מאמר שיטה

טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

DOI:

10.3791/63036

⸱

30 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה משופרת לבידוד ADSC וכתוצאה מכך תפוקה תאית אדירה עם רווח בזמן בהשוואה לספרות. מחקר זה מספק גם שיטה פשוטה להשגת מספר גדול יחסית של תאים בני קיימא לאחר שימור בהקפאה לטווח ארוך.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים אנושיים שמקורם ברקמת שומן הפכו לאטרקטיביים יותר ויותר ככל שהם מראים תכונות מתאימות ומהווים מקור נגיש ליישומים קליניים רגנרטיביים. פרוטוקולים שונים שימשו להשגת תאי גזע שמקורם בשומן. מאמר זה מתאר שלבים שונים של פרוטוקול משופר לחיסכון בזמן כדי להשיג כמות משמעותית יותר של ADSC, ומראה כיצד לשמר ולהפשרה של ADSC כדי להשיג תאים בני קיימא להרחבת התרבית. מאה מיליליטר של lipoaspirate נאספו, באמצעות 26 ס"מ שלושה חורים ו 3 מ"מ מזרק שאיבת שומן, מאזור הבטן של תשעה חולים שעברו לאחר מכן abdominoplasty אלקטיבי. בידוד תאי הגזע בוצע באמצעות סדרה של שטיפות עם תמיסת מלח חצוב פוספט (DPBS) של דולבקו, בתוספת סידן ושימוש בקולגן. תאי שבר כלי דם סטרומליים (SVF) הוקפאו, ויכולת הקיום שלהם נבדקה על ידי אימונופנוטיפ. התפוקה התאית של SVF הייתה 15.7 x 105 תאים למ"ל, ונעה בין 6.1-26.2 תאים למ"ל. תאי SVF דבקים הגיעו למפגש לאחר ממוצע של 7.5 (±4.5) ימים, עם תפוקה תאית ממוצעת של 12.3 (± 5.7) x 105 תאים למ"ל. הכדאיות של SVF מופשר לאחר 8 חודשים, שנה ושנתיים נעה בין 23.06%-72.34% עם ממוצע של 47.7% (±24.64) עם הכדאיות הנמוכה ביותר בקורלציה עם מקרים של הקפאה של שנתיים. השימוש בתמיסת DPBS בתוספת סידן וזמני מנוחה של שקיות למשקעי שומן עם זמן קצר יותר של עיכול קולגן הביא לתפוקה מוגברת של התאים הסופיים של תאי גזע. ההליך המפורט להשגת תשואות גבוהות של תאי גזע בני קיימא היה יעיל יותר לגבי זמן ותפוקת תאים מאשר הטכניקות ממחקרים קודמים. גם לאחר תקופה ארוכה של שימור בהקפאה, נמצאו תאי ADSC בני קיימא ב-SVF.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע מזנכימליים אנושיים הם יתרון הן במחקר בסיסי והן במחקר יישומי. השימוש בסוג תא בוגר זה גובר על סוגיות אתיות - בהשוואה לשימוש בתאים עובריים או אחרים - בהיותו אחד מתחומי המחקר המבטיחים ביותר בהנדסת התחדשות רקמות אוטולוגיתוטיפול בתאים 1, כגון האזור הניאופלסטי, הטיפול במחלות ניווניות ויישומים טיפוליים באזור הניתוח המשחזר 2,3,4, 5. בעבר דווח כי קיים מקור שופע של תאי גזע רב-פוטנטיים ופלוריפוטנטיים מזנכימליים בחלק תאי כלי הדם הסטרומליים של רקמת השומן 6,7. ADSC אלה נחשבים למועמדים מצוינים לשימוש בטיפול בתאים והשתלה / עירוי מכיוון שניתן להשיג בקלות מספר לא מבוטל של תאים עם יכולת הרחבה ex vivo עם תשואה גבוהה מהליך זעיר פולשני 5,8.

כמו כן, הוכח כי רקמת השומן מציגה יכולת גדולה יותר לספק תאי גזע מזנכימליים מאשר שני מקורות אחרים (מח עצם ורקמת חבל הטבור)9. מלבד היותו אימונוגני גרוע ובעל יכולת גבוהה להשתלב ברקמה המארחת ולתקשר עם הרקמות הסובבות4,10, ל- ADSC יש יכולת רב-תכליתית של התמיינות לקווי תאים, עם דיווחים על התמיינות כונדרוגנית, אוסטאוגנית ומיוגנית בתנאי תרבית מתאימים11,12,13, ולתוך תאים, כגון לבלב, הפטוציטים, ותאים נוירוגניים14,15,16.

הקהילה המדעית מסכימה כי האפקט החיסוני של תאי גזע מזנכימליים הוא מנגנון פעולה רלוונטי יותר לטיפול בתאים17,18,19 מאשר תכונת ההתמיינות שלהם. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של השימוש ב- ADSC הוא האפשרות של עירוי אוטולוגי או השתלה, להיות טיפול חלופי למספר מחלות. עבור רפואה רגנרטיבית, ADSC כבר שימשו במקרים של נזק לכבד, שחזור של שריר הלב, התחדשות של רקמת עצבים, שיפור תפקוד שרירי השלד, התחדשות העצם, טיפול בסרטן, וטיפול בסוכרת20,21.

נכון להיום, ישנם 263 ניסויים קליניים רשומים להערכת הפוטנציאל של ADSC, המפורטים באתר האינטרנט של המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית22. פרוטוקולים שונים לקצירת רקמת שומן נקבעו, אך אין קונצנזוס בספרות על שיטה סטנדרטית לבידוד ADSC לשימוש קליני23,24. שיטות עיבוד Lipoaspirate במהלך הניתוח ולאחריו יכולות להשפיע ישירות על כדאיות התא, על התפוקה התאית הסופית25, ועל איכות אוכלוסיית ADSC20. באשר לטיפול המקדים הניתוחי, לא ברור איזו טכניקת טרום-טיפול כירורגית מניבה מספר משמעותי יותר של תאים בני קיימא לאחר הבידוד או שמא תמיסת ההרדמה המוזרקת לרקמת השומן משפיעה על תפוקת התא ועל תפקודו26. באופן דומה, ההבדל בין טכניקות להשגת תאי שומן יכול להוביל לירידה של עד 70% במספר ADSC20 בר קיימא. על פי הספרות, יש להימנע מטיפולים מכניים להשגת אוכלוסיות תאים עם כדאיות גבוהה - כולל אולטרסאונד, שכן הם יכולים לפרק את רקמת השומן20. עם זאת, שיטת שאיפת השומן הידנית עם מזרקים מזיקה פחות, וגורמת לפחות הרס תאים, כאשר שאיבת שומן סרטנית מניבה מספר משמעותי של תאים באיכות הטובה ביותר26.

טכניקה זו משתמשת בתמיסת מלח עם לידוקאין ואפינפרין המוזרק לאזור שאיבת השומן. עבור כל נפח 3 מ"ל של תמיסה מוזרק, 1 מ"ל הוא aspirated. במחקר זה בוצעה טכניקת שאיבת השומן הרטובה, שבה עבור כל 1 מ"ל של אדרנלין ותמיסת מלח מוזרקת, 0.2 מ"ל של רקמת שומן הוא שאפתן. השימוש באנזימי עיכול, במיוחד קולגן, נפוץ בתהליך בידוד ADSC.

לאחר שלב הבידוד הראשון במעבדה, הכדור הסופי נקרא שבר כלי דם סטרומלי (SVF). הוא מכיל סוגי תאים שונים27, כולל תאים מבשרי אנדותל, תאי אנדותל, מקרופאגים, תאי שריר חלק, לימפוציטים, פריציטים, קדם-אדיפוציטים ו- ADSCs, המסוגלים להידבק. לאחר סיום הבידוד הסופי מתרביות מבחנה , תאים שלא דבקו בפלסטיק מסולקים בחילופים בינוניים. לאחר שמונה שבועות של התרחבות, שינויים בינוניים ומעברים, ADSCs מייצגים את רוב אוכלוסיית התאים בבקבוקונים20. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של שימוש בתאי גזע בודדים שמקורם בשומן לטיפול עתידי אפשרי הוא האפשרות של שימור בהקפאה. הודגם כי ליפואספירציה בהקפאה היא מקור פוטנציאלי לתאי SVF גם לאחר 6 שבועות של הקפאה28, עם פעילות ביולוגית גם לאחר שנתיים של שימור בהקפאה29, ויכולת מלאה לגדול ולהתמיין בתרבית30. עם זאת, במהלך תהליך ההפשרה, אחוז ניכר של תאים הוא איבד בדרך כלל31. לכן, תהליך הסרת lipoaspirate ואת השיטות הבאות של בידוד התא חייב להבטיח את תפוקת התא הגבוהה ביותר.

מחקר זה מתאר מתודולוגיה מהירה יותר לאיסוף ובידוד ADSC, המדגימה תפוקה תאית גבוהה וכדאיות ליעילות טובה יותר של טיפולים תאיים. יתר על כן, ההשפעה של טכניקה משופרת זו לאחר שימור בהקפאה ארוך טווח של SVF נבדקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מאושר על ידי ועדת האתיקה של UNIFESP (מספר פרוטוקול: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), שבוצע לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים על פי הצהרת הלסינקי (2004). המדגם של המחקר הנוכחי מורכב מתשע מטופלות, בגילאי 33-50 שנים (גיל ממוצע 41.5) ומדד מסת גוף ראשוני ממוצע (BMI) של 24.54 (נע בין 22.32-26.77) (טבלה 1) שעברו ניתוח אב-נופלסטי אסתטי עקב עודף עור לאחר הריונות, במחלקה לכירורגיה פלסטית של האוניברסיטה הפדרלית של סאו פאולו (UNIFESP), ברזיל. כדי להפחית את ההטיה, המטופלים נבחרו כקבוצה הומוגנית בהתחשב במין, גיל ו- BMI. מערכי הנתונים שבהם נעשה שימוש ו/או נותחו במהלך מחקר זה זמינים מהמחבר המתאים על פי בקשה סבירה.

1. אוסף של lipoaspirate

הערה: שלב זה צריך להתבצע במרכז הניתוח.

  1. יש להשתמש ב-4% כלורהקסידין גלוקונאט (ראו טבלת חומרים) להכנת העור ואספסיס.
    1. לבצע חתך עור תת עורי של 2 מ"מ (בין תת הדרמיס לאפונורוזיס). הכנס צינורית קליין של 26 מ"מ 3 G שלושה חורים וקליבר 3 מ"מ ומזרק כדי להזריק נפח כולל של 500 מ"ל של תמיסת אדרנלין (1 מ"ג / מ"ל) (ראה טבלת חומרים) מדולל מלוחים (1:1,000,000) באזור האינפראומביל.
  2. חברו מזרק 60 מ"ל לצינורית שאיבת שומן בקוטר 26 מ"מ 3 G ו-3 מ"מ והחדירו אותה דרך החתך בעור, תוך נעילת הבוכנה ליצירת ואקום.
    1. בצע תנועות דחיפה ומשיכה כך שעם הוואקום שנוצר, lipoaspirate נשאר במזרק 60 מ"ל.
  3. באמצעות מחבר סטרילי עם שסתום, העבר את 100 מ"ל של lipoaspirate שנאסף לשקית העברה פוליוויניל כלוריד 150 מ"ל (ראה טבלת חומרים).
    1. ארזו את שקית ההעברה בקופסת פוליסטירן בטמפרטורת החדר (~25 מעלות צלזיוס) וקחו אותה מיד למעבדה. אין ליטול יותר מ-30 דקות כדי להתחיל בעיבוד הרקמות.

2. עיבוד של lipoaspirate

הערה: יש לבצע שלב זה במעבדה.

  1. ראשית, שקלו את השקית, מדדו את הטמפרטורה באמצעות מדחום קליני דיגיטלי ללא מגע, והשאירו את השקית מונחת במשך 5 דקות בתוך תא הזרימה הלמינרית למשקעים של השכבות השמנוניות יותר (בועות) והפרדת רקמות המכילה את התאים המעניינים.
    1. בצע סדרה של שטיפות רקמות. כביסה ראשונה: להזריק 100 מ"ל של DPBS עם סידן (1x) לתוך שקית ההעברה ומערבבים אותו עם הידיים.
    2. תן לו לעמוד במשך 5 דקות ולהסיר את רוב הנוזל הבסיסי כי מזרז.
    3. השליכו את הנוזל הבסיסי עם מזרק של 60 מ"ל המחובר למתאם השקית. יש לחזור על תהליך זה פעמיים.
  2. הוסיפו 100 מ"ל של תמיסת עיכול לשקית (93 מ"ל של DPBS ללא סידן + 60 מיקרוגרם כלוריד (1 גרם לליטר) + 7 מ"ל של 0.075% קולגן סטרילי, ראו טבלת חומרים) והשאירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בערבוב איטי.
  3. העבירו את כל תכולת השקית לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל וצנטריפוגה ב-400 x גרם ב-22 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. הסר והשליך את הסופרנטנט והוסף 5 מ"ל של הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם גלוקוז נמוך בתוספת 20% FBS (סרום בקר עוברי) לכדור התא (איור 1).

3. ספירת תאי SVF

  1. יש לערבב תמיסה טרייה של 10 μL בצבע כחול טריפאן ב-0.05% במים מזוקקים עם 10 μL של תרחיף סלולרי למשך 5 דקות.
  2. ספירת תאים בני קיימא בתא ספירת תאים של נויבאואר32 באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך (ראו טבלת חומרים) בהגדלה של פי 20.
  3. יש להשעות את כדור התא במדיום מגן קריופטי (5 מ"ל של FBS + 10% של דימתיל סולפוקסיד - DMSO) בריכוז של 1 x 106 תאים למ"ל.
  4. מניחים 1 מ"ל של תערובת זו cryovials. השתמש במיכל הקפאה (ראה טבלת חומרים) עם קצב קירור של (1 °C לדקה עד -80 °C).
    1. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C למשך שנה.
    2. לאחר זמן זה, אחסן בקופסאות קלטות סטנדרטיות שקועות בשלב אדי החנקן הנוזלי (-165 מעלות צלזיוס).

4. תהליך הפשרה של התאים

  1. הסר את הבקבוקונים מחנקן נוזלי והנח אותם מיד באמבט המים של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת.
  2. מניחים את תאי ה-SVF בצינור חרוטי עם 4 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך בתוספת 20% FBS) שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.
  3. צנטריפוגה ב 400 x גרם ב 22 °C למשך 5 דקות.
  4. הסר את הסופרנטנט והוסף 1 מ"ל של DMEM (גלוקוז נמוך) + 10% FBS. בצע אימונופנוטיפינג לפי השלבים הבאים.

5. טכניקת ציטומטריה של זרימה (תיוג מרובה אימונופנוטיפ)

  1. מניחים 1 מ"ל של כדור התא (ריכוז של 1,000 תאים/μL) בחמש צינוריות ציטומטריה (200 μL כל אחת).
  2. צנטריפוגה ב 400 x גרם ב 22 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant עם פיפטה.
  3. הוסף 300 μL של תמיסת מלח עם פוספט (PBS) (10x), צנטריפוגה ב-400 x g ב-22°C והשלך את הסופר-נאטנט עם פיפטה.
  4. הכן חמישה צינורות לשילובי סמנים שונים כדלקמן: 5 μL של CD11B / 5 μL של CD19/20 μL של CD45; 5 μL של CD73/20 μL של CD90/5 μL של CD105/20 μL של CD45; 20 μL של CD34/5 μL של HLA-DR/20 μL של CD45; בדיקת כדאיות התא-5 μL של צבע תגובתי פלואורסצנטי. (ראה טבלת חומרים) וצינור עם תאים לא מוכתמים ו- PBS כבקרה שלילית. הומוגניות במערבולת ודוגרת ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    1. צנטריפוגה ב 400 x גרם ב 22 ° C במשך 5 דקות, להשליך את supernatant עם פיפטה, להוסיף 500 μL של PBS (10x), ולהמשיך עם מיון תאים.
      הערה: חמשת אלפים אירועים נרכשים לכל ערכת נוגדנים בציטומטר זרימה של ארבעה צבעים וחמישה פרמטרים ומנותחים באמצעות תוכנת CellQuest.

6. זריעת קטע 1 (עמ' 1)

  1. זרעים 2 x 105 תאים בבקבוק תרביתבגודל 75 ס"מ 2.
  2. הוסף 12 מ"ל של DMEM גלוקוז נמוך + 20% של FBS + 10% אנטיביוטיקה / אנטימיקוטי (עם 10,000 יחידות פניצילין, 10 מ"ג סטרפטומיצין, ו 25 מיקרוגרם אמפוטריצין B למ"ל, 0.1 מיקרומטר).
  3. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-90%, בצע טריפסיניזציה של תאים דבקים עם 2 מ"ל של 0.25% EDTA-טריפסין למשך 3 דקות.
  4. ספירת תאים שוב (כפי שצוין בשלב 3).
  5. בצע אימונופנוטיפינג שוב (כפי שצוין בשלב 5).

7. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש במחשבון Rho33 של ספירמן כדי למדוד את חוזק הקשר בין המשתנים הבאים עם P < 0.05, כפי שצוין להלן.
    1. בחר תפוקת תאי SVF ואת מספר הימים שבהם SVF נשאר בתרבית במעבר הראשון (P1) עד למפגש של 80%-90% (ימים עד P1).
    2. בחר תפוקת סלולר SVF לפני ואחרי מעבר ל-P1.
    3. קחו בחשבון ימים ל-P1 ולתפוקה התאית לפני שאתם עוברים ל-P1.
    4. בחר תפוקה סלולרית של SVF עם האחוז הממוצע של ADSC מאושר.
    5. חשב את אחוז ה- ADSC המאושר ואת התפוקה התאית לפני שתעבור ל- P1.
    6. קבע את התפוקה התאית של BMI ו- SVF.

8. מבחן בידול

  1. בצע את בדיקת ההבחנה בהתאם לפרוטוקול ערכת בידול (ראה טבלת חומרים). איור 4 מדגים את התוצאות עבור מקרה 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפיון של תשעת הפרטים שנחקרו, כולל גילם, משקלם, גובהם ו-BMI, מוצגים בטבלה 1.

על פי התפוקה התאית שהוצגה בתחילה, נפח התאים שחוסנו בתרבית חושב להיות קרוב ככל האפשר לקיבולת של בקבוק תרבית2 75 ס"מ. נפח הדגימה שנזרע בכל מקרה מתואר בטבלה 2. לאחר מכן, על פי התפוקה התאית הראשונית, נקבע נפח משתנה של תאים עבור כל דגימה: 1 מ"ל עבור דגימות עם תפוקה תאית גבוהה יותר, 1.1 מ"ל עבור דגימות עם תפוקה תאית בינונית, ו-2 מ"ל עבור דגימות עם תפוקה תאית נמוכה יותר כדי לבצע ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תשואת בידוד
ידוע כי תהליך ההקפאה, הנדרש לעתים קרובות בטיפול תאי, גורם לאובדן תאים משמעותי, לעתים גדול מ-50%29,30,35. לפיכך, שיפור טכני להשגת תפוקה סלולרית ראשונית גבוהה בבידוד הוא בסיסי. שיטת האיסוף של lipoaspirate ושיטת הבידוד של התאים חייבים להתמקד בשימור מספר גדול יותר של תאים, שמירה על כדאיות גבוהה, וחילוץ המספר המרבי של תאים מהחומר הראשוני תוך התחשבות בתרבית ארוכת טווח ומניפולציה של התאים. לכן, נדרשת תחז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למטופלים שהתנדבו להשתתף ולצוות הרפואי והסיעודי של בית החולים סאו פאולו. מחקר זה נתמך על ידי ה-Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ו-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), ברזיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.8 מ"ל קריוביאליםNunc Thermo Fisher Scientific340711
שקית העברת פוליוויניל כלוריד 150 מ"לJP FARMA80146150059
2% תמיסת אליזרין אדום S, pH 4.2סיגמא אולדריץ'A5533
אדרנלין (1 מ"ג/מ"ל)HipolaborNA
תמיסה כחולהאלסיאן סיגמא אולדריץ'1,01,647
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית 100xGibco15240062
BD FACSציטומטר זרימה של קליבור באמצעות BD CellQues Pro AnalysisBD BioSciencesNA
סידן כלורי 10%Merck102379
כלורהקסידין גלוקונאט 4%VIC PHARMANA
קולגנאז, סוג I, אבקתGibco17018029
DMEM (מדיום הנשר המותאם של Dulbecco)Gibco11966025
DPBS ללא סידן, ללא מגנזיום (מערכות טיפול בתאי מלח עם פוספט של Dulbecco)GibcoA1285801
DPBS עם סידן (מערכות טיפול בתאי מלח עם פוספט של Dulbecco)סרום
Gibco10500056
פורמלדהיד 4%סיגמא אולדריץ'1,00,496
מיקרוסקופ אור הפוךNikon Eclipse TS100NA
בדיקת תאים חיים ומתיםThermofisher01-3333-41 | 01-3333-42
נוגדן חד שבטי: CD105BD BioSciences745927
נוגדן חד שבטי: CD11BBD BioSciences746004
נוגדן חד שבטי: CD19BD BioSciences745907
נוגדן חד שבטי: CD34BD BioSciences747822
נוגדן חד שבטי: CD45DAKOM0701
נוגדן חד שבטי: CD73BD BioSciences746000
נוגדן חד שבטי: CD90BD BioSciences553011
נוגדן חד שבטי: HLA-DRBD BioSciences340827
מיכל הקפאה של Mr. FrostyThermo Fisher Scientific5100-0001
PBS (מי מלח חוצץ פוספט) 1x pH 7.4Gibco 
10010023 ערכת בידול StemPro AdipogenesisGibcoA1007001
StemPro ערכת בידול כונדרוגנזה
StemPro Osteogenesis
תמיסה כחולה טריפאן 0.4%סיגמא אולדריץ'93595
טריפסין-EDTA 0.25% 1x, פנול אדוםג'יבקו25200056
בקר עוברי של Gibco A1285601 A1007201 Gibco A1007101 Kit מחבר סטרילי עם ספייק אחד עם אתר הזרקת מחט Origen Biomedical Connector, ארה"ב סימן קוד NA: IBS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123(2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122(2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284(2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693(2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145(2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421(2015).
  32. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
  33. Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718(2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397(2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45(2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66(2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162(2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים