אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

סיכום

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

תקציר

כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה.

תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה.

אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.

מבוא

התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים¹. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת². תוכנה אוטומטית מציעה פוטנציאל מרגש לעקוף את כל הבעיות הללו על ידי הבחנה מהירה ומדויקת של תאים מאובייקטים חיצוניים, כולל עצמים הרבה מעבר ליכולת האנושית לזיהוי מדויק, בהתבסס על קריטריוני זיהוי מוגדרים היטב המפחיתים את ההשפעה של הטיית החוקרים. טכניקות נפוצות לזיהוי תאים באמצעות תוכנה אוטומטית כוללות שתי שיטות עיקריות: פילוח וסף³. בהמשך אנו מדגימים פרוטוקול מבוסס-שטח הניתן להכללה, המאפשר ספירת תאים מהירה, מדויקת וזולה במסגרת תוכנה נגישה באופן נרחב.

טכניקות סגמנטציה, כגון זיהוי קצה, מבקשות לבודד תאים בודדים על ידי שימוש בהבדלי עוצמה בתוך התמונה. שינויי עוצמה המבדילים תא משאר התמונה מורכבים לרוב משינויים חדים בבהירות⁴. זיהוי קצה כולל שלב סינון רגולרי, ואחריו שלב הבחנה שבו מתגלים שינויי עוצמה. תהליך ההתמיינות מזהה קצוות וקווי מתאר בתוך התמונה של שינויים בעוצמה גבוהה, וקצוות וקווי מתאר אלה מתואמים עם נוכחות התא. למרות שניתן להריץ תמונות עם רעש באמצעות אלגוריתמים המציינים⁴, טכניקות זיהוי קצה משמשות באופן אידיאלי לניתוח תמונות עם רעשי רקע נמוכים. התהליך מתפקד בצורה אופטימלית כאשר גבולות התא ניתנים להבחנה ברורה וקלה ואינם מונעים על ידי קווי מתאר של בהירות שאינם קשורים לנוכחות תאים, טשטוש תאים, עצמים חיצוניים או מבני תאים פנימיים מוגדרים ^1,2. אם תמונה רועשת במיוחד, ניתן להבחין עוד יותר בתאים באמצעות צביעה פלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים ^2,5. למרות שזה משפר באופן משמעותי את הדיוק של טכניקות סגמנטציה, זה דורש עלויות נוספות והשקעות זמן נוספות כדי להכין תרביות תאים להדמיה.

טכניקות סף כוללות חלוקה של תמונה לשתי קטגוריות: החזית והרקע, כאשר התאים מוקצים לחזית³. טכניקות אלה משתמשות בשינויי צבע/ניגודיות כדי להגדיר את הגובה הנראה לעין של אובייקט; אובייקטים שהם באופן שגרתי 'גבוהים' יותר מהרקע ניתנים לזיהוי בקלות כתאים. שינוי קו פרשת המים פועל בדרך זו על ידי שיוך משטחים עם פיקסלים בהירים כחזית ואלה עם פיקסלים כהים כרקע ^6,7. באמצעות זיהוי מבוסס גובה, טכניקות סף יכולות להבחין באופן שגרתי בין רעש לאובייקטים רצויים, בתנאי שהם קיימים באותו מישור מוקד. בשילוב עם כימות מבוסס שטח, שינוי קו פרשת מים יכול לזהות במדויק קבוצות של עצמים בסביבות שבהן טכניקות סגמנטציה טיפוסיות כגון זיהוי קצה יהיו לא מדויקות.

טרנספורמציות של קו פרשת המים משולבות בדרך כלל עם טכניקות סגמנטציה כדי להכין תמונות לניתוח נקי יותר, והתוצאה היא דיוק גבוה יותר של ספירת תאים. עבור תהליך זה, שינוי קו פרשת המים משמש להדגשת אזורי עניין פוטנציאליים לפני הפילוח. התמרת קו פרשת המים מספקת יתרונות ייחודיים על-ידי זיהוי תאים בחזית התמונות, מה שיכול לשפר את הדיוק של ניתוח סגמנטציה על-ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות עבור תאים, כגון כתמי רקע לא אחידים. עם זאת, קשיים יכולים להתעורר כאשר מנסים להתאים תמונות מבוססות תאים לשינוי קו פרשת המים. תמונות עם צפיפות תאים גבוהה עלולות להיות נגועות בתת-סגידה, שבה אגרגטים של תאים מזוהים כקבוצה סינגולרית ולא כמרכיבים בודדים. נוכחות של רעש או שינויי עוצמה חדים יכולה גם לגרום לטענת יתר, שבה האלגוריתם מרחיב את התאים יתר על המידה, וכתוצאה מכך ספירת תאים מוגזמת ולא מדויקת⁸.

בהמשך, אנו מפרטים שיטה למזער את החסרונות העיקריים של התמרת קו פרשת המים על ידי שילוב רכיבים של ניתוח סף בתוך אלגוריתם כימות מבוסס שטח, כפי שמתואר באיור 1. יש לציין כי אלגוריתם זה יושם עם תוכנות קוד פתוח ו/או זמינות באופן נרחב, ויישום של מסגרת ספירת תאים זו התאפשר ללא ריאגנטים יקרים או טכניקות מורכבות להכנת תאים. מקרופאגים RAW264.7 שימשו להדגמת השיטה בשל תפקידם הקריטי בוויסות תחזוקת רקמות חיבור ותהליכי ריפוי פצעים⁹. בנוסף, פיברובלסטים NIH/3T3 נותחו בשל תפקידם המרכזי בתחזוקה ותיקון של רקמות. תאים פיברובלסטים מתקיימים לעתים קרובות יחד עם מקרופאגים ותומכים בהם, מה שיוצר את הצורך להבחין בין סוגי תאים מובחנים פנוטיפיים אלה במחקרי קוקולטורה.

ניתן לכמת את ספירת התאים מתמונות בעלות צפיפות תאים בת קיימא גבוהה (VCD) באופן אמין ויעיל על-ידי חישוב השטח המכוסה על-ידי התאים, והאזור הממוצע שתופס תא יחיד. השימוש בסף לעומת סגמנטציה לזיהוי תאים איפשר גם ניתוחים מורכבים יותר, כגון ניסויים שבהם נותחו סוגי תאים שונים בקוקולטורות במקביל. פיברובלסטים NIH/3T3, שלעתים קרובות נמצא כי הם מתמזגים עם מקרופאגים RAW264.7 בתוך אתר ריפוי פצעים, נמצאו כמיגדלים במישור מוקד שהיה נבדל ממישור המוקד של המקרופאגים¹⁰. בהתאם לכך, הופעלו מספר אלגוריתמי סף כדי להגדיר את הרקע והחזית בהתאם לסוג התא המנותח, מה שמאפשר ספירה מדויקת של שני סוגי תאים שונים בתוך אותה תמונה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים ורכישת תמונות

1. תרבית RAW264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל ליטר נתרן ביקרבונט ו-5 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.
   1. להדמיית מונוקולטורה, תרבית תאי RAW264.7 בצפיפות של 25,000 תאים/ס"מ² בבקבוקון תרבית תאים של 5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיום.
2. תאי NIH/3T3 בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין¹¹.
3. עבור הדמיית קוקולטורה, מקרופאגים RAW264.7 מתרבית ופיברובלסטים NIH/3T3 מתאחדים יחד ביחסים מגוונים, בצפיפות כוללת של 25,000 תאים/ס"מ². השתמשו במדיום קוקולטורה שהוא 1 חלק RAW264.7 בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל' נתרן ביקרבונט, ו-5 μM β-מרקפטואתנול) ו-1 חלק NIH/3T3 בינוני (DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
4. לאחר הזריעה, הדגירה של תאים בטמפרטורה של 37 °C (87 °C) ו-5% CO₂ כדי להגיע לצפיפות תאים בת קיימא של 80% מפגש תאים.
5. תאי תמונה עם מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של פי 40. רכוש את כל התמונות בגווני אפור וייצא אותן בקובץ '.czi' הגולמי.
   1. קבע את יכולת האלגוריתם להעריך במדויק תמונות עם מגוון איכויות תמונה. רכשו תמונות עם מוקדים משתנים, והפיקו גם תמונות 'לא בולבוסיות' (איור 2) וגם תמונות 'בולבוסיות' (איור 3).
   2. ייצא והמר תמונות תאים לתבנית התמונה tiff (.tiff) של 8 סיביות באמצעות ImageJ באמצעות הפונקציה 'המרת אצווה' בקבצי '.czi' הגולמיים לפני ניתוח MATLAB. אחסן תמונות שהומרו בתיקיה מקומית והעבר באופן ידני קבצי תמונה אלה לסל MATLAB הרלוונטי.

2. ניתוח תמונה-מונוקולטורה תוך שימוש בקובץ "מונוקולטורה.m" בעיקר

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות MATLAB. שלושה קבצים שימשו לפרוטוקול MATLAB: "תהליך.m" (קובץ קידוד משלים 1), הקובץ המכיל את האלגוריתם, "מונוקולטורה.m" (קובץ קידוד משלים 2), הקובץ שירוץ לניתוח תמונות מונוקולטורה, ו"coculture_modified.m" (קובץ קידוד משלים 3), הקובץ שירוץ לניתוח תמונות קוקולטורה.

1. השתמש בשיטה מבוססת האזור כדי לקבל תמונות של תאים המציגים שינויי גובה יחסיים. פלט התמונה עבור כל תת-שלב על-ידי שימוש בפונקציה 'imshow()' עבור כל תת-אימג'. העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ בפקודה הבאה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.
   imread('filename.tiff')
   1. נתחו תמונות על ידי 'פתיחה על ידי שחזור' ולאחר מכן 'סגירה על ידי שחזור' באמצעות פונקציות מקור⁸ כדי להגדיל את החזית מהרקע. השתמש בפקודה הראשונה לפתיחה על ידי שחזור וברצף השני והשלישי כדי לסגור על ידי שחזור
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. הפכו את התמונות המשוחזרות לפיקסלים בשחור טהור וללבן טהור תוך שימוש במערכת זיהוי מבוססת אחוזונים. שים לב שהתאים מומרים לערך פיקסלים לבן טהור של '255' במערכת זו, בעוד שרקע ואובייקטים חיצוניים (שאינם תאיים) מומרים לערך פיקסלים שחורים טהור של '0'.
   1. הבחין בין תאים לרקע על-ידי שימוש בהפרש אחוזונים מ'הפיקסל הרלוונטי המרבי', ערך הפיקסל הגדול ביותר המהווה לפחות 0.5% מתמונה נתונה.
   2. נתח והערך את ערכי הפיקסלים עבור מקרופאגים RAW264.7. אם ערכים אלה נמצאים בטווח של 4.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי, סמן את הפיקסל כסלולרי.
      הערה: ניתן להנפיק פקודה זו באמצעות משפט if פשוט.
   3. עבור תמונות המכילות פרופילים של תאים בולבוסיים, כמו אלה שנראו באיור 2, יש ליישם הליך איטרטיבי לתיקון עבור בינאריזציה שגויה במרכזי התאים (המכונים 'איים', ראו להלן), כדלקמן.
   4. קבע ניחוש ראשוני לכיסוי התא הכולל; 60% נוצלו למחקר זה. שים לב שמספר התאים הנמצאים בתמונה צריך להיות תלוי בכיסוי התא - לפיכך ניתן לקבוע את הקשר בין מספר התא לכיסוי התא באופן ניסיוני. באמצעות קשר זה, קבע את המשתנים 'אלפא' ו'קאפה'.
      הערה: 'אלפא' מייצג וקטור 3 על 1 המכיל את אחוזוני הגובה היחסיים הבאים: אחוזון הגובה שבו זוהו התאים, אחוזון הגובה שבו זוהה הרקע ואחוזון הגובה שבו שוכנים בדרך כלל איים-אזורים שבהם ערכי העוצמה היו נמוכים משמעותית מערכי התאים. 'קאפה' מייצג את השטח הכולל המכוסה על ידי תאים בתמונה.
   5. הפעל את האלגוריתם, אשר (1) ינתח תמונות באמצעות הערכות ראשוניות של אלפא וקפה כדי למלא חלק מהאיים, ו-(ii) ישתמש בספירת התאים הפוסטאנליזה ובכיסוי כדי לחשב מחדש את הקאפה. אם ערך הקאפה נמצא בטווח של 10% מהניחוש הראשוני, המשך לשלב הבא.
      הערה: עבור תמונות המכילות תאי RAW264.7 ו-NIH/3T3, נמצא כי אלפא הוא [4.3, 5.5, 10]. במילים אחרות, הבדל של 4.3% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו זוהו התאים, הבדל של 5.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו זוהה הרקע. הבדל של 10% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו שוכנים בדרך כלל האיים.
3. לאחר בינאריזציה של התמונה, קבע את שטח התא הממוצע באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם חיפוש המעגלים בקוד פתוח, המבצע התמרת Hough בתמונה הבינארית 12,13,14. השתמש בפקודה הבאה כדי לקבל וקטור של כל מיקומי המרכז ורדי של עיגולים שנמצאים בתוך התמונה.
   '[מרכזים, רדי] = אימפינדריקל(A, [minradius, maxradius])'
   'A' בפקודה זו היא התמונה הנבחרת, ו[minradius, maxradius] הוא טווח הרדיאלי שהאלגוריתם ינסה לזהות.
   הערה: הליך זה לקביעת שטח התא הממוצע מניח שהמורפולוגיה של תאי המקרופאג' הייתה גם מעגלית וגם עקבית בין תאים¹⁰. מנתונים ניסיוניים, הרדידי של המקרופאגים נצפים בשכיחות הגבוהה ביותר בין 30 ל-50 פיקסלים בהגדלה של פי 40. טווח פיקסלים זה מוגדר כטווח המקובל עבור אלגוריתם מציאת המעגלים. הרדידי עשוי להיות שונה באופן משמעותי עבור סוגי תאים אחרים וידרוש נחישות באמצעות ניתוח ניסיוני.
   1. השתמש ביציאות הרדיאלי כדי לחשב את שטח התא הממוצע לפי ממוצע. נתחו לפחות 10 תאים כדי להבטיח זיהוי מדויק של האזור.
4. קבע את המספר הכולל של התאים בתוך התמונה באמצעות שטח התא הממוצע.
   1. לולאה דרך מטריצת התמונה וספור את המספר הכולל של פיקסלי התא. קבע את כיסוי התא הכולל על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים של התא במספר הפיקסלים הכולל בתוך התמונה. קבע את המספר הכולל של התאים בתוך התמונה על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים של התא בשטח הממוצע של התא.

3. ניתוח תמונה-קוקולטורה תוך שימוש בקובץ "coculture_modified.m" בעיקר

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות MATLAB.

1. השתמש בשיטה מבוססת האזור כדי לקבל תמונות של תאים המציגים שינויי גובה יחסיים. פלט התמונה עבור כל תת-שלב על-ידי שימוש בפונקציה 'imshow()' עבור כל תת-אימג'. העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ בפקודה הבאה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.
   'imread('filename.tiff')'
   1. נתחו תמונות על ידי 'פתיחה על ידי שחזור' ולאחר מכן 'סגירה על ידי שחזור' באמצעות פונקציות מקור¹⁰ כדי להגדיל את החזית מהרקע. השתמש בפקודה הראשונה לפתיחה על ידי שחזור וברצף השני והשלישי כדי לסגור על ידי שחזור.
      'אימופן ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. בצע ניתוח של קוקולטורות המכילות תאי RAW264.7 ו- NIH/3T3 באמצעות שתי בינאריזציות סלקטיביות, המתקבלות על ידי ניצול הפרשי הגובה בין שני סוגי התאים.
   1. קבעו בניסוי פרמטר 'phi' באמצעות תמונות של תאי RAW264.7 ו-NIH/3T3, כאשר phi מייצג את הפרש הגובה היחסי בין שני סוגי התאים. נחשו ערך phi ראשוני והתחדשו עד שספירת התאים והכיסוי תואמים באופן הדוק לספירות ידניות, ספציפיות לקוקולטורה RAW264.7 ו-NIH/3T3.
      הערה: הערך עבור phi המשמש במחקרים אלה נמצא כ-3.2. Phi משמש לסינון סלקטיבי של תמונה כך שתופיע כמכילה רק תאי RAW264.7, כפי שניתן לראות באיור 4C.
   2. קבע את ספירת התאים של RAW264.7 ואת כיסוי התאים הכולל באופן דומה לזה של תמונות מונוקולטורה.
3. נתחו שוב את התמונה שעברה שינוי קו פרשת המים ללא הפרמטר phi, וזיהו גם מקרופאגים וגם פיברובלסטים. רכוש נתונים פיברובלסטים של NIH/3T3 על-ידי חיסור סלקטיבי של פיקסלים של תאי RAW264.7, המתקבלים באמצעות שיטות הסף והכימות מבוססות השטח הסטנדרטיות המתוארות בשלב 2.
   1. לאחר שהתמונה כולה נותחה, קבע את המספר הכולל של פיקסלי NIH/3T3 על-ידי הפחתת המספר הכולל של פיקסלי התא ממספר הפיקסלים של RAW264.7. חשב את הכיסוי של תאי NIH/3T3 ו-RAW264.7 על-ידי חלוקה במספר הפיקסלים התאיים עבור כל שורת תא במספר הכולל של פיקסלי התמונה.

תוצאות

ניתוח של מקרופאגים RAW264.7 שאינם בולבוסיים נערך במסגרת מונוקולטורה של 25,000 תאים/ס"מ². תמונות מייצגות צולמו של תרבית התאים ועובדו ב- MATLAB לאחר המרה ל- tiff של 8 סיביות ב- ImageJ. פלטי האלגוריתם לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 2 עבור התמונה המייצגת. בתמונה זו, האלגוריתם ספר 226 תאים, וספירת תמונות זו אומתה על ידי השוואה לספירה ידנית שזיהתה 241 תאים (שגיאה של 6.2%). פלטי האלגוריתם עבור לפחות 10 תמונות של ספירת תאים RAW264.7 היו בעלי שגיאה ממוצעת של 4.5 ±-1.9%.

דיון

תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למיותר, שכן הפרמטרים היחסיים היו קבועים עבור סוג התא והפרמטר הנתון, ולא היה צורך להזין רמות בהירות/ניגודיות מוחלטות עבור כל תמונה. יתר על כן, השימוש במערכת מבוססת אחוזונים איפשר ניתוח של סוגי תאים מרובים בתוך אותה תמונה, בתנאי שסוגי התאים ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Axio Observer 7 מיקרוסקופ הפוך	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
מגרדי תאים	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
14190144 PBS Fisher Scientific של Dublecco
MATLAB תוכנה	MathWorks	2021A
תאי NIH/3T3	ATCC	ATCC CRL - 1658
פניצילין– סטרפטומיצין	סיגמא אולדריץ'	P4333-20 מ"ל
RAW264.7 תאים	ATCC	ATCC TIB - 71
נתרן ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	S6014-25G
T75 בקבוק תרבית תאים		CLS3814-24EA