אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה.
תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה.
אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.
מבוא
התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים1. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת2. תו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבית תאים ורכישת תמונות
- תרבית RAW264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל ליטר נתרן ביקרבונט ו-5 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.
- להדמיית מונוקולטורה, תרבית תאי RAW264.7 בצפיפות של 25,000 תאים/ס"מ2 בבקבוקון תרבית תאים של 5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיום.
- תאי NIH/3T3 בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין11.
- עבור הדמיית קוקולטורה, מקרופאגים RAW264.7 מתרבית ופיברובלסטים NIH/3T3 מתאחדים יחד בי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתוח של מקרופאגים RAW264.7 שאינם בולבוסיים נערך במסגרת מונוקולטורה של 25,000 תאים/ס"מ2. תמונות מייצגות צולמו של תרבית התאים ועובדו ב- MATLAB לאחר המרה ל- tiff של 8 סיביות ב- ImageJ. פלטי האלגוריתם לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 2 עבור התמונה המייצגת. בתמונה זו, האלגוריתם ספר 226 תאים, וספירת תמונות זו אומתה על ידי השוואה לספירה ידנית שזיהתה 241 תאים (שגיאה של 6.2%). פלטי האלגוריתם עבור לפחות 10 תמונות של ספירת תאים RAW264.7 היו בעלי שגיאה ממוצעת של 4.5 ±-1.9%.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למיותר, שכן הפרמטרים היחסיים היו קבועים עבור סוג התא והפרמטר הנתון, ולא היה צורך להזין רמות בהירות/ניגודיות מוחלטות עבור כל תמונה. יתר על כן, השימוש במערכת מבוססת אחוזונים איפשר ניתוח של סוגי תאים מרובים בתוך אותה תמונה, בתנאי שסוגי התאים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AR067247) ובחלקה על ידי תוכנית INBRE של דלאוור, הנתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים - NIGMS (P20 GM103446) מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור. תוכן כתב היד אינו משקף בהכרח את דעותיהם של הגורמים המממנים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Axio Observer 7 מיקרוסקופ הפוך | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| מגרדי תאים | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| 14190144 PBS Fisher Scientific של Dublecco | |||
| MATLAB תוכנה | MathWorks | 2021A | |
| תאי NIH/3T3 | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| פניצילין– סטרפטומיצין | סיגמא אולדריץ' | P4333-20 מ"ל | |
| RAW264.7 תאים | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא אולדריץ' | S6014-25G | |
| T75 בקבוק תרבית תאים | CLS3814-24EA |
מקורות
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
