
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
