אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

Summary

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

Abstract

כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה.

תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה.

אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.

Introduction

התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים¹. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת². תו....

Protocol

1. תרבית תאים ורכישת תמונות

1. תרבית RAW264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל ליטר נתרן ביקרבונט ו-5 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.
   1. להדמיית מונוקולטורה, תרבית תאי RAW264.7 בצפיפות של 25,000 תאים/ס"מ² בבקבוקון תרבית תאים של 5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיום.
2. תאי NIH/3T3 בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין¹¹.
3. עבור הדמיית קוקולטורה, מקרופאגים RAW264.7 מתרבית ופיברובלסטים NIH/3T3 מתאחדים יחד בי....

Results

ניתוח של מקרופאגים RAW264.7 שאינם בולבוסיים נערך במסגרת מונוקולטורה של 25,000 תאים/ס"מ². תמונות מייצגות צולמו של תרבית התאים ועובדו ב- MATLAB לאחר המרה ל- tiff של 8 סיביות ב- ImageJ. פלטי האלגוריתם לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 2 עבור התמונה המייצגת. בתמונה זו, האלגוריתם ספר 226 תאים, וספירת תמונות זו אומתה על ידי השוואה לספירה ידנית שזיהתה 241 תאים (שגיאה של 6.2%). פלטי האלגוריתם עבור לפחות 10 תמונות של ספירת תאים RAW264.7 היו בעלי שגיאה ממוצעת של 4.5 ±-1.9%.

Discussion

תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למיותר, שכן הפרמטרים היחסיים היו קבועים עבור סוג התא והפרמטר הנתון, ולא היה צורך להזין רמות בהירות/ניגודיות מוחלטות עבור כל תמונה. יתר על כן, השימוש במערכת מבוססת אחוזונים איפשר ניתוח של סוגי תאים מרובים בתוך אותה תמונה, בתנאי שסוגי התאים .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 מיקרוסקופ הפוך	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
מגרדי תאים	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
14190144 PBS Fisher Scientific של Dublecco
MATLAB תוכנה	MathWorks	2021A
תאי NIH/3T3	ATCC	ATCC CRL - 1658
פניצילין– סטרפטומיצין	סיגמא אולדריץ'	P4333-20 מ"ל
RAW264.7 תאים	ATCC	ATCC TIB - 71
נתרן ביקרבונט	סיגמא אולדריץ'	S6014-25G
T75 בקבוק תרבית תאים		CLS3814-24EA