שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

Summary

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

Abstract

הצורך בשיטות ניתנות לשחזור אך פשוטות מבחינה טכנית המניבות קרדיומיוציטים באיכות גבוהה חיוני למחקר בביולוגיה של הלב. ניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים (למשל, התכווצות, אלקטרופיזיולוגיה, מחזור סידן וכו ') על קרדיומיוציטים הם תקן הזהב לביסוס מנגנונים של מחלות. העכבר הוא המין המועדף לניסויים פונקציונליים והטכניקה המתוארת היא במיוחד לבידוד קרדיומיוציטים של עכבר. שיטות קודמות הדורשות מכשיר לנגנדורף דורשות רמות גבוהות של אימון ודיוק עבור קנולציה אבי העורקים, לעתים קרובות לגרום איסכמיה. התחום עובר לשיטות בידוד נטולות לנגנדורף שהן פשוטות, ניתנות לשכפול ומניבות מיוציטים בני קיימא לרכישת נתונים פיזיולוגיים ולתרבית. שיטות אלה מפחיתות מאוד את זמן האיסכמיה בהשוואה לקנולציה של אבי העורקים וגורמות לקרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין. ההתאמה שלנו לשיטה נטולת לנגנדורף כוללת זילוח ראשוני עם תמיסת ניקוי קרה כקרח, שימוש בפלטפורמה מייצבת המבטיחה מחט יציבה במהלך הזילוח, ושלבי עיכול נוספים כדי להבטיח קרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין לשימוש במדידות תפקודיות ובתרבית. שיטה זו פשוטה ומהירה לביצוע ודורשת מיומנות טכנית מועטה.

Introduction

במשך עשרות שנים, רעיון חיוני בספרות הביולוגיה של הלב הוא מנגנון הפעולה המולקולרי. יש להקים מנגנון פעולה על מנת לפרסם מחקרים מהימנים. אסטרטגיה מבוססת היטב לקביעת מנגנון מולקולרי היא מחקרי קרדיומיוציטים מבודדים, הדורשים קרדיומיוציטים באיכות גבוהה להשגת נתונים אמינים. ניסויים תאיים ומולקולריים המבוצעים על קרדיומיוציטים לקביעת מנגנון פעולה הם תקן הזהב לחקר התכווצות¹, אלקטרופיזיולוגיה², סידן (Ca 2+) מחזור³, מיופילמנט Ca²⁺ רגישות⁴, שלד ציטו-שלד⁵, מטבוליזם⁶, השפעות הורמונים⁷, מולקולות איתות⁸, מחקרי תרופות⁹ וכו. העכבר הפך למין המועדף על רוב הניסויים בביולוגיה של הלב בשל קלות המניפולציה הגנטית, גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה יחסית שלו, עלותו הנמוכה וכו '¹⁰. עם זאת, בידוד אמין של קרדיומיוציטים עכבר באיכות גבוהה אינו טריוויאלי עם הטכניקות הנוכחיות.

מעבדות מבודדות קרדיומיוציטים כבר כמעט 70 שנה¹¹. כמעט כל הטכניקות לבידוד קרדיומיוציטים מסתמכות על עיכול הלב באמצעות אנזימים שונים (קולגנאז, פרוטאז, טריפסין וכו '). בתקופות המוקדמות (שנות ה-50 עד שנות ה-60) נעשה שימוש בשיטת הגוש, שכללה הוצאת הלב, חיתוך לחתיכות קטנות בהרבה ודגירת תמיסה עם קולגנאז/פרוטאז/טריפסין¹². בשנות ה-70 יישמו המעבדות את שיטת "לנגנדורף"¹³, שבודדה קרדיומיוציטים באמצעות טכניקת בידוד מבוססת זילוח של העורקים הכליליים (זילוח מדרדר עם אנזים באמצעות מנגנון לנגנדורף); טכניקה זו נותרה השיטה השלטת לבידוד מיוציטים בתחום כיום, ~50 שנה מאוחר יותר^14,15,16. העבודה האחרונה עברה לשימורי הלב in vivo כדי להגביל את זמן ההיפוקסיה ואת הנזק האיסכמי וכתוצאה מכך בידודי קרדיומיוציטים מעולים (יבולים טובים יותר ואיכות גבוהה יותר)¹⁷. לאחרונה, זה התפתח לביצוע in vivo, זילוח לב ללא לנגנדורף 18,19,20,21,22. פיתחנו את טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף המבוססת על טכניקת Ackers-Johnson et ^al.18 והתאמנו רכיבים שונים מטכניקות בידוד קודמות רבות. התאמות מפתח אלה כוללות הזרקה של חיץ ניקוי קר כקרח ושילוב של פלטפורמה תומכת כדי לייצב את המחט, המאפשר מניפולציה מופחתת של הלב. כמו כן מפורט בטכניקה זו בקרת טמפרטורה של חוצצים מוזרקים (37 מעלות צלזיוס), אשר הפחית את הזמן בין הזרקת in vivo לעיכול עקב פחות זילוח EDTA כפי שפורסם בעבר¹⁸. על ידי הפחתת מניפולציה של הלב ולכן מזעור גודל אתר לנקב, זילוח יסודי ומתמיד של העורקים הכליליים מתקבל. כמו כן, שיפרנו את הטכניקה עם עיכול בשיטת נתח משני, כמות ה-EDTA במאגר הניקוי המוזרק, ושינינו את רמת החומציות. הטכניקה המתוארת שלנו אמינה יותר, יעילה יותר, ואינה דורשת הכשרה/תרגול נרחב בהשוואה לשימוש במכשיר לנגנדורף (טבלה 1).

Protocol

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו בהתאם להנחיות NIH.

1. הכנת פתרון

הערה: ראה טבלה 2 עבור ריכוזי חיץ.

1. טרום בידוד (עד שבועיים לפני בידוד מיוציטים)
   1. בסיס חיץ זילוח: הכינו 1 ליטר של בסיס חיץ זילוח (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES,גלוקוז ו-BDM) ב-1 ליטר של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H₂O. התאימו ל-pH_7.4 לפני סינון סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
   2. חיץ ניקוי: יש להכין 1 ליטר של חיץ ניקוי (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES,Glucose, EDTA ו-BDM) ב-1 ליטר של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H₂O. יש לכוונן ל-pH_7.4 לפני סינון סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
   3. 100 מ"מ תמיסת מלאי CaCl 2: שוקלים 1.11 גרם CaCl 2 ומתמוססים ל-100 מ"ל של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H₂ O. יש לאחסן בטמפרטורתהחדר עד ליום הבידוד.
   4. Liberase aliquots: להמיס 5 מ"ג של אנזימי עיכול ב 5 מ"ל של מים סטריליים, ללא RNase. להכין 0.8 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C עד יום הבידוד.
   5. למינציה את הכלים: יש למרוח 100 μL של למינין עכבר 40 מיקרוגרם/מ"ל על צלחות פטרי סטריליות בעלות תחתית זכוכית של 30 מ"ל. אפשר לשבת במשך 30 דקות ולהסיר עודף למינין. מניחים את הלמינין על צלחת פטרי עם דגירה UV בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד ליום הבידוד (ניתן להשתמש בצלחות פטרי למינציה עד שבועיים).
   6. מדיית DMEM: בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 2.5 מ"ל של FBS, 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (50 U/mL-50 מיקרוגרם) ו-1 מ"ל של 500 mM BDM עד 46 מ"ל של DMEM. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד (ניתן להשתמש במדיה עד שבועיים).
   7. חומרי הדפסה M199: יש להכין 1 ליטר של חומרי הדפסה M199 (NaHCO₃, HEPES, L-גלוטתיון, M199, BDM ו-BSA) ב-1 ליטר של חומר אחסון אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H₂O. יש לכוונן ל-pH 7.4 לפני סינון סטרילי (מסנן 0.22 מיקרומטר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
   8. 500 מ"מ מלאי BDM: יש להוסיף 0.5 גרם BDM ל-10 מ"ל של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H₂O. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
   9. יצירת פלטפורמה מייצבת: בצק משחק עובש סביב בסיס המחט המוברגת לסטופקוק Luer. עובש לצלחת הפטרי שיכיל את הלב ויבטיח שהמחט תהיה בגובה המתאים להזרקת החדר (~5 מ"מ מעל תחתית המנה).
2. יום הבידוד
   1. חיץ זילוח: ביום הבידוד, יש להוסיף 9.5 מ"ג של MgCl₂ עד 100 מ"ל של בסיס חיץ זילוח. מניחים לערבב לחלוטין לפני הסרת 30 מ"ל של חיץ זילוח שהושלם ומניחים בבקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה מכסה בורג (חיץ עיכול).
      הערה: ניתן לבצע תוספות אלה ביום הבידוד ללא התאמות pH נוספות מכיוון שהוספתן משנה את ה- pH באופן זניח.
      1. הסר 12 מ"ל של מאגר זילוח והגדר בצד (מאגר עצירה). יוצקים את 58 מ"ל הנותרים של חיץ זילוח לתוך בקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה בורג. אחסנו את מאגר הזילוח הנותר בטמפרטורה של 37°C במהלך הבידוד.
   2. חיץ עיכול: הוסף 7.5 μL של 100 mM CaCl₂ עד 30 מ"ל של חיץ זילוח לקבלת ריכוז סופי של 25 μM. מיד לפני הבידוד, הוסף 770 μL של Liberase למאגר העיכול לקבלת ריכוז סופי של 26 מיקרוגרם / מ"ל.
   3. מאגר עצירה: יש להמיס 240 מ"ג BSA ב-12 מ"ל של מאגר זילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 37°C במהלך הבידוד.
   4. חיץ ניקוי: מכינים מזרק 3 מ"ל של חיץ ניקוי ומנקים את המחט מבועות. יש לאחסן על קרח עד לבידוד.

2. הכנת סעפת

1. נקה את הסעפת מבוקרת הטמפרטורה עם חיץ זילוח טרי, תוך הקפדה על כך שלא יישארו בועות. באמצעות מחבר נעילת Luer, להבריג במחט 27 G, ולנקות מבועות. סעפת מפונה חיונית לבידוד מוצלח.

3. הכנת בעלי חיים

1. יש להזריק לעכבר תוך צפקית 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-20 מ"ג/ק"ג קסילזין לפי משקל גוף מיד לפני הבידוד. הליך זה השתמש בעכבר C57Bl/6 זכר בן 4 חודשים.
2. במידת הצורך, הניחו את העכבר על כרית כירורגית מחוממת כדי לעודד טשטוש. אוהלו את זרועות העכבר, והדביקו את הגפיים ואת בסיס הזנב לחיתול מעבדה כחול. ודא כי החיה מורדמת לחלוטין על ידי נסיגה של רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח וילון סטרילי סביב אזור הניתוח.

4. הליך בידוד קרדיומיוציטים

1. לחשוף את עצם החזה של העכבר, לרוחב לקו האמצע, לחתוך בסמיכות דרך הצלעות אל בית השחי. חתכו בעדינות את הסרעפת במלואה, והקפידו על חתכים רדודים כדי למנוע את הלב. מהדקים את עצם החזה עם hemostat ומקפלים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את חלל בית החזה.
2. בעדינות להסיר את קרום הלב מן הלב לחתוך במלואו דרך נבוב הווריד הנחות, מיד דיסטלי ללב. השתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G כדי להזריק במהירות 3 מ"ל של חיץ ניקוי קר כקרח לחדר הימני של הלב במשך 1 דקות.
3. החזיקו בעדינות את הלב באמצעות פינצטה והתרחקו מהגוף, חושפים כמה שיותר מאבי העורקים. באמצעות hemostat, להדק את אבי העורקים העולה, נזהר לא להדק את אטריה, ואת הבלו את הלב מן החזה.
4. להעביר במהירות את הלב המהודק למכסה של צלחת פטרי פוליפרופילן עם כ 10 מ"ל של חיץ זילוח חם. הניחו את הלב המהודק לתוך הפלטפורמה התומכת והשתמשו במחט 27 G מיוצבת המחוברת לסעפת כדי להזריק 10 מ"ל של חיץ זילוח מבוקר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי במשך 5 דקות.
5. מעבירים את הלב המהודק ואת המצע התומך לצלחת פטרי עם כ-5 מ"ל של חיץ עיכול. החלפת מזרקי קלט עבור מזרק 50 מ"ל עם 25 מ"ל של חיץ העיכול.
6. נקה את הסעפת של כל הבועות ואת חיץ הזילוח שנותר לפני ההזרקה. החלף בזהירות את המחט לאותו מיקום מחט בקודקוד החדר השמאלי.
7. השתמש במשאבת זילוח כדי להזריק חיץ עיכול מבוקר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי למשך 15 דקות באמצעות מזרק 50 מ"ל. שלוט בטמפרטורת התמיסה באמצעות מעיל מים שכויל בעבר להוצאת תמיסה של 37 מעלות צלזיוס בקצה המחט.
8. מוציאים את החדרים מהאטריה ומעבירים לכוס של 10 מ"ל. מוסיפים 3 מ"ל של חיץ עיכול לכוס ובעזרת מספריים חדים חותכים את החדרים לחתיכות גדולות. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום ומניחים באמבט מים רועד שחומם מראש ל-37°C למשך 5 דקות.
9. השליכו את הסופרנטנט, תוך זהירות להימנע מהסרת גושי רקמה. להשהות מחדש את גושי הרקמה ב 3 מ"ל של חיץ העיכול triturate במשך כ 4 דקות או עד תערובת הומוגנית מושגת.
10. סנן את התאים דרך מסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל.
11. החזירו את התסנין לצינור פוליפרופילן עגול בנפח 14 מ"ל וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-100 סל"ד. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של חיץ עצירה.
12. הוסף 54 μL של 100 mM מלאי CaCl 2 לתאים המרחפים לקבלת ריכוז CaCl₂ סופי של 1.8 mM. שלב זה יכול להתבצע גם בהדרגה כדי להגדיל את תפוקת התא.
13. אפשרו לתאים חיים להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך 10 דקות לפני שתסירו את הסופרנאטנט המכיל תאים מתים. השהה מחדש את הגלולה בתמיסת אחסון (פתרון זילוח עם 200 מיקרומטר CaCl₂). תאים אלה יכולים לשמש כיום לניסויים פונקציונליים (כלומר, הדמיה/התכווצות סידן, מהדק טלאי וכו'), תרבית וכו'.
    הערה: התאים עשויים גם להיות מושהים מחדש בתמיסות תלויות מעבדה או ניסוי.

5. תרבית תאים

1. ספור את התאים באמצעות המוציטומטר או לפי ספירת תצוגות שדה באמצעות החלקת כיסוי מרושתת. מכיוון שמיוציטים גדולים מאוד, ספירה באמצעות המוציטומטר אינה תמיד מדויקת. זה משמש כדי לקבל מושג על כמה תאים בקירוב התקבלו מהבידוד.
2. לדלל את התאים ל~ 25,000 תאים / מ"ל עם מדיה DMEM. הוסף 1 מ"ל של תמיסת תאים לכל באר.
3. יש לדגור ב-37°C, 95% O 2, 5% CO₂ למשך שעתיים.
4. שאפו בעדינות מדיית DMEM מכל באר והוסיפו 2 מ"ל של מדיה M199.
5. יש לדגור ב-37°C, 95% O 2, 5% CO₂ למשך עד 24 שעות.

Results

ישנם מספר אלמנטים שיש לבחון בעת קביעת הצלחת הבידוד. ראשית, הקרדיומיוציטים חייבים להיות בצורת מוט ללא כתמים בממברנה, כמו התאים שבודדו באיור 1. בידוד טיפוסי יניב ~80% מהמיוציטים בצורת מוט. אם הבידוד מניב משהו פחות מ 50% תאים בצורת מוט, אז זה נחשב בידוד לא מוצלח קרדיומיוציטים אינם בשימוש. לבסוף, cardiomyocytes צריך להיות שקט. מיוציטים המתכווצים באופן ספונטני מפגינים אי סבילות ל- Ca2+ וייצרו נתונים לא אמינים. מכל הבידודים המבוצעים בטכניקה הנ"ל, כמעט כל הבידודים נחשבים מוצלחים. קרדיומיוציטים בתרב...

Discussion

היתרון העיקרי של טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף שלנו הוא שהיא מגבילה את זמן ההיפוקסיה והאיסכמי בכך שאינה דורשת קנולציה למכשיר לנגנדורף. לחילופין, בדומה לטכניקות לנגנדורף הקלאסיות שלוקח מספר דקות להסיר, לנקות ולתלות את הלב, מה שגורם לעיתים קרובות לנזק איסכמי למיוציטים, השיטה שלנו כוללת ניקוי דם in vivo באמצעות תמיסת ניקוי קר כקרח. חיץ הניקוי הקר כקרח מכיל חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA), תצבית קטיונים דו-ערכיים באופן בלתי הפיך כדי להסיר סידן ביעילות, מה שהופך אותו לנוגד קרישה מצוין, ולכן מפסי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 סמ"ק Bd Luer-Lok מזרק	פישר מדע	14-827-52
10 מ"ל פיירקס בצורה נמוכה	קול-פאלמר	UX-34502-01
100 מ"ל כובע פוליפרופילן בקבוק אחסון מדיה מזכוכית	DWK מדעי החיים	UX-34523-00
14 מ"ל מבחנות פוליפרופילן עגולות תחתונות עם כובע	פישר מדע	14-959-11B
2,3-בוטנדיון מונוקסימה	Sigma	B0753	>98%
3 סמ"ק BD מזרק Luer-Lok Fisher	Sci	14-823-435
35 מ"מ כלי תחתית זכוכית	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 מ"ל מזרק BD ללא מחט	Fisher Sci	13-689-8
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS כרית חימום ג'ל חלל	פישר מדע	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 גרם x 1/2 אינץ' מחטים היפודרמיות	בקטון דיקינסון
אלבומין	סיגמא	A3803	מקטע הלם חום, אבקה ליופילית, למעשה ללא חומצות שומן, >98%
סידן כלוריד דיהידראט	סיגמא	C7902	>99%
D-(+)-גלוקוז	סיגמא	G7021	מתאים לתרבית תאים, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 מ"מ צלחת תרבית תאים מטופלת TC	353003
FBS	R& D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulatators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Corpps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
סרט תיוג	פישר מדע	15-901-10R
Legato 100 משאבת מזרק	kdScientific	788100
L-גלוטתיון	פישר מדע	ICN19467980
ליבראז TH כיתה מחקר	סיגמא	5401135001	ריכוז תרמוליזין גבוה
M199	פישר מדע	MT10060CV
מגנזיום כלוריד	Invitrogen	AM9530G
עכבר למינין	קורנינג	354232
עט / סטרפטוקוק	פישר מדע
אשלגן כלורי	סיגמא	P5405	>99%
אמבט מים הדדי דיגיטלי מדויק	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
נתרן ביקרבונט	סיגמא	S5761	מתאים לתא תרבית
נתרן כלורי	סיגמא	S5886	>99%
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא	S5011	>99%
מסננת תאים סטרילית 70 ומיקרו; m	פישר מדע	22-363-548
מספריים עדינים לסטודנטים	כלים מדעיים עדינים	91460-11
VWR רפידות תחתונות סופגות	פישר מדע	NC9481815