צינור מתודולוגי גמיש לזיהוי, הדמיה וכימות של תהליכים עצביים תת-תאיים דקים בתוך נפחי תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים הסורק קרן יונים ממוקדת באמצעות חבילות תוכנה ידידותיות למשתמש בקוד פתוח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שחזור וניתוח תלת מימד של מבנים עצביים תת-תאיים דקים באמצעות נתוני מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מאפשרת כעת ניתוח תלת מימדי מהיר (תלת מימד) של תהליכים תת-תאיים אולטרה-דקים. כאן, מוצג צינור מתודולוגי לזיהוי, הדמיה וניתוח של תהליכים עצביים דקים, כגון אלה המוקרנים לתוך הבוטונים הפרה-סינפטיים של נוירונים אחרים (המכונים 'ספינולים'). באמצעות חבילות תוכנה הזמינות בחינם, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בעץ החלטות כדי לזהות מבנים תת-תאיים עצביים נפוצים באמצעות קריטריונים מורפולוגיים בתוך נפחי תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM), עם תשומת לב מיוחדת לזיהוי מגוון של ספינולים המוקרנים לתוך בוטונים פרה-סינפטיים. בפרט, פרוטוקול זה מתאר כיצד לעקוב אחר ספינולים בתוך סינפסות עצביות כדי לייצר שחזורים תלת מימדיים של הקרנות תת-תאיות דקות אלה, נויריטני ההורים שלהם ושותפים פוסט-סינפטיים. בנוסף, הפרוטוקול כולל רשימה של תוכנות קוד פתוח הזמינות בחינם לניתוח נתוני FIB-SEM ומציע טיפים (למשל, החלקה, תאורה) לשיפור שחזורים תלת מימדיים להדמיה ופרסום. פרוטוקול ניתן להתאמה זה מציע נקודת כניסה לניתוח מהיר בקנה מידה ננומטרי של מבנים תת-תאיים בתוך נפחי תמונה FIB-SEM.
מבוא
חקירות של יחסי מבנה-פונקציה של רכיבים תת-תאיים דקים בננומטר נהנות לעתים קרובות מהדמיה וניתוח תלת מימד1. עם זאת, מחקרי מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת חתך טורי הוגבלו זמנית ומרחבית על ידי הצורך להשתמש בסכין יהלום כדי לחתוך וליישר מאות עד אלפי מקטעים אולטרה-דקים טוריים של ≥40 ננומטר. אילוצים אלה הגבילו את היכולת לדגום ולנתח ביעילות מבנים תת-תאיים דקים (בקוטר <40 ננומטר), והצורך להיות מיומן בחתך טורי אולטרה-דק פגע ביישום של ניתוחים מבניים תלת מימדיים 2,3. עם זאת, ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) חוללה מהפכה במהירות וברזולוצי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. נתוני נפח תמונה וגודל אובייקט תת-תאי: שיקולים ורישום
- השג נפח תמונה FIB-SEM איכותי של אזור העניין המכיל את האובייקטים התת-תאיים המעניינים.
הערה: פרוטוקול זה משתמש במקטעים של נפח תמונה FIB-SEM מקליפת המוח הראייתית הראשונית של חמוס מתבגר מאוחר (24.2 x 16.2 x 2.4 מיקרומטר, ווקסלים איזוטרופיים של 4 ננומטר), ונפח FIB-SEM נגיש באופן חופשי מההיפוקמפוס CA1 של חולדה בוגרת (10.2 x 7.7 x 5.3 מיקרומטר; ווקסלים איזוטרופיים של 5 ננומטר) הזמינים על ידי מעבדת נוט (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). זה קריטי להכין גושי רקמות עבור FIB-SEM באמצעות פרוטוקול השומר על פרטים אולטרה-מבניים ומייצר ניגודיות גבוהה בתנאי הדמיה FIB-SE....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כימות אחוז הספינולים הסינפטיים בתוך אוכלוסיית הבוטונים הפרה-סינפטיים המעוררים בקליפת המוח הראייתית הראשונית של חמוס
למרות שבליטות דמויות ספינול מנוריטים לבוטונים פרה-סינפטיים מעוררים נצפו במשך עשרות שנים19,26, חשיבותם הפוטנציאלית לתפקוד הסינפטי נותרה מעורפלת. ניסויים אלה נועדו לקבוע את שיעור הבוטונים הפרה-סינפטיים המעוררים המכילים ספינולים לאורך ההתפתחות שלאחר הלידה בקליפת המוח הראייתית הראשונית של החמוס (V1) כדי לוודא את החשיבות הפוטנציאלית ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צינור ניתוח נפח תמונה FIB-SEM זה יכול לייצר שחזורים תלת מימדיים אמינים ומדידות כמותיות של מבנים תת-תאיים דקים. בעוד שטכניקות אוטומטיות למחצה הנוכחיות המשתמשות ברשת עצבית עמוקה ואלגוריתמי סגמנטציה יכולות להגביר את המהירות והיעילות בשחזור מבנים תאיים בעלי ניגודיות ממברנה גבוהה יחסית בנפחי תמונה גדולים33, מבנים תת-תאיים רבים (למשל, ספינולים, רשתית אנדופלזמית חלקה, אנדוזומים) יישארו קשים ללכידה מהימנה בשיטות אוטומטיות בשל ניגודיות הממברנה הנמוכה ו/או הפיתול שלהם, אם .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן הגשר של אוניברסיטת וושינגטון וקרן ה-RRF של אוניברסיטת וושינגטון טקומה. תודה רבה לד"ר קלאודיה לופז ולד"ר ג'סיקה ריסטרר מ-MMC באוניברסיטת אורגון לבריאות ומדעים על התמיכה הטכנית של FIB-SEM, לד"ר גרהם נוט על השימוש בנפח התמונה CA1 FIB-SEM, ולסטודנטים של UW Tacoma בקורס שחזורים עצביים (TBIOMD 495) על סבלנותם ומצוינותם בעבודה עם פרוטוקול זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פיג'י (ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| שחזור | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | ||
| בסיס | בלנדר בלנדר | https:/www.blender.org |
מקורות
- Holler, S., Kostinger, G., Martin, K. A. C., Schuhknecht, G. F. P., Stratford, K. J. Structure and function of a neocortical synapse. Nature. 591 (7848), 111-116 (2021).
- Xu, C. S., Pang, S., Hayworth, K. J., Hess, H. F. Transforming FIB-SEM. Volume microscopy: Multiscale imaging with photons, electrons, and io....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
