שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

סיכום

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

תקציר

חלבונים בעלי אי-סדר פנימי ואזורים בעלי אי-סדר פנימי בתוך חלבונים מהווים חלק גדול ומשמעותי מבחינה תפקודית של הפרוטאום האנושי. האופי הגמיש מאוד של רצפים אלה מאפשר להם ליצור אינטראקציות חלשות, ארוכות טווח וחולפות עם שותפים ביומולקולריים מגוונים. אינטראקציות ספציפיות אך בעלות זיקה נמוכה מקדמות קשירה מופקרת ומאפשרות לפלח יחיד בעל הפרעה מהותית לקיים אינטראקציה עם מספר רב של אתרי יעד. בגלל האופי הארעי של אינטראקציות אלה, קשה לאפיין אותן באמצעות שיטות ביולוגיות מבניות המסתמכות על חלבונים כדי ליצור קונפורמציה אחת דומיננטית. NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית הוא כלי שימושי לזיהוי והגדרה של הבסיס המבני של אינטראקציות חלשות וחולפות. מתואר פרוטוקול מפורט לשימוש בשיפור הרפיה פאראמגנטי כדי לאפיין את קומפלקסי המפגש המאוכלסים בצפיפות נמוכה הנוצרים בין חלבונים בעלי הפרעה פנימית לבין החלבון, חומצת הגרעין או שותפים ביומולקולריים אחרים שלהם.

מבוא

הפרעה פנימית (ID) מתארת חלבונים (IDPs) או אזורים בתוך חלבונים (IDR) שאינם מתקפלים באופן ספונטני למבנים יציבים, משניים או שלישוניים, אך פעילים ביולוגית. באופן כללי, תפקידם של IDP / IDR הוא להקל על אינטראקציות ספציפיות אך הפיכות עם ביומולקולות בתנאים פיזיולוגיים¹. לפיכך, עקורים ו-IDR מעורבים במגוון תפקודים תאיים, כולל גיוס, ארגון וייצוב של קומפלקסים מרובי חלבונים, למשל, הרכבה ופעילות של הספליסוזום², גיוס וארגון רכיבים באתרים של נזק לדנ"א³, ארגון וייצוב הגיוס של מתחמי שעתוק⁴, או של מעצב הכרומטין BAF⁵. בנוסף, עקורים נמצאים בקשרי איתות, כאשר הפקרותם לשותפים כובלים שונים מאפשרת להם לתווך העברת מידע דרך רשתות חלבונים תאיות⁶. עבודה שנעשתה לאחרונה חשפה גם נטייה של אזורי IDR לקשר את עצמם ליצירת עיבויים ביומולקולריים באמצעות תהליך של הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית⁷. רבות מהפונקציות הנ"ל המערבות ID נחשבות כיום גם ככוללות היבט כלשהו של היווצרות עיבוי⁸. למרות חשיבותו של ID להרכבה ביומולקולרית מורכבת, ייצוב, פיגומים והעברת אותות, קשה לזהות את הפרטים האטומיים של האינטראקציות הספציפיות שלהם מכיוון שבדרך כלל עקורים ו- IDR אינם ניתנים לחקירה מבנית באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני.

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכניקה אידיאלית לחקר זיהוי מכיוון שהיא אינה תלויה בנוכחותם של הרכבים מבניים קשיחים או הומוגניים אלא מדווחת על הסביבה המקומית המיידית של גרעינים בודדים. תדירות התהודה, או השינוי הכימי, של גרעין במולקולה נתונה מושפעת משדות מגנטיים חלשים הנגרמים על ידי הפיזור האלקטרוני המקומי, שבתורו תלוי באורכי קשר, זוויות, קרבה של גרעינים אחרים, אינטראקציות עם שותפים קושרים וגורמים אחרים⁹. לפיכך, כל גרעין פועל כבדיקה מבנית ייחודית, ספציפית לאתר, הרגישה לשינויים בסביבתו הכימית המקומית. למרות יתרונות אלה, NMR היא טכניקה בתפזורת, והשינוי הכימי שנצפה הוא הממוצע של כל הסביבות שנדגמו על ידי גרעין מסוים. מגוון טכניקות NMR, שרבות מהן מתוארות בגיליון זה, פותחו כדי לשחזר מידע מבני, דינמי וקינטי על קונפורמציות ביומולקולריות בעלות אנרגיה גבוהה המאוכלסות נמוך הכלולות בשינוי הכימי הממוצע^10,11. למרות שהם מאוכלסים באופן ארעי, זיהוי וכימות של מצבים אלה חשובים לקביעת הפרטים של מנגנונים פונקציונליים¹². לדוגמה, במקרה של עקורים ו-IDRs, ההרכב הקונפורמטיבי עשוי להיות מוטה למדגם מועדף של קונפורמציות המועילות ליצירת מתחמי מפגש עם שותפים מחייבים פיזיולוגיים. זיהוי מצבים אלה, כמו גם זיהוי של אינטראקציות ודינמיקות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות ספציפיות לשאריות, חשובים כדי לקבוע את המנגנונים המבניים הבסיסיים של תפקוד חלבונים והיווצרות מורכבת.

פרוטוקול לשימוש ב-NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית (PRE) כדי לחקור מצבים ארעיים המאוכלסים באוכלוסייה נמוכה החשובים להיווצרות קומפלקסים ביומולקולריים בתיווך IDP / IDR מתואר¹³. גישה זו שימושית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון חולפות, כגון אלה המקדמות הרכבה של סיבי עמילואיד מ-α-סינוקלאין 14,15 או הקשר העצמי של FUS^16, כמו גם לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות כגון בין חלבוני איתות¹⁷. מוצגת דוגמה לשיוך עצמי של IDP, שבו אינטראקציות בין-מולקולריות ספציפיות ותוך-מולקולריות גורמות למצבים דחוסים מועדפים, כמו גם אינטראקציות ספציפיות לאתר המניעות אסוציאציה עצמית.

ה-PRE נובע מהאינטראקציה הדיפולרית המגנטית של גרעין למרכז פאראמגנטי עם טנזור G איזוטרופי, המסופק בדרך כלל בצורה של אלקטרון לא מזווג על קבוצת חנקן אוקסיד או כאטום מתכת פאראמגנטי¹⁸ (איור 1). בעוד אטומים עם טנזור G אנאיזוטרופי מייצרים גם אפקט PRE, ניתוח של מערכות אלה קשה יותר בשל השפעות מבלבלות שנתרמו על ידי משמרות מגע מדומה (PCS) או צימוד דיפולרי שיורי (RDC)^13,19. עוצמת האינטראקציה בין גרעין למרכז פאראמגנטי תלויה במרחק <^r-6> בין השניים. אינטראקציה זו גורמת לעלייה בקצב ההרפיה הגרעינית, מה שגורם להרחבת קווים הניתנים לגילוי אפילו עבור אינטראקציות ארוכות טווח (~ 10-35 Å), מכיוון שהמומנט המגנטי של האלקטרון הבלתי מזווג הוא כה חזק^20,21. זיהוי מצבים ארעיים עם PRE אפשרי אם מתקיימים שני התנאים הבאים; (1) האינטראקציה הארעית היא בחליפין מהיר על ציר הזמן של NMR (השינוי הכימי שנצפה הוא ממוצע משוקלל אוכלוסייה של המדינות המחליפות); ו-(2) מרחק הגרעינים למרכז הפאראמגנטי קצר יותר במצב המאוכלס באופן ארעי מאשר במצב העיקרי¹¹. ה- PRE הרוחבי מסומן Γ₂ ולמטרות מעשיות מחושב מההפרש בקצבי הרפיה רוחביים של ¹H בין דגימה המכילה מרכז פאראמגנטי לבין בקרה דיאמגנטית. לטיפול מעמיק בתיאוריה של PRE ושינויים פסאודו-קונטאזטיים הקשורים אליה במשטרי חליפין מהירים ואיטיים מופנה הקורא לסקירות המקיפות של קלור ועמיתיו^13,22. כאן, רק המצב שבו ¹H N-Γ₂ נמצא במשטר החליפין המהיר נחשב, שבו בגלל התלות ^r-6 של PRE, קצב ההרפיה שנצפה קשור הן למרחק שאליו המרכז הפאראמגנטי מתקרב לגרעין והן לכמות הזמן שהוא מבלה באותה קונפורמציה. לכן, קונפורמציות ארעיות שאינן כרוכות בגישה קרובה מייצרות PRE קטן בעוד שאינטראקציות קרובות יותר, גם אם קצרות מועד, ייצרו PRE גדול יותר.

עבור עקורים, ה- PRE משמש למדידה ולהבחנה של האינטראקציות המתרחשות בתוך מולקולה אחת (תוך מולקולרית) ובין מולקולות נפרדות (בין מולקולרית). על-ידי הצמדת מרכז פאראמגנטי לחלבון NMR גלוי (למשל, ¹⁵N-מסומן) או NMR בלתי נראה (למשל, שפע טבעי ¹⁴N), ניתן לקבוע את המקור (הבין-מולקולרי או התוך-מולקולרי) של ה-PRE (איור 2). מוטגנזה מכוונת אתר המציגה שאריות ציסטאין היא גישה נוחה להצמדת מרכז פאראמגנטי (תווית ספין) לחלבון²³. מספר סוגים של מולקולות הוצעו לשימוש כתוויות ספין, כולל כלאט מתכת (מבוסס EDTA) ורדיקל חופשי (מבוסס חנקן)²⁴. תוויות שונות של ספין חנקן תוארו והן זמינות עם כימיות תגובתיות שונות לציסטאין כגון מתאתיוסולפונט, מלימיד ויודואצטמיד^25,26 (איור 1). גמישות מובנית של התג או של המקשר עלולה להיות בעייתית עבור ניתוחים מסוימים, ובמצבים אלה הוצעו אסטרטגיות שונות להגבלת תנועת התג, כגון על ידי הוספת קבוצות כימיות מגושמות או שימוש במקשר שני כדי לעגן את התג לחלבון (חיבור לשני אתרים)^{27, 28}. בנוסף, תגים זמינים מסחרית עשויים להכיל חלבונים דיאסטריאומריים אך בדרך כלל זה לא יתרום ל- PRE²⁹ שנצפה. השימוש ב-3-Maleimido-PROXYL המחובר לציסטאין חופשי באמצעות כימיה של maleimide מתואר מכיוון שהוא זמין, חסכוני, בלתי הפיך, וניתן לשמור על החומר המחזר tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) בתמיסה לאורך כל תגובת התוויה. מכיוון של-3-Maleimido-PROXYL יש טנזור G איזוטרופי, לא מושרים PCS או RDC, וניתן להשתמש באותן הקצאות שינוי כימיות הן עבור הדגימות הפאראמגנטיות והן עבור הדגימות הדיאמגנטיות¹³.

¹H N-T₂ נמדד באמצעות אסטרטגיית שתי נקודות זמן (T _a, T_b) שהוכחה בעבר כמדויקת כמו איסוף סדרת אבולוציה מלאה המורכבת מ-8 עד 12 נקודות זמן³⁰. נקודת הזמן הראשונה (T _a) מוגדרת קרוב לאפס כמעשית, והאורך האופטימלי של נקודת הזמן השנייה תלוי בגודל ה-PRE הגדול ביותר הצפוי עבור מדגם נתון וניתן להעריך אותו מ: T_b ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) כאשר R _2,dia מייצג את R ₂ של המדגם הדיאמגנטי¹³. אם סדר הגודל של ה- PREs הגדולים ביותר אינו ידוע, הגדרת T _b ל~ פי ¹H T 2 של החלבון היא הערכה ראשונית טובה וממוטבת עוד יותר על ידי התאמת T₂ כדי לשפר את האות לרעש. אסטרטגיית מדידה דו-נקודתית זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן הניסוי הדרוש למדידת PREs ומאפשרת זמן לממוצע אותות רב יותר, במיוחד מכיוון שדגימות מדוללות יחסית משמשות למזעור ההשפעות של מגעים לא ספציפיים בין מולקולות. רצף פולסים מבוסס HSQC משמש למדידת ¹H_{N-T 2} ותואר בפירוט במקום אחר³⁰. לשיפור הרגישות, ניתן להחליף את הפולסים הקשיחים של העברות INEPT קדימה ואחורה בפולסים מעוצבים; לחלופין, הרצף מומר בקלות לקריאה³¹ מבוססת TROSY. מכיוון שלעקורים יש בדרך כלל שיעורי הרפיה רוחביים ארוכים בהרבה וכתוצאה מכך רוחב קו צר יותר (בשל ההפרעה המובנית) מאשר חלבונים כדוריים בגודל דומה, ניתן להשתמש בזמני רכישה ארוכים בממד העקיף כדי לשפר את הרזולוציה הספקטרלית ולהקל על מגבלת פיזור השינוי הכימי הטבועה בעקורים.

PRE הוא כלי שימושי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-חומצות גרעין, במיוחד אינטראקציות חולפות או מאוכלסות נמוך. מצורף פרוטוקול מפורט להכנת דגימת NMR המתאימה למדידת PREs, כולל שלבים לטיהור חלבונים, תיוג ספין מכוון אתר, הגדרה וכיול של תוכנית הדופק, עיבוד ופענוח נתוני NMR. לאורך כל הדרך מצוינים שיקולים ניסיוניים חשובים שעשויים להשפיע על איכות הנתונים ותוצאות הניסוי, כולל ריכוז הדגימה, בחירת תווית הספין והסרת רכיבים פאראמגנטיים.

פרוטוקול

דרישות כלליות לפרוטוקול: מתקני טיהור חלבונים, ספקטרומטר UV-Vis, ספקטרומטר NMR שדה גבוה ותוכנת הפעלה, תוכנת ניתוח לאחר עיבוד כולל; NMRPipe³², Sparky³³, (או CCPN Analysis³⁴, או NMRViewJ³⁵).

1. ביטוי רקומביננטי וטיהור חלבון למדידות PRE

1. עצבו מבנה ביטוי לחלבון המעניין כך שתהיה שארית ציסטאין יחידה. מוטציות מרובות יידרשו כדי להכניס ציסטאין חופשי במיקומים שונים בחלבון המעניין³⁶.
2. לבטא ולטהר שפע טבעי (¹⁴N) או ¹⁵N מסומן מדגם של החלבון המעניין באמצעות פרוטוקול^{מבוסס 37}.
   הערה: מערכות ביטוי E. coli מספקות שיטה חסכונית וחזקה לביטוי חלבונים רקומביננטיים מכיוון שהעשרה איזוטופית של ¹⁵N היא דרישה מינימלית לספקטרוסקופיית NMR ביומולקולרית הטרו-גרעינית. שלבים אופייניים הם ביטוי במדיה מינימלית, טיהור כרומטוגרפי והסרת תג טיהור זיקה. פרוטוקול זה מניח שנקבע פרוטוקול ביטוי וטיהור חזק שיכול לייצר מספיק חלבון באיכות מתאימה לחקירות NMR.
   1. שמור על חומר מקטין 1 mM (DTT או TCEP) במאגרים בכל שלבי הטיהור כדי למנוע תגובה של ציסטאין חופשי והיווצרות קשרים דיסולפידים בין-מולקולריים עבור עקורים.
      הערה: מערכות מסוימות עשויות להיות סובלניות יותר ומועדות פחות לצבירה בתנאים שאינם מחזרים בהתאם למאפיינים הספציפיים של החלבון, כמו גם לטמפרטורה, ל- pH ולמערכת החיץ שנבחרו לטיהור³⁸.
   2. הסר תגי זיקה המשמשים לטיהור לפני שתמשיך, מכיוון שהם עשויים לתקשר באופן לא ספציפי עם החלבון בדרכים בלתי צפויות או אולי להכיל שאריות ציסטאין תגובתי שעלולות לשמש בשוגג כאתר התקשרות לא מכוון.
   3. הכינו דגימת ייחוס מסומנת של ¹⁵N ללא מוטציות ציסטאין מעורבבות עם גרסה מסיסה של תווית הספין כדי להעריך את תרומתם של PREs ממסים.

2. הצמדת תווית הספין 3-Maleimido-PROXYL nitroxide

1. לאחסן או להחליף את החלבון המטוהר לתוך מאגר degassed המכיל 50 mM Tris pH 7 ו 1 mM TCEP; המאגר עשוי להכיל גם עד 8 M אוריאה במידת הצורך כדי לסייע למסיסות החלבון.
   לחלופין, דללו במהירות תמיסת מלאי חלבונים ללפחות 10 שווה ערך לנפח של מאגר TCEP של 50 mM Tris pH 7 ו-1 mM TCEP. ודא שריכוז החלבון לפני הוספת תווית ספין הוא לפחות 100 מיקרומטר.
2. הוסף 3-Maleimido proxyl מתמיסת מלאי עודף מולארי פי 20 של החלבון המעניין. להגן על הדגימה מפני אור וחמצן ולדגור לילה בטמפרטורת החדר או 4 °C (75 °F); נדנוד עדין או אגוז עשוי לשפר את יעילות התוויה.
3. הכן תמיסות מלאי של תווית הספין על ידי המסת אבקת 3-Maleimido proxyl באתנול 95%. Aliquots של המניות ניתן לאחסן ב -80 °C למשך פחות מ 6 חודשים.
4. שלב קריטי: הסר את תווית הספין החופשית ללא תגובה כדי למנוע PREs ממסים לא ספציפיים. השג זאת על ידי סינון ג'ל או (רצוי) דיאליזה נרחבת של דגימת החלבון. שלב זה גם יכניס את החלבון למאגר המתאים ל-NMR.
   הערה: יש להכין חומרים מחזרים טריים, ולשקול תאימות בין רכיבי חיץ; לדוגמה, TCEP מתפרק במהירות במאגרים מבוססי פוספט, ויש להימנע משילוב זה³⁹.
5. טפל בכל החוצצים המשמשים משלב זה ואילך עם שרף כלציה סלקטיבי למתכות דו-ערכיות ומתכות מעבר כדי להסיר יונים פאראמגנטיים או מרווה תווית ספין. אם לא ניתן לאחסן את החלבון במאגר NMR, רכז את החלבון כדי להיות מדולל במהירות לתוך חיץ מתאים NMR.
6. מעקב אחר היעילות של שילוב תוויות ספין.
   1. השתמש בריאגנט של אלמן (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) לכימות קבוצות סולפידריל חופשי בתמיסה⁴⁰.
      הערה: פרוטוקולים מפורטים זמינים מהיצרן. למטרות כאן, חשוב לקבוע שילוב של תווית ספין, הריכוז של קבוצות sulfhydryl חופשי מושווה עם ריכוז חלבון כולל. אחוז קבוצות הגופרית החופשית הוא אחוז המולקולות שאין להן תווית ספין חנקן מחוברת.
   2. עקוב אחר עוצמת השיא המתאימה לשאריות הציסטאין המתויגות כדי לשפוט שילוב תווית ספין בחלבון המעניין.
      הערה: זוהי גישה מהירה ויעילה לקביעת מידת תיוג הספין של החלבון. שילוב מלא של תווית הספין יביא להיעלמות הפסגה מהספקטרום. עם הפיזור הירוד האופייני לעקורים, לא תמיד ניתן לזהות בקלות את השיא המתאים לשאריות הציסטאין המוטנטיות, ולכן מומלץ להשתמש בריאגנט של אלמן (שלב 2.6.1).

3. הכנת דגימת NMR למדידת PRE תוך-מולקולרי או בין-מולקולרי

1. הכנת דגימה למדידה של PRE תוך-מולקולרי
   1. הכינו ¹⁵N חלבון מועשר איזוטופית עם תווית ספין לריכוז של לפחות 100 מיקרומטר אך לא יותר מ-300 מיקרומטר במאגר המתאים ל-NMR. נפח הדגימה הכולל (כולל D₂O) הוא 500 - 550 μL.
      הערה: מאגרי NMR נפוצים כוללים פוספט, אצטט, (בי)קרבונט ו-TRIS. גם מאגרים של גוד כמו MES, HEPES עשויים להתאים. נקוט משנה זהירות בעת בחירת מאגרים כדי להבטיח שלא תהיה תגובתיות צולבת עם רכיבי פתרון אחרים.
   2. ודא כי ה- pH הוא ~ 7.2 או נמוך יותר כדי למזער את ההשפעות של חילופי פרוטונים אמיד עם מים. שמרו על ריכוז מלח נמוך ככל האפשר (בדרך כלל פחות מ -150 מילימול), אם כי השיקול העיקרי הוא לשמור על יציבות החלבון.
      הערה: גישות לביצוע ניסויי NMR בתנאים עתירי מלח תוארו במקום אחר⁴¹.
2. הכנת דגימה למדידת PRE בין-מולקולרית
   1. בצע שלב זה או שלב 3.1; הם אינם מבוצעים בו זמנית. הכינו ¹⁴N בשפע טבעי, חלבון מסומן בספין במאגר NMR שנבחר.
   2. הכינו את דגימת החלבון על ידי ערבוב ¹⁵N חלבון מועשר איזוטופית שאינו מסומן בספין עם 1%-50% ¹⁴N חלבון בעל תווית ספין בשפע טבעי, כך שהריכוז הסופי יהיה זהה לדגימה שהוכנה ב-3.1.1. נפח הדגימה הכולל (כולל D₂O) הוא 500 - 550 μL.
   3. אופטימיזציה אמפירית של היחס בין חלבוני ¹⁵N ו- ¹⁴N עבור כל חלבון שנחקר. היחס של 1%, 5% ו-20% של ¹⁴חלבונים בעלי תווית N-spin הם נקודות התחלה טובות.
      הערה: הצטברות של PRE כפונקציה של תוספת ^{של 14}חלבונים בעלי תווית N-spin מצביעה על השפעה ספציפית; ה-PRE שנצפה הוא ספציפי לדגימה מכיוון שהוא תלוי במרחק ובאוכלוסייה (כפי שנדון לעיל), ולכן יידרשו יחסים גבוהים יותר של ¹⁴חלבון מסומן ב-N-spin אם האינטראקציה חולפת במיוחד¹⁷.
3. העבירו את דגימת ה-NMR (תוך-מולקולרית או בין-מולקולרית) לצינור NMR בקוטר 5 מ"מ המתאים לשימוש במגנטים בעלי שדה גבוה באמצעות פיפטת זכוכית או מיקרופיפטה בעלת גזע ארוך (9 אינץ'). ודא שכל דגימות ה- NMR כוללות 5%-10% מ- D₂O כדי להקל על נעילת השדה.
   הערה: צינורות NMR המשתמשים בתקעי פולימר כדי להפחית את נפח הדגימה הדרוש אינם מומלצים למדידות PRE עקב קשיים הקשורים לשיימינג דגימה יעיל.

4. הגדר ספקטרומטר NMR והתנסה בפרמטרים ספציפיים

1. יש לנקוט משנה זהירות בעבודה סביב ספקטרומטרים של NMR מוליכי-על בעלי שדה גבוה.
   הערה: הסכנות כוללות פציעות עקב האצה פתאומית של חפצים מתכתיים לכיוון המגנט, הפרעה למכשירים רפואיים מושתלים וחנק עקב שחרור פתאומי של גז N 2 ו- He₂ במקרה של מרווה מגנטית. השלבים הבאים יוצאים מנקודת הנחה שהקורא עבר את ההכשרה הנדרשת, מודע לסיכונים מקומיים אלה ואחרים, וקיבל אישור ממנהל המתקן להפעיל את ספקטרומטר התמ"ג. במקרה של ספק לגבי צעד או הוראה, התייעץ עם מנהל המתקן או המשתמש המנוסה כדי למנוע פגיעה גופנית פוטנציאלית או נזק לספקטרומטר.
2. השלבים הבאים מניחים ספקטרומטר NMR מסחרי המריץ גרסה מודרנית של תוכנת בקרת הרכישה. הורד את תוכנית הדופק ואת קבצי הפרמטרים ומקם אותם בספריות המתאימות.
   הערה: תוכנית פולסים וערכת פרמטרים המתאימים לשימוש עם ספקטרומטר Bruker ו- TopSpin (3.2 ואילך) זמינים על פי בקשה מהמחברים.
   1. שלב קריטי: היכרות עם התקנת תוכניות דופק NMR שאינן מקוריות משוערות; התייעץ עם מנהל המתקן או משתמש מנוסה במידת הצורך.
3. הניחו את הדגימה במגנט, נעלו את האות ²H באמצעות פקודת הנעילה, כוונו והתאימו את ערוץ ¹H בהתאם לפרוטוקולי המתקן (ההליך המדויק יהיה תלוי אם הגשושית מצוידת במודול כוונון והתאמה מרחוק).
4. התאם את ה- shims באמצעות שגרת topshim כדי לייעל את דיכוי אות הממס.
5. כייל את הפולסים של ¹H ו- ¹⁵N 90° בשיטות סטנדרטיות.
   1. כייל את פעימת ¹H באמצעות תוכנית popt (השתמש תחילה בפולסקל כדי להעריך את אורך הדופק).
   2. כיול פולס ¹⁵N כנגד מדגם סטנדרטי; ודא שערך זה כויל לאחרונה על-ידי דיון עם מנהל טכני או משתמש מנוסה.
   3. לחלופין, כייל את פעימת ¹⁵N על הדגימה על ידי שינוי אחת מהפולסים של 90° של ניסוי HMQC עד לקבלת אות אפס.
   4. קבע את ההנחתה הנכונה עבור פולסים מעוצבים באמצעות שגרת הכלי צורה (stdisp).
   5. פתח את קובץ צורת הדופק המתאים על ידי לחיצה על סמל התיקייה. הפולסים המעוצבים נמצאים בסעיף פרמטרי הדופק של ACQUPARS.
   6. טען את קובץ הגדרת הדופק ולחץ על נתח צורת גל > שלב צורה. הזן את הפולס הקשיח המכויל של ¹H 90°, אורך הפולס הרצוי והסיבוב (90° או 180°).
   7. חשב את רמת ההספק של הפולס המעוצב על-ידי הוספת השינוי ברמת ההספק להנחתה עבור הפולס המכויל של 90°.
6. הקלט HSQC ^{סטנדרטי של 1}H, ¹⁵N (hsqcetfpf3gpsi) כדי למטב את רוחב הטאטוא, תדירות הנשא ולבדוק את דיכוי המים²⁵.
7. התאם את רוחב הניקוי ואת מספר הפרשי הממדים העקיפים באמצעות הפקודות sw ו- td או ישירות בתיבות הדו-שיח המתאימות. בדרך כלל, לאיסוף PREs, רוחבים ספקטרליים נבחרים כך שהספקטרום אינו מקופל.

5. הגדר את ניסוי ¹H_{N-T 2}

1. כיול הפולסים המעוצבים כמתואר לעיל (4.4.5-4.5.7). קובצי פרמטרי הדופק המעוצבים עבור ניסוי PRE הם Eburp2.1000 (פולס 90°), Reburp.1000 ו- Iburp2.1000. הזינו את אורכי הפולסים המכוילים באזור פרמטרי הפולס בכרטיסייה ACQUPARS .
2. ניסוי זה מודד את ¹H N-T₂ באמצעות גישת שתי נקודות עיכוב זמן³⁰.
   1. הגדר את עיכובי הזמן על ידי עריכת קובץ ה- vdlist, ההשהיה הראשונה (T_a) מוגדרת ל- 0.01 ms.
   2. בחר את ההשהיה השנייה, (T b) באמצעות הקשר ל- PRE המרבי הצפוי (T _b ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) כאשר R _2,dia מייצג את R ₂ של הדגימה הדיאמגנטית¹³. ללא ידע מוקדם על גודל תרומת PRE להרפיה הנצפית, נקודת התחלה טובה היא הגדרת T _b ל~ 1x ¹H T₂.
   3. לאחר מכן קבע ערך מתאים על ידי השוואת ההפרשים הראשונים (מעובדים עם הפקודה efp) של ספקטרום T _a ו- T b והתאמת T_b כך שהאות דועך ל- 40%-50% מערכו ההתחלתי.
      הערה: גישה זו ממטבת את האות הספקטרלי לרעש, שיקול הכרחי עבור דגימות שאינן יכולות להיות מרוכזות מאוד (< 50 מיקרומטר). ערכים מתאימים של T_b הם תלויי דגימה אך בדרך כלל נעים בין 8 - 40 מילישניות עבור חלבון בגודל ממוצע.
3. קבע את מספר הנקודות המורכבות להקלטה ואת מספר הסריקות לממוצע אות מספיק. מכיוון שלעקורים יש ¹⁵N T₂ ארוכים יותר מאשר חלבונים מקופלים בגודל דומה, ניתן להשתמש בזמני רכישה ארוכים יותר בממד העקיף.
   הערה: ערך זה תלוי במאפיינים הספציפיים של החלבון, אך ניתן להעריך אותו באופן גס מתוך ¹⁵N T₂ ולמטב אותו על ידי ניטור דעיכת אות ב- FID. עבור הממד הישיר, 1024* נקודות מורכבות (רוחב טאטוא של 13 עמודים לדקה, זמן רכישה של 112.6 אלפיות השנייה) מספיקות לרוב הדגימות.
4. השתמש בפקודה expt כדי לחשב את זמן הניסוי ולאחר מכן התחל את הניסוי עם הפקודה zg.

6. הכינו דגימה דיאמגנטית על ידי הפחתת תווית הספין עם חומצה אסקורבית

1. המסת נתרן אסקורבט במאגר NMR והתאמת ה- pH כך שיתאים למאגר ה- NMR המקורי.
2. חשב את הריכוז של מלאי נתרן אסקורבט כך שניתן יהיה להוסיף עודף מולארי פי 10 של אסקורבט על ריכוז תווית הספין עם השינוי הקטן ביותר בנפח הדגימה. לדוגמה, עבור דגימת חלבון של 100 מיקרומטר, מלאי של 100 מילימטר של אסקורבט מתאים. הפחתת תווית הספין תדרוש הוספת 5.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי חומצה אסקורבית, שהם רק 1% מנפח הדגימה הכולל.
3. הוסף את הכמות הנדרשת של חומצה אסקורבית לצינור NMR על ידי הנחת טיפה מתחת לשפת הצינור, סגור את הצינור, הפוך בזהירות את הצינור כדי לערבב, ולאחר מכן סובב ב 200-400 x גרם במשך 10-20 שניות בצנטריפוגה ידנית כדי ליישב את הדגימה בתחתית הצינור.
4. עטפו את צינור ה-NMR בנייר כסף כדי להגן מפני אור ולאפשר לתגובה להימשך לפחות 3 שעות.
5. הקלט ¹H_{N-T 2} על הדגימה הדיאמגנטית באמצעות אותם פרמטרים המשמשים לדגימה הפאראמגנטית.
6. כיול מחדש של הפולסים. עם זאת, הם לא היו צריכים להשתנות מן המדידות פאראמגנטיות; אם הם שונים באופן משמעותי (> הבדל של 0.5 מיקרוגרם), שקול את איכות המדגם (למשל, השפלה, משקעים).
7. ודא שכל פרמטרי הרכישה, כולל עיכובי ההרפיה שצוינו (vdlist), מספר סריקות הדמה, מספר הסריקות שנאספו, מספר הנקודות המורכבות שנאספו, זמן הרכישה, רוחב הטאטוא ותדרי הנשא יישארו זהים עבור הדגימות הדיאמגנטיות והפאראמגנטיות.

7. תהליך ספקטרום פאראמגנטי ודיאמגנטי

1. העתק את הנתונים למחשב מקומי או לתחנת עבודה שבה מותקנים ומוגדרים NMRPipe ו- Sparky. צור תיקייה בשם proc בספריית נתוני הניסוי המכילה את קובץ ser.
2. העתק את סקריפטי NMRPipe fid.com, p3d.com ו- nmrproc.com לתוך proc (סקריפטים לעיבוד זמינים לפי בקשה מהמחברים).
   1. השתמש בסקריפט fid.com כדי להמיר את תבנית הנתונים Bruker (ser) לתבנית NMRPipe.
   2. השתמש בסקריפט p3D.com כדי לפצל את מישורי הפסאודו-3D לספקטרום נפרד.
   3. השתמש בסקריפט nmrproc.com כדי לקרוא את הפלט של סקריפט fid.com, להחיל דיכוי ממס, פונקציית חלון, לצרף אפסים לנתונים הגולמיים (אפס מילוי), להחיל תיקון פאזה, לבצע המרת פורייה, לחתוך את הנתונים לתצוגה ולכתוב את הנתונים המעובדים לדיסק. הסקריפט יפיק קובץ אחד עבור כל עיכוב הרפיה שנרשם (T _a ו- T_b).
      הערה: כל אחד מסקריפטים אלה ניתן להתאמה אישית כדי למטב את העיבוד עבור הפרטים הספציפיים של כל ניסוי. ערכות לימוד וערכות נתונים לדוגמה כלולות בהתפלגות NMRPipe הזמינה באתר האינטרנט של NMRPipe³². NMRDraw עשוי לשמש לצפייה ספקטרלית במהלך העיבוד (למשל, קביעת זוויות פאזה נכונות וכו'). ניתן להציג את האפשרויות הזמינות עבור פקודות NMRPipe באמצעות הפקודה nmrPipe -help.

8. העברת משימות תהודה וחילוץ גבהים שיא

1. שנה את פרטי כותרת הקובץ עבור כל קובץ ספקטרום (T _a, T_b עבור דגימות פאראמגנטיות ודיאמגנטיות כאחד) באמצעות הפקודה sethdr [filename] -ndim 2.
2. השתמש ב- Sparky כדי לחלץ גובה שיא³³ לפי השלבים 8.3-8.5. חבילות תוכנה אחרות, כולל NMRPipe (NMRDraw)³², CCPN Analysis 34 ו- NMRViewJ³⁵ מתאימות גם הן.
3. קרא את הקבצים הספקטרליים לתוך Sparky. בשלב זה מערך הנתונים יכלול ספקטרום אחד עבור כל ספקטרום נקודת זמן (T _a, T_b), הן עבור הדגימות הפאראמגנטיות והן עבור הדגימות הדיאמגנטיות, הנמדדות עבור כל מיקום של תווית הספין בחלבון.
4. השתמש ב- Sparky כדי לבחור פסגות (פקודה: F8, ולאחר מכן לחץ וגרור) ולהעביר הקצאות באמצעות הכלי העברת רשימת שיאים מרשימת שיא של הפניות.
   הערה: הקצאות תהודה של החלבון המעניין נחוצות לפרשנות ספציפית לרצף של PREs³⁶ שנצפו.
   1. הגדר קווי מתאר הן בספקטרום פאראמגנטי והן בספקטרום דיאמגנטי באותה רמה. הקפד להגדיר את קווי המתאר כך שהספקטרום שנאסף לאחר עיכוב הזמן לא יכלול בכוונה פסגות אלא יהיה גבוה מספיק כדי שהספקטרום T_a לא יהיה רועש מדי.
5. שמור את רשימות הפסגות החדשות עבור כל ספקטרום וכלול את עוצמת השיא הנמדדת ואת יחס האות לרעש המחושב של Sparky (פקודה: lt כדי לפתוח את רשימת המיקרים, לחץ על אפשרויות כדי לכלול עמודות עוצמה ו- SNR, פקודה: שמור).

9. לחלץ ¹H N-T₂ שיעורים עבור כל שארית ולחשב PRE

1. ייבא את רשימות השיא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים או לשפת תכנות מועדפת כגון Python.
   הערה: עבור כל מיקום תווית ספין על החלבון, מערך הנתונים יכלול ארבע רשימות שיא עם עוצמות שיא קשורות, אחת של T _a ו- T_b עבור הניסויים הפאראמגנטיים והדיאמגנטיים כאחד.
2. חשב ¹H_N R₂ עבור הדגימות הפאראמגנטיות והדיאמגנטיות באמצעות המשוואה:
   
   
3. השתמש במשוואה לעיל כדי לקבוע את קצב ההרפיה עבור כל שארית עבור הדגימות הפרמגנטיות והדיאמגנטיות.
4. קבע את קצב ¹H N-Γ₂ עבור כל שארית באמצעות המשוואה:
   
5. השתמש ביחס אות לרעש (SNR) המחושב של Sparky כדי לחשב את אי הוודאות של גובה השיא עבור כל שאריות.
6. הפצת השגיאה באמצעות המשוואה:
   
7. חלקה ¹H_{N-Γ 2} כפונקציה של מספר השאריות באמצעות תרשים פיזור כולל השגיאה המחושבת ב- 9.6.

תוצאות

Intramolecular ¹H N-Γ₂ PREs תועדו על מקטע בעל שיוך עצמי והפרעה מהותית (שאריות 171-264) שמקורו בתחום הסיבוכיות הנמוכה של החלבון קושר הרנ"א EWSR1⁴² (איור 3). שאריות בסמיכות רציפה לנקודת החיבור של תווית הספין (לדוגמה, שאריות 178 או 260 באיור 3) צפויות להתרחב באופן משמעותי ואינן ניתנות לגילוי בספקטרום. שאריות במרווחים רציפים מנקודת החיבור אך מראות Γ משופרת ₂ היו קרובות מרחבית (10-3...

דיון

הוצגה שיטה לאפיון אינטראקציות חולפות הקיימות באוכלוסיות נמוכות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית לבין שותפים קושרים שונים באמצעות PRE. בדוגמה המוצגת, החלבון הוא שיוך עצמי, ולכן PRE עשוי לנבוע משילוב של אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות. שיטה זו מורחבת בקלות לדגימות הטרוגניות שבהן ניתן לאפיין את האינטראקציות בין שני חלבונים שונים. מידע משלים על האופן שבו אזורים שונים של החלבון מתקשרים זמין על ידי הצבת תווית הספין במיקומים שונים בתוך החלבון. בנוסף, על ידי החלפת תווית הספין בין מינים פעילים של NMR (¹⁵N) ו-NM...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.45 ומיקרו; m ו-0.22 ומיקרו; מסנני מזרק m	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	מסנן ליזאט לפני שלב הטיהור הראשון ולפני כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.
צלחת פטרי 100 מ"מ	פישר	FB0875713	צלחות אגר לטרנספורמציה חיידקית.
14N אמוניום כלוריד	סיגמא אולדריץ'	576794	שימוש ב15N במדיום M9 יפיק חלבון גלוי NMR, 14N יפיק חלבון בלתי נראה NMR
15N אמוניום כלוריד	סיגמא אולדריץ'	299251	שימוש ב-15N במדיום M9 יפיק חלבון גלוי לעין 14N יפיק חלבון בלתי נראה NMR
3 ליטר בקבוק מבולבל פרנבך	431523 תרבית		ביטוי חיידקים
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	תווית ספין ניטרוקסיד
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	Thermo Fisher	14-432-22	תמיסה/חלבון אחסון
מסנן צנטריפוגלי Amicon	Millipore Sigma	UFC900308	ריכוז חלבון
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	אנטיביוטיקה לסמן סלקטיבי, הבחירה המדויקת תלויה במבנה הביטוי פלסמיד
איזון אנליטי	Oahus	30061978	Explorer Pro, לשקילת ריאגנטים
חומצה אסקורבית	Sigma Aldrich	AX1775	מפחית תווית ספין ניטרוקסיד
חיטוי			עיקור כלי זכוכית ואמצעי תרבית
סידן כלוריד	סיגמא אולדריץ'	C4901	M9 רכיב מדיה
בקבוקי צנטריפוגה	תרמו פישר	010-1459	קציר תאי E. coli לאחר ביטוי חלבון רקומביננטי
צנטריפוגה, ארכובה ידנית	תומאס סיינטיפיק	0241C68	צנטריפוגה מונעת ידנית במהירות נמוכה של Boekel עם דליים של 15 מ"ל שיכולים להכיל צינורות NMR
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	הסר תרכובות פרמגנטיות מזהמות מפתרונות חיץ
		עבודה ממוחשבת	לינוקס או Mac OS תואמת לחבילות תוכנה לעיבוד וניתוח נתוני NMR כגון NMRPipe ותחמוצת דאוטריום Sparky
	Sigma Aldrich	151882	דרוש לאות נעילת NMR
דקסטרוז	סיגמא אולדריץ'	D9434	M9 רכיב מדיה
Dibasic נתרן פוספט	סיגמא אולדריץ'	S5136	M9 רכיב מדיה
מגיב אלמן (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)Thermo	Fisher	22582	כימות שאריות ציסטין חופשיות
צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה	Thermo Fisher	3114-0050	משמש לניקוי ליזט חיידקים.
מכשיר NMR בשדה גבוה (600 - 800 מגה-הרץ)	ברוקר		מצויד בבדיקה קריוגנית רב-ערוצית ועמודת IMAC לבקרת טמפרטורה
, HisTrap FF	Cytvia	17528601	פיצול ראשוני של ליזאט חיידקי גולמי
איזופרופיל B-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	גורם לביטוי חלבון לגנים בשליטת מפעיל ה-lac
LB agar	Thermo פישר	22700025	פריטים משמשים להפיכת E. coli כדי לבטא חלבון מעניין, החלפות לכל אחד מהפריטים הללו עם מוצרים דומים מקובלות.
מרק LB	Thermo Fisher	12780052
מערכת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic משמשת לכומטוגרף בלחץ נמוך כגון הפעלת עמודות IMAC
מגנזיום גופרתי	Sigma Aldrich	M7506	M9 רכיב מדיה
מערכת כרומטוגרפיה בלחץ בינוני	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC מצויד בגלאי מרובה אורכי גל, צגי pH ומוליכות, ואספן שברים אוטומטי
תמיסת ויטמין MEM	Sigma Aldrich	M6895	M9 רכיב מדיה
Microfluidizer	Avestin	EmulsiFlex-C3	מספק ליזה מהירה ויעילה של תאי חיידקים
Micropipettes	Thermo Fisher		סט מכויל של מיקרופיפטרים עם קצות חד פעמיים מתאימים כהלכה (זמין ממספר יצרנים כגון Eppendorf)
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma Aldrich	1551139	M9
רכיב מדיה פיפטות NMR	סיגמא אולדריץ'	255688	להסרת דגימה מצינור
NMR צינור דגימת NMR	NewEra	NE-SL5	מתאים לספקטרומטרים
NMR בשדה גבוהצנטריפוגה מכינה	בקמן קולטר	Avanti J-HC	קציר תאי E. coli לאחר ביטוי חלבון רקומביננטי
צינורות צנטריפוגה פוליסטירן תחתון עגול	קורנינג	352057	חממת טלטול חיידקים שקופים
	Eppendorf	S44I200005	גידול מבוקר בטמפרטורה של תרביות התחלה וביטוי E. coli
נתרן	כלורי סיגמא אולדריץ'	S5886	רכיב מדיה M9
סוניקציה אמבט מים ומקור ואקום	תומס סיינטיפיק		משמש להסרת גז פתרונות חיץ
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	משמש לליזה של תאי חיידקים או גזירה של DNA חיידקי
ספקטרופוטומטר	Implen	OD600 דילופוטומטר	עקוב אחר צמיחה של תרביות ביטוי חלבון E.coli
Superdex 200 16/600 גודל exculsion colum	Cytvia	28989333	שלב טיהור חלבון סופי
תוכנת Topspin, גרסה 3.2 ואילך	Bruker		תוכנת הפעלה למכשיר NMR
טרנספורמציה תאי E. coli מוכשרים	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) מוכשר כימית E. coli, זנים אחרים עשויים להיות תואמים
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	ThermoFisher	20490	חומר הפחתה התואם לכמה צימודים תגובתיים של סולפידריל
ספקטרופוטומטר UV-Vis	Implen	NP80	מדוד את ריכוז החלבון.
אמבט מים, בקרת טמפרטורה	ThermoFisher	FSGPD25	להלם חום שלב של טרנספורמציה חיידקית
תמצית שמרים	Sigma Aldrich	Y1625	להשלמת מדיה M9 במידת הצורך