מאמר שיטה

שיטה פשוטה שונה להשראת אוטם שריר הלב בעכברים

DOI:

10.3791/63042

⸱

3 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחת הרדמה מספקת, לב העכבר הוחצן דרך החלל הבין-קוסטלי, ואוטם שריר הלב נגרם בהצלחה על ידי קשירת העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) באמצעות חומרים הזמינים ברוב המעבדות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטם שריר הלב (MI) מייצג את אחד הגורמים המובילים למוות. מודלים של MI נמצאים בשימוש נרחב לחקר הפתומנגנונים של שיפוץ פוסט-MI והערכה של טיפולים חדשניים. שיטות שונות (למשל, טיפול באיזופרוטרנול, קריופציעה, קשירת עורקים כליליים וכו ') שימשו להשראת MI. בהשוואה לטיפול באיזופרוטרנול והקפאה, קשירת עורקים כליליים עשויה לשקף טוב יותר את התגובה האיסכמית ואת העיצוב מחדש הכרוני לאחר MI. עם זאת, שיטות מסורתיות לקשירה כלילית בעכברים מאתגרות מבחינה טכנית. המחקר הנוכחי מתאר תהליך פשוט ויעיל להשראת MI בעכברים עם חומרים זמינים. עור החזה של העכבר נחתך בהרדמה יציבה. הלב הוחצן מיד דרך החלל הבין-קוסטלי לאחר הפרדה בוטה של החזה הגדול והפקטורליס מינור. הענף היורד הקדמי השמאלי (LAD) היה קשור בתפר 6-0 3 מ"מ ממקורו. לאחר קשירת LAD, צביעה עם 2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד (TTC) הצביעה על השראת MI מוצלחת ושינויים זמניים בגודל הצלקת שלאחר MI. בינתיים, תוצאות ניתוח ההישרדות הראו תמותה גלויה תוך 7 ימים לאחר MI, בעיקר בגלל קרע לבבי. יתר על כן, הערכה אקוקרדיוגרפית לאחר MI הדגימה השראות מוצלחות של תפקוד לקוי של התכווצות ועיצוב מחדש של חדרים. לאחר השליטה, מודל MI ניתן להקים בעכברים בתוך 2-3 דקות עם חומרים זמינים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטם שריר הלב (MI) מייצג את אחד הגורמים המשמעותיים למוות ונכות ברחבי העולם 1,2,3,4,5. למרות reperfusion בזמן, יש כיום מחסור של טיפולים יעילים לטיפול remodeling לב לאחר MI. בהתאמה, נעשו מאמצים ניכרים לחקירה מכניסטית ולניצול טיפולי עבור MI 6,7,8. יש לציין כי הקמת מודלים של אמ"ן היא תנאי מוקדם לעמידה ביעדים אלה.

מספר שיטות (למשל, טיפול באיזופרוטרנול, קריופציעה, קשירת עורקים כליליים וכו ') הוצעו כדי לגרום למודלים של MI בבעלי חיים קטנים. טיפול באיזופרוטרנול הוא שיטה פשוטה להשראת MI, אך הוא אינו יכול לגרום לאוטם של אזור היעד9. Cryoinjury מוביל לנמק שריר הלב באמצעות יצירת גבישי קרח ושיבוש של קרום התא במקום איסכמיה ישירה10. לעומת זאת, קשירת עורקים כליליים מאפשרת שליטה מדויקת באתר החסימה ובהיקף אזור האוטם ומשחזרת נאמנה את תגובת השיפוץ לאחר אוטם11,12. קשירת עורקים כליליים מבוצעת בדרך כלל לאחר אינטובציה, אוורור מכני ותורקוטומיה, שהיא מאתגרת מבחינה טכנית13,14. מספר פרוטוקולים ששונו לקשירת עורקים כליליים (למשל, ללא אוורור) דווחו והעצימו את השראת MI, אך הדגמות חזותיות מפורטות חסרות15,16,17. סוגיות אלה מציבות חסם פיננסי וטכני משמעותי בפני קבוצות המעוניינות לעסוק במחקר באמצעות מודלים של אמ"ן. דו"ח זה מציג גישה להשראת MI בעכברים. השיטה הנוכחית קלה, חוסכת זמן, ומשתמשת בכלים כירורגיים ובציוד שניתן למצוא ברוב המעבדות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסויים הכוללים עבודה בבעלי חיים מבוצעים עם כל האישורים הדרושים מוועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים במעבדה של בית החולים רנג'י, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי, בית הספר לרפואה (R52021-0506). במחקר נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J נקבות וזכרים בגילאי 8-10 שבועות.

1. הכנת ציוד הרדמה פשוט (אופציונלי)

הערה: זוהי התקנה אופציונלית לפני הניתוח וניתן להחליפה בהרדמה טיטראטית כנזכר בסעיף 2. יש להתייעץ עם ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים ועם הווטרינרים לפני התאמת מערך זה בנוהלי בעלי חיים.

  1. קח צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, ולעשות חתך בניצב לציר הארוך של הצינור כ 3 ס"מ מהפתח.
    הערה: ודא שהחתך גדול ממחצית ההיקף המעגלי של לומן הצינור, כך שניתן יהיה להחדיר את השסתום בהצלחה.
  2. קידוח חורים (קוטר, 2 מ"מ) בדופן צינור הצנטריפוגה בין החתך לפתח הצינור.
  3. חותכים חתיכה בגודל מתאים של השסתום מיריעת פלסטיק ומכניסים את השסתום לחתך בדופן הצינור.
    הערה: ניתן להשתמש בשסתום כדי לשלוט בקצב השחרור של איזופלורן על ידי שינוי עומק ההחדרה.
  4. בתוך מכסה אדים, חתכו את תחתית הצינור וחברו אותו לאספקת החמצן. מניחים כדור צמר גפן קרוב לקצה התחתון של הצינור, מוסיפים עומס 0.5 מ"ל איזופלורן (כפי שהושג, ראו טבלת חומרים) על כדור הצמר גפן, וסוגרים את השסתום.
  5. בדוק את יעילות ההרדמה על ידי מיסוך העכברים עם צינורות שהוכנו כמתואר לעיל. עקוב אחר קצב הנשימה ועומק ההרדמה על ידי תגובת צביטת הבוהן.
    הערה: קצב נשימה נמוך מפי 10/10 שניות מצביע על הרדמת יתר, ויש להתאים את עומק החדרת המסתם. עבור כל ההליכים הכרוכים בהרדמה, יש להשתמש במסנן גז מלא ביריעות פחם פעיל (איור 1A-i), ולבצע ניתוח בתוך מכסה מנוע.

2. הכנה אופרטיבית והרדמה

  1. הכינו ועיקרו את כל המכשירים הדרושים ביום הניתוח, כולל זוג מלקחיים, המוסטט מיקרו-יתוש, זוג מספריים כירורגיים, שני זוגות מחזיקי מחט, תפר כירורגי משי 4-0, תפר כירורגי משי 6-0, מסנן גז ומקור אור (ראו טבלת חומרים) (איור 1A).
  2. שימו מסכה כירורגית וכפפות סטריליות.
  3. החל את קרם depilatory על תיבת העכבר ולחכות 1 דקה. נגבו בעדינות את קרם ההידור והשיער עם גזה רטובה.
  4. החזק את העכבר עם היד הדומיננטית לאחר depilation. יש להשרות הרדמה באמצעות שאיפת איזופלורן מאדה (4%) עם אספקת חמצן (1L/min) ולשמור על 2-3% איזופלורן.
  5. יש לאשר הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה של צביטת בוהן.
  6. יש למרוח קרם עיניים סטרילי על שתי העיניים למניעת יובש בקרנית.
  7. אבטחו את העכברים על משטח ניתוח במצב שכיבה. יש למרוח מקלוני פובידון-יוד (ראו טבלת חומרים) על החזה שלוש פעמים ולכסות את החזה המחוטא במקלון סטרילי.

3. אינדוקציה של אוטם שריר הלב

  1. החליפו את הכפפות המזוהמות כדי להבטיח סטריליות.
  2. יש לחתוך עור בקוטר 0.5 ס"מ לאורך הקו המחבר בין הקסיפואיד לבית השחי לאחר בלוק מקומי עם לידוקאין.
  3. הפרידו בבוטות את שרירי החזה והחזה המינוריים באמצעות מלקחיים והמוסטאט מיקרו-יתוש כדי לחשוף את החלל הבין-קוסטלי הרביעי.
  4. פתח את החלל הבין-קוסטלי הרביעי באמצעות המוסטט מיקרו-יתוש.
  5. להחצין את הלב על ידי דחיפת הלב לכיוון החלל הבין-קוסטלי הרביעי עם האצבע המורה של יד שמאל.
  6. לאבטח את הלב ביד שמאל, ולקשור את הענף היורד הקדמי השמאלי עם תפר 6-0 3 מ"מ ממקורו.
  7. החזירו את הלב לחלל בית החזה במהירות.
    הערה: זה בטוח להחצין את הלב במשך פחות מ -30 שניות.
  8. יש לפנות את האוויר החוצה מחלל בית החזה על ידי לחיצה עדינה על חלל החזה באופן ידני.
  9. סוגרים את שכבת השריר מעל הצלעות בתפר משי 6-0.
  10. סגרו את העור בתפר משי 4-0.
  11. הניחו את העכברים על פד (37°C) מיד לאחר הניתוח.
  12. הזריקו בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) תת עורית כל 4-6 שעות כדי להפחית את הכאב שלאחר הניתוח למשך עד 72 שעות.
  13. החזירו את העכברים המנותחים לכלובים כאשר החלימו לחלוטין.
    הערה: העכברים יחלימו לחלוטין תוך 3-5 דקות לאחר הניתוח.
  14. בזהירות לפקח על העכברים ולספק מזון רטוב עד 7 ימים.

4. קצירת הרקמות

  1. להקריב את העכברים בנקודות זמן שונות לאחר הקמת MI על ידי נקע צוואר הרחם.
  2. אבטחו את העכברים שהוקרבו על משטח הניתוח במצב שכיבה.
  3. בצע חתך גחוני (~ 3-4 ס"מ) בבטן העליונה. חותכים את הצלעות משני צידי חלל בית החזה, ומסירים את הסרעפת.
  4. לנקב את הלב עם 10 מ"ל מלוחים חוצצים פוספט קר (1x PBS, 4 ° C) באמצעות הזרקה תוך חדרית.
  5. לאסוף את הלב על ידי חיתוך שורש אבי העורקים ומיד לאחסן את הלב ב -80 ° C.
    הערה: על פי ניסיון המחברים, ניתן לבצע צביעת TTC תוך שבועיים מהאחסון.
  6. להכתים את הלב עם 2,3,5-Triphenyltetrazolium כלוריד (TTC).
    1. פורסים את הלב הקפוא למקטעים בעובי 1 מ"מ על קרח באמצעות סכיני גילוח.
    2. יש לדגור על פרוסות הלב המוכנות בתמיסת TTC 1% (מומסת ב-1x PBS) בטמפרטורה של 37°C למשך 10-15 דקות.
      הערה: לאחר דגירה של 15 דקות, השליכו את תמיסת TTC וטבלו את פרוסות הלב המוכתמות לתוך PBS אחד.
  7. צלמו את הפרוסות באמצעות מצלמה דיגיטלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הניסוי וחלק מהשלבים הקריטיים מוצגים באיור 1. ציוד ההרדמה הפשוט גרם להרדמה. כפי שניתן לראות באיור 2A, ההרדמה המושרה הייתה יציבה, כפי שמשתקף מקצב הנשימה הסדיר (נע בין 90 ל-107 נשימות לדקה בעכברים שנבדקו). לאחר קשירת עורקים כליליים, ניתוח צביעת TTC הצביע על השראת אוטם שריר הלב מוצלחת ושינויים זמניים בגודל הצלקת שלאחר MI (איור 2B). בינתיים, תוצאות ניתוח הישרדות הראו תמותה גלויה בתוך 7 ימים לאחר MI בעכברים זכרים ונקבות C57BL/6J ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדו"ח הנוכחי הדגים פרוטוקול קל להשראת MI בעכברים עם חומרים זמינים, אשר שונה משיטה שדווחה על ידי גאו16. מודלים של Murine MI הם הכרחיים לחקירה מכניסטית וסינון תרופות עבור תפקוד לקוי לאחר MI ושיפוץ12. בין הטכניקות הקיימות להשראת MI, קשירת עורקים כליליים מייצגת את הנפוצה ביותר. קשירת עורקים כליליים משחזרת נאמנה את אופי האיסכמיה של אוטם שריר הלב ומובילה לתגובת ריפוי ושיפוץ צלקת בדומה לתרחיש הקליני18,19. עם זאת, הפרוטוקול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), תוכנית המנהיגים האקדמיים המצטיינים של שנחאי (18XD1402400), ועדת המדע והטכנולוגיה של עיריית שנחאי (201409005200), תוכנית הכישרונות של שנחאי פוג'יאנג (2020PJD030) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M671161, BX20190216).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,3,5-Triphenyltetrazolium chlorideSIGMAT8877-25GTTC מכתים
4-0 תפר משיYUANKANG4-0מכשיר כירורגי
חיטויHIRAYAMAHVE-50עיקור עבור המוצק
BuprenorphineQinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.H10940181להפחית כאבים לאחר הניתוח
צינור צנטריפוגהביולוגי תקווה1850-K15 מ"ל
קרם אפילציהZIKER BIOTECHNOLOGYZK-L2701חומר אפילציה לחיות מעבדה
מלקחייםRWDF12028מכשיר כירורגי
מסנן גזZHAOXINSA-493הגנת המפעיל
איזופלורןRWD20071302משמש להרדמה
מקור אורבייג'ינג PDVLG-150Bמנורת הפעלה
מיקרו-יתושים המוסטטFST13011-12מכשיר כירורגי
מחטBINXIONG42180104מכשיר כירורגי
מחט ותפר משי 6-0JIAHESC086כירורגי
מחזיק מחטShangHaiJZJ32030מכשיר כירורגי
מחזיק מחטShangHaiJZJ32010מכשיר כירורגי
ספוגיות פובידון-יודSingleLadyGB26368-2010לחיטוי עור
CNSTRONGJYJ1030מכשיר כירורגי
קרם עיניים סטרילישניאנג Xingqi פרמצבטיקה ושות', בע"מH10940177למנוע יובש בקרנית
מערכת הדמיית אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה במיוחד לבעלי חיים קטניםVisualSonicsVevo 2100ניתוח אקו לב
מכשיר מספריים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074(2018).
  2. Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
  3. Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
  4. Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
  5. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  6. Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
  7. Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
  8. Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
  9. Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
  10. vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
  11. Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
  12. Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
  13. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  14. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
  15. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  16. Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
  17. Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
  18. Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
  19. Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Myocardial InfarctionCoronary Artery LigationMouse MI ModelVentricular RemodelingTTC StainingPost MI RemodelingContractile DysfunctionEchocardiographic AssessmentCardiac RuptureIntramyocardial Injection

מאמרים קשורים