מאמר שיטה

שיפור רבייה כדי לענות על מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 הנחיות בניתוח מעקב חלקיקים

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63059

⸱

17 בנובמבר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

במאמר זה

סיכום

ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) היא שיטה נפוצה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות. מאמר זה מדגיש פרמטרים ובקרות ניסיוניים של NTA בתוספת שיטה אחידה של ניתוח ואפיון של דגימות ודילולים הדרושים כדי להשלים את ההנחיות המוצעות על ידי MISEV2018 ו- EV-TRACK לשחזור בין מעבדות.

תקציר

ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) היה אחד מכמה שיטות אפיון המשמשות למחקר שלפוחית חוץ תאית (EV) מאז 2006. רבים סבורים כי מכשירי NTA וחבילות התוכנה שלהם יכולים להיות מנוצלים בקלות לאחר אימון מינימלי וכי כיול גודל הוא אפשרי בתוך הבית. כמו רכישת NTA וניתוח תוכנה מהווים אפיון EV, הם מטופלים במידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ תאיות 2018 (MISEV2018). בנוסף, הם כבר במעקב על ידי דיווח שקוף וריכוז ידע במחקר שלפוחית חוץ תאית (EV-TRACK) כדי לשפר את החוסן של ניסויי EV (למשל, למזער וריאציה ניסיונית עקב גורמים בלתי מבוקרים).

למרות המאמצים לעודד דיווח על שיטות ובקרות, מאמרי מחקר רבים שפורסמו אינם מדווחים על הגדרות קריטיות הדרושות לשחזור התצפיות המקוריות של נת"ע. מאמרים מעטים מדווחים על אפיון NTA של פקדים שליליים או דילול, ככל הנראה בהנחה כי מוצרים זמינים מסחרית, כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט או מים מזוקקים אולטרה-פור, הם ללא חלקיקים. באופן דומה, פקדים חיוביים או תקני גודל מדווחים רק לעתים רחוקות על ידי חוקרים כדי לאמת את גודל החלקיקים. משוואת סטוקס-איינשטיין משלבת צמיגות מדגם ומשתני טמפרטורה כדי לקבוע תזוזת חלקיקים. דיווח על טמפרטורת תא הלייזר היציבה במהלך כל איסוף הווידאו לדוגמה הוא, אם כן, אמצעי בקרה חיוני לשכפול מדויק. הסינון של דגימות או דילולים גם אינו מדווח באופן שגרתי, ואם כן, הפרטים של המסנן (יצרן, חומר ממברנה, גודל נקבוביות) ותנאי אחסון כלולים לעתים רחוקות. הסטנדרטים המינימליים של האגודה הבינלאומית לשלפוחית חוץ-תאית (ISEV) של פירוט ניסיוני מקובל צריכים לכלול פרוטוקול NTA מתועד היטב לאפיון של רכבים חשמליים. הניסוי הבא מספק ראיות לכך שפרוטוקול ניתוח NTA צריך להיקבע על ידי החוקר הבודד ולהיכלל בשיטות הפרסומים המשתמשים באפיון נת"ע כאחת האפשרויות למילוי דרישות MISEV2018 לאפיון שלפוחית יחיד.

מבוא

ניתוח מדויק וחוזר על עצמו של רכבים חשמליים וחלקיקים אחרים בקנה מידה של ננומטר מציב אתגרים רבים במחקר ובתעשייה. שכפול של מחקר EV היה קשה, בין היתר, בשל חוסר אחידות בדיווח על הפרמטרים הדרושים הקשורים לאיסוף נתונים. כדי לטפל בליקויים אלה, ISEV הציע הנחיות תעשייה כמערכת מינימלית של סטנדרטים ביוכימיים, ביופיזיים ותפקודיים לחוקרי EV ופרסם אותם כהצהרת עמדה, המכונה בדרך כלל MISEV20141. הקצב המואץ של מחקר EV דרש הנחיה מעודכנת, ואת "MISEV2018: הצהרת עמדה של ISEV" הרחיב את הנחיות MISEV20142. נייר MISEV2018 כלל טבלאות, קווי מתאר של פרוטוקולים מוצעים וצעדים שיש לבצע כדי לתעד אפיון ספציפי הקשור לרכב חשמלי. כאמצעי נוסף להקלה על פרשנות ושכפול של ניסויים, EV-TRACK פותחה כבסיס ידע מיקור המונים (http://evtrack.org) כדי לאפשר דיווח שקוף יותר של ביולוגיה של EV והמתודולוגיה המשמשת לתוצאותשפורסמו 3. למרות המלצות אלה לדיווח סטנדרטי של שיטות, התחום ממשיך לסבול משכפול ואישור תוצאות שפורסמו.

בהתאם למאמץ של המכונים הלאומיים לבריאות והקרן הלאומית למדע עבור כלי הערכת איכות, מאמר זה מציע כי ISEV דורש דיווח סטנדרטי של שיטות ופרטים, כך שכלי הערכת נתונים עשויים להיות מיושמים במטרה לשכפל תוצאות בין מעבדות. דיווח על מקורות תאים, נהלי תרבית תאים ושיטות בידוד EV הם גורמים חשובים להגדרת התכונות של אוכלוסיית הרכב החשמלי. בין מכשירי NTA, גורמים כגון הגדרות זיהוי, מדד השבירה של נוזל נשא, אוכלוסיות חלקיקים הטרוגניות התורמות לפולידיספרסיביות, היעדר דרישות דיווח סטנדרטיות ותוצאות מדידה פנים-צופיות נעדרות הופכות את השוואת NTA בין מעבדות לקשה או בלתי אפשרית.

בשימוש מאז 2006, NTA היא שיטה פופולרית עבור גודל חלקיקים וקביעת ריכוז המשמש כיום על ידי כ 80% של חוקרי EV4. הנחיות MISEV2018 דורשות שתי צורות של ניתוח שלפוחית אחת, אשר NTA היא אחת האפשרויות הפופולריות. נת"ע ממשיכה להיות בשימוש נפוץ לאפיון EV בשל הנגישות הרחבה שלה, עלות נמוכה לדגימה, ותורת המייסדים הפשוטה שלה (משוואת סטוקס-איינשטיין). הערכת EV על ידי NTA מייצרת התפלגות גודל חלקיקים והערכת ריכוז באמצעות פיזור אור לייזר וניתוח תנועה בראונית, כאשר הגבול התחתון של הזיהוי נקבע על ידי מדד השבירה של הרכב החשמלי. בעת שימוש בדגימת נוזלים של צמיגות וטמפרטורה ידועות, המסלולים של הרכבים החשמליים נמצאים במעקב כדי לקבוע את תזוזתם הממוצעת בריבוע בשני ממדים. זה מאפשר את מקדם פיזור החלקיקים להיות מחושב ומומר לקוטר הידרודינמי שווה ערך לכדור על ידי משוואת סטוקס-איינשטיין שונה 5,6,7. ניתוח חלקיקים לחלקיקים של NTA יש פחות הפרעות על ידי agglomerates או חלקיקים גדולים יותר באוכלוסייה הטרוגנית של רכבים חשמליים מאשר שיטות אחרות של אפיון7. בעוד כמה חלקיקים גדולים יותר יש השפעה מינימלית על דיוק גודל, נוכחות של כמויות דקות אפילו של חלקיקים גדולים, פיזור אור גבוה גורם לירידה ניכרת בזיהוי של חלקיקים קטנים יותר עקב זיהוי EV תוכנה מופחתת ומעקב8. כטכניקת מדידה, NTA נחשב בדרך כלל לא מוטה כלפי חלקיקים גדולים יותר או אגרגטים של חלקיקים, אבל יכול לפתור אוכלוסיות מרובות גודל באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים9. בגלל השימוש בפיזור אור על ידי חלקיקים, אחת המגבלות של ניתוח NTA היא שכל חלקיק כגון אבק, פלסטיק, או אבקה עם תכונות שבירה וגודל דומות בהשוואה לרכבים חשמליים לא ניתן להבדיל מרכבים חשמליים בפועל בשיטה זו של אפיון.

NanoSight LM10 (מנתח גודל ננו-חלקיקים) ו- LM14 (מודול לייזר) נמכרו מאז 2006, ולמרות שדגמים חדשים יותר של מכשיר זה פותחו, דגם מסוים זה נמצא במתקני ליבה רבים ונחשב לסוס עבודה אמין. יש צורך בהכשרה כדי לייעל כראוי את הגדרות ה- NTA למדידות ברזולוציה גבוהה של גודל וריכוז. שתי ההגדרות החשובות הדרושות להקלטות וידאו אופטימליות הן (1) רמת המצלמה ו- (2) סף האיתור. אלה חייבים להיות מוגדרים על ידי האופרטור בהתבסס על מאפייני המדגם. אחד האילוצים העיקריים של ניתוח NTA הוא ההמלצה של ריכוזי מדגם בין 107 ו 109 חלקיקים / מ"ל, כדי להשיג דילול מדגם זה עשוי להידרש10. פתרונות המשמשים לדילול, כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט, תמיסת מלח 0.15 M, או מים אולטרה-פור, הם לעתים רחוקות ללא חלקיקים פחות מ 220 מיקרומטר בגודל, אשר עשוי להשפיע על מדידות NTA. אפיון נת"ע של הפתרונות המשמשים לדילול צריך להתבצע באותה רמת מצלמה וסף זיהוי כמו דגימות ננו-חלקיקים המנותחות. הגודל והריכוז של חלקיקים הנמצאים בדילולים המשמשים לדילול מדגם EV נכללים לעתים רחוקות בפרסומים הכוללים ניתוח NTA של רכבים חשמליים.

פרוטוקול זה משתמש בניתוח NTA של ליפוזומים סינתטיים דמויי EV המוערך באמצעות רמות מצלמה נבחרות, סף זיהוי וסינון מכני של הדגימות כדי לנתח את ההשפעות השיטתיות של רמת המצלמה, סף הזיהוי או סינון מדגם בערכת הנתונים של NTA. ליפוזומים היו מסונתזים כמתואר בקובץ משלים S1. ליפוזומים סינתטיים שימשו בניסוי זה בגלל אחידות הגודל שלהם, מאפיינים פיזיים, ויציבות באחסון ב 4 °C (60 °F). למרות שניתן היה להשתמש בדגימות בפועל של רכבים חשמליים, ההטרוגניות והיציבות של כלי רכב חשמליים במהלך האחסון עשויות לסבך את המחקר הזה ואת הפרשנות שלו. קווי דמיון בדו"חות נת"ע מ-(A) ליפוזומים ו-(B) רכבים חשמליים מצביעים על כך שההשפעות השיטתיות שיחשפו לליפוזומים במאמר זה יחולו ככל הנראה גם על אפיון רכב חשמלי (איור 1). יחד, ממצאים אלה תומכים ברעיון שדיווח מלא של הגדרות תוכנה קריטיות ותיאור עיבוד מדגמי, כגון דילול, דילול וסינון, משפיעים על יכולת השחזור של נתוני NTA.

מטרת מאמר זה היא להדגים כי הושגו שינויים בהגדרות נת"ע (טמפרטורה, רמת מצלמה וסף איתור) והכנת מדגם לשינויים בתוצאות שנאספו: התקבלו הבדלים שיטתיים ומשמעותיים בגודל ובריכוז. כמו NTA היא אחת האפשרויות הפופולריות כדי למלא את מפרט האפיון MISEV2018, תוצאות אלה ממחישות את החשיבות של דיווח הכנת מדגם והגדרות NTA כדי להבטיח רבייה.

figure-introduction-1
איור 1: נציג NTA מדווח על השוואת ליפוזומים לרכבים חשמליים. (א) ליפוזומים: מדגם לא מסונן המאופיין ב- NTA ב- 12 במרץ 2020. (ב) רכבים חשמליים: מדגם לא מסונן המאופיין ב- NTA ב- 26 באוגוסט 2021. קיצורים: NTA = ניתוח מעקב אחר חלקיקים; רכבים חשמליים = שלפוחיות חוץ-תאיות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הנחיות כלליות לפרוטוקול

  1. שמור על המיקרוסקופ על שולחן אוויר או לכל הפחות על שולחן ללא רטט. ודא כי תנודות חיצוניות (למשל, הקשה ברגל על הרצפה, נגיעה בשולחן, סגירת דלתות, תנועת מעבדה) נשמרות למינימום.
  2. הגדר ושמור על הטמפרטורה של מודול הלייזר בטמפרטורה קבועה עבור כל הקלטות הווידאו.
    הערה: הטמפרטורה שנבחרה הייתה 25 °C (50 °F) מכיוון שניתח גודל הננו-חלקיקים היה מכויל בטמפרטורה זו. לכן, חשוב שכל המשתמשים במכשיר יידעו וישתמשו בטמפרטורה המכוילת. טמפרטורת החדר אינה סביבה מקובלת מכיוון שהיא יכולה להשתנות.
  3. ודא כי כל הדילולים, הנקראים גם בקרות שליליות (למשל, תמיסת מלח חוצצת פוספט של Dulbecco (DPBS), מים מזוקקים אולטרה-פוריים [DW]), מאופיינים כולם ב- NTA באמצעות אותה רמת מצלמה וסף זיהוי כמו דגימות הננו-חלקיקים הנמדדות. השתמש DPBS מאופיין עבור שטיפה של מודול לייזר ודילול של דגימות. פקטור מזהמים בקרה שלילית DPBS לתוך תוצאות מדגם אם רמותיהם משמעותיות.
  4. לאחסן דגימות ב 4 °C (50 °F) לפני ההערכה ולעולם לא להקפיא אותם כמו זה היה משפיל את מדגם ליפוזום. דגימות חמות / סטנדרטים / דילול לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפני הניתוח.
    הערה: טיפול מדגמי היה ספציפי לחומר הנבדק.
  5. הערך מדגם וסטנדרטים באמצעות מדידה מהירה כדי ליצור דילול מתאים כדי לקבל 107 עד 109 חלקיקים / מ"ל (כ 50 עד 100 חלקיקים / מסך וידאו NTA) נקבע להיות אופטימלי עבור ניתוחי NTA.
    הערה: המחברים מצאו כי ריכוזי חלקיקים בקצה העליון של טווח זה לייצר תוצאות עקביות יותר לשחזור.
  6. מלא את כל השדות הישימים בתיבה לכידה של הכרטיסיה SOP עבור מדידות מהירות וסטנדרטיות, כולל הדילול והדילול המשמשים.

2. הכנת תקני כיול בגודל 50 ננומטר ו-100 ננומטר

הערה: עיין בטבלת החומרים.

  1. תקני העברה בגודל 50 ננומטר מדוללים 1:5,000
    1. הוסף 2 μL של תקני 50 ננומטר ל 9,998 μL של 0.22 מיקרומטר מסונן 10 מ"מ אשלגן כלורי (KCl)/0.03% Tween 20 ב- DW אולטרה-פורר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל שטוף פעמיים. יש לאחסן את תקן 50 ננומטר המדולל בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך עד שנה.
  2. 100 ננומטר גודל תקני העברה מדוללים 1:333
    1. הוסף 30 μL של תקני 100 ננומטר ל 9,970 μL של 0.22 מיקרומטר מסונן 10 mM KCl / 0.03% Tween 20 ב- DW אולטרה-פורר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל שטוף פעמיים. יש לאחסן את תקן 100 ננומטר המדולל בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך עד שנה.

3. ניקוי והרכבה של מודול הלייזר

  1. בדוק באופן חזותי את מודול הלייזר ואת חלונות הכיסוי של תאי הזרימה לאיתור שריטות או פגמים.
    הערה: אם אחד ממשטחי הזכוכית שרוט, ההדמיה עשויה להיות מושפעת.
  2. נקו את שני משטחי הזכוכית בעדינות עם מנקה עדשות באיכות טובה ונייר עדשה. אין להשתמש במגבוני רקמות או במגבות נייר על משטחי זכוכית.
  3. ודא כי חותם טבעת O יושב כראוי בחריץ של כיסוי תא הזרימה לפני ההרכבה.
  4. הנח את כיסוי תאי הזרימה על מודול הלייזר, והבטיח שהמגעים החשמליים נמצאים בכיוון הנכון. מניחים את 4 האגודלים הטעונים בקפיץ דרך צלחת תא הזרימה ומפעילים את החוטים של מודול הלייזר אך אינם מתהדקים בנפרד.
  5. בהורדת לחץ אחיד על כיסוי תאי הזרימה, הדקו באופן אחיד את האגודלים בצורה אלכסונית לסירוגין עד להתאמה. הדקו את האגודלים רק עד להדק את האצבעות. אל תגזים.
    הערה: הידוק לא אחיד של גלגלי האגודלים יכול לפצח את פני השטח של מודול הלייזר. אגודלים חדשים יותר יפתחו "למטה" בלחץ הנכון, תוך הימנעות מלחץ אפשרי.

4. הליך שטיפה עבור מודול הלייזר לפני ובין דגימות

  1. השתמש במיכל חדש שנפתח של DPBS ו aliquot לתוך צינורות פוליפרופילן 15 מ"ל שטוף משולש. ודא שמוצרים המשמשים לשטיפה או לדלל דגימות מאופיינים ב- NTA לפני השימוש (ראה שלב 1.3).
  2. יש לשטוף שני מזרקי שחפת 1 מ"ל עם מתאמי נעילת החלקה 3 פעמים עם מ"ל אחד של DPBS כדי להסיר שאריות חלקיקים. השתמש באחת היציאות כקלט אך השתמש בה באופן עקבי במהלך הניסוי. אין להשתמש במזרקים גדולים יותר בשל הסכנה של שבירת יציאות מזרק מהמשקל והגודל המוגברים של המזרק.
  3. הסר והשלך את הבוכנה ממזרק השחפתברחוב 1 והכנס אותו ליציאה הנותרת כדי לשמש כמאגר דילול / מדגם מבוטל.
    הערה: אי הסרת הבוכנה תגרום ללחץ מוגבר בתא המדגם ולדליפה סביב החותם.
  4. מלא את המזרקהשני ב- 1 מ"ל של DPBS וחבר אותו ליציאת הכניסה של כיסוי תא הזרימה.
  5. החזק את מודול הלייזר מוטה עם יציאת מזרק השקע מורמת כדי לאפשר לאוויר להיות מטוהר מהתא כמו DPBS מוזרק לאט לתוך מודול הלייזר.
  6. לשטוף את DPBS הנותרים ממודול הלייזר על ידי הזרקת 1 מ"ל של אוויר לתוך היציאה הנכנסת. חזור על השטיפה 2 פעמים נוספות.
  7. רוקן את מודול הלייזר לחלוטין ככל האפשר לאחר הסומק האחרון.
    הערה: שטיפה יסודית וזהירה נחוצה לאחר ניתוח NTA של תקן 50 ננומטר, שכן חלקיקים אלה נמשכים במודול הלייזר. מודול הלייזר מוכן כעת לשימוש.

5. מיקום מודול הלייזר על במת המיקרוסקופ

  1. אתר את קווי היישור של מודול הלייזר בזרוע המיקרוסקופ (איור 2) ויישר אותם באמצעות ידית המוקד.

figure-protocol-1
איור 2: מדריך יישור מיקוד מודול לייזר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. מול המיקרוסקופ, מניחים את מודול הלייזר בשלב החריץ ומחליקים אותו בעדינות ימינה ככל האפשר.
    הערה: אם נעשה בזהירות, היישור ואת נקודת המוקד יהיה קל יותר לאתר בין דוגמאות.
  2. הפעל את מתג הנדנדה בתיבת בקרת הלייזר.

6. מיקוד ומיקום של מודול הלייזר

הערה: זה חייב להתבצע עם נוזל בתא.

  1. טען את תוכנת NTA (ראה טבלת החומרים) משולחן העבודה.
    הערה: עלולה להופיע שגיאה, "טמפרטורה H/W לא נמצאה ב- COM3." כל שעליך לעשות הוא לסגור ולפתוח מחדש את התוכנה כדי לתקן אותה.
  2. לחץ על התחל מצלמה תחת הכרטיסיה לכידה בתיבה בפינה הימנית העליונה. אם המצלמה נכבית באופן אוטומטי לאחר 5 דקות, פשוט לחץ שוב על התחל מצלמה כדי להפעיל אותה מחדש.
  3. באותה כרטיסיה, התאם את רמת המצלמה ל - 14 עד 16 כדי להבהיר את קו הלייזר ולפשט את זיהוי החלקיקים ואת המיקוד.
  4. הסט את התמונה מהמצלמה אל העפעפיים על-ידי הזזת המחוון העליון בצד שמאל של כיסוי הראש פנימה או החוצה.
  5. מצא את האזור של צפיפות מוגברת, המכונה בדרך כלל טביעת האצבע. מרכז וממקד את טביעת האצבע אנכית בשדה הראייה.
    הערה: קו הלייזר יהיה משמאל לטביעת האצבע. החשכת החדר עשויה לסייע באיתור טביעת האצבע והתמקדות בקו הלייזר.
  6. מרכז את קו הלייזר בשדה הראייה; הזז את המחוון העליון כדי להסיט אור למצלמה כפי שנצפה על מסך המחשב.
    הערה: קו הלייזר הנראה כעת על המסך הוא תמונת מראה של תצוגת העפעפיים; שמאל בעיניים יהיה ממש על מסך המחשב.
  7. התאם את המוקד כדי לחדד את התמונה של חלקיקים נעים בודדים על המסך באמצעות ידית המיקוד.
    הערה: בשל עומק המיקוד, כל החלקיקים לא יהיו בפוקוס, וזה מקובל. אפילו חלקיקים שהם מעט מחוץ לפוקוס יילכדו על ידי המצלמה וינתחו על ידי התוכנה.

7. טעינת תקנים/דגימות/דילול לתוך מודול הלייזר לניתוח NTA

  1. צייר 1 מ"ל של רגיל / מדגם / מדלל לתוך מזרק שטוף 1 מ"ל טובעקולין ולחבר אותו ליציאת הכניסה של כיסוי תא הזרימה. מקדמים את הבוכנה עד שהנוזל ניכר במזרק הפתוח המחובר ליציאת המוצא.
  2. בתצוגת המצלמה, עבור מימין לקו הלייזר לאזור של מספר אחיד של חלקיקים. במידת הצורך, התאם את הכיוון האנכי כדי למרכז את רצועות האור האופקיות. פוקוס מחדש עד המספר הגבוה ביותר של חלקיקים הם בתצוגה. ודא כי עבור כל האמצעים הבאים, עמדה זו נשמרת קרוב ככל האפשר.
  3. כוונן את רמת המצלמה לנקודה שבה סמל המידע הכהה מהבהב לסירוגין לסירוגין בפינה השמאלית העליונה של תצוגת המצלמה.
    הערה: פעולה זו מסייעת להבטיח שבחירה עקבית ברמת המצלמה תיעשה ברמת הרגישות המינימלית עבור כל סדרת איסוף נתונים.
    הערה: אין אפשרות לשנות את רמת המצלמה במהלך הלכידה.

8. אימות כיול

הערה: מומלץ לאמת את כיול המודול באמצעות תקני גודל (ראה סעיף 2) לפני ניתוח מדגם. אימות שגרתי נחוץ כדי להבטיח מדידות מדויקות. במעבדה מרובת משתמשים, התאמות משתמש בודדות של הגדרות תצורת תוכנה עלולות לגרום בשוגג לאיסוף נתונים לא מדויק. עבור איסוף נתונים קריטיים, אימות יומי הוא עניין של תרגול מעבדה טוב. יש לכלול את יכולת הרבייה היומיומית של האימות בתוצאות המדווחות. בדרך כלל, הכיול מוגדר על-ידי הטכנאי ואינו ניתן לכוונון על-ידי המשתמש הבודד, אלא אם למשתמש יש גישה למנהל. פעולה זו מונעת קביעת תצורה מחדש לא מורשית על-ידי משתמשים בודדים.

  1. סטנדרטים מדוללים חמים (ראה סעיף 2) לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  2. מערבל בקצרה את הסטנדרטים ולאחר מכן לטעון כמתואר בסעיף 7.
  3. בצע NTA לדוגמה כמתואר בסעיף 10 וערכי רשומה עבור חישוב עוקב של מקדם הווריאציה, שאמור להיות קטן מ- 2% אם מכויל כראוי.

9. אופטימיזציה של ריכוז הדגימה עבור נת"ע

הערה: המסך צריך להכיל בין 50 ל-100 חלקיקים הניתנים למדידה כאשר רמת המצלמה וריכוז הדגימה מותאמים כראוי. אם יש שאלה אם למדגם יש מספר חלקיקים מתאים, ניתן להפעיל מדידה מהירה על המדגם בשלב זה (ראה שלבים 9.1 עד 9.7). הוא משמש להערכת מאפייני המדגם במהירות לפני לכידות וידאו ארוכות יותר. הכרטיסיה מדידה מהירה נמצאת בתוך הכרטיסיה SOP בתיבה האמצעית התחתונה.

  1. הגדר את משך הלכידה ל - 30 שניות.
  2. קבל את שם קובץ הבסיס הקיים או הזן שם קובץ חדש על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ... עבור אתר אחסון חדש עבור נתונים שנוצרו.
  3. סמן את התיבה עבור טמפרטורת היעד והזן את הטמפרטורה הרצויה.
  4. טען את הדגימה כפי שתואר קודם לכן (שלב 7.1) ולחץ על צור והפעל קובץ Script.
  5. המתן עד שמספר החלקיקים למסגרת יוצג בפינה השמאלית התחתונה של מסך הווידאו לאחר השלמת הווידאו 30 s. אם מספר החלקיקים גדול מ- 100, יש לשטוף את מודול הלייזר 3 פעמים (כפי שתואר בעבר בשלב 4.6).
  6. לדלל את המדגם לטווח הריכוז הרצוי באמצעות הדילול המאופיין.
  7. טען את הדגימה המדוללת כראוי לתוך מודול הלייזר הסמוק והפעל את המדידה המהירה כדי לוודא שהדגימה נמצאת בטווח המקובל.

10. מדגם נת"ע

הערה: הכרטיסיה מדידה רגילה נמצאת בתוך הכרטיסיה SOP בתיבה האמצעית התחתונה ומשמשת לניתוח מדגם שגרתי (ראה שלבים 10.1 עד 10.12).

  1. הגדר את משך הזמן ל - 30 או 60 שניות ואת מספר הסרטונים ל - 5.
  2. קבל את שם קובץ הבסיס הקיים או הזן שם קובץ חדש על-ידי לחיצה על הכרטיסיה ... עבור אתר אחסון חדש עבור נתונים שנוצרו.
  3. סמן את התיבה עבור טמפרטורת היעד והזן את הטמפרטורה הרצויה.
  4. לחץ על צור סקריפט כדי לעשות שימוש חוזר במדידה רגילה זו.
  5. לאחר שהדגימה נטענת כמתואר בסעיף 7 והניסוי מוכן להפעלה, לחץ על צור והפעל קובץ Script.
  6. מלא את השדות במסך המוקפץ הגדרת פרטי דוח עם מידע על האופרטור, תיאור לדוגמה, דילול הדגימה ודילול בשימוש.
    הערה: מידע זה יוקלט ויודפס בדו"ח הניסוי הסופי.
  7. לאחר מילוי כל השדות הרצויים, לחץ על אישור כדי לאתחל את קובץ ה- Script.
    הערה: אם נבחרה טמפרטורת היעד , התנור ייצב את הדגימה במודול הלייזר לטמפרטורה הרצויה למשך 5 שניות לפני שיאפשר לתסריט להמשיך במדידה. לוח האבחון בפינה הימנית התחתונה של המסך יקרא את HEATER ON ויציג את טמפרטורת המדגם.
  8. לפני כל לכידת וידאו, חפש הנחיה לקדם את הבוכנה באופן ידני. הזרק ~ 0.05 מ"ל של המדגם לתוך תא הלייזר ולאפשר לחלקיקים לבוא "מנוחה" (כלומר, לא זורם), ולאחר מכן לחץ על אישור.
  9. המתן לתיבת אישור הגדרות שתופיע עם השלמת לכידת הווידאו5th וכדי שהתיבה תהליך תהבהב. הגדר את סף הזיהוי לעיבוד הדגימה על-ידי ציון מספר הצלבים הכחולים המסמנים חלקיקים על המסך כאשר המסגרות מתקדמות באופן ידני מתחתית מסך הווידאו. אם יש יותר מ-3-4 צלבים כחולים המסמנים חלקיקים בכל מסך כאשר המסגרות מתקדמות, הגדל את סף הזיהוי.
    הערה: הצלבים הכחולים על החלקיקים הבודדים מקבילים לאפקט "נחיל" בציטומטריית הזרימה ויש למזער אותם לדיוק אופטימלי ולשחזור של איסוף נתונים.
  10. לחץ על הגדרות אישור כאשר סף האיתור מקובל.
  11. המתן לעיבוד אוטומטי של סרטוני הווידאו והיסטוגרמה של תוצאות והודעת תיבת דו-שיח על השלמה יוצגו לפני שתלחץ על אישור.
  12. לאחר הופעת התיבה הגדרות ייצוא , שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על ייצוא.
    הערה: כל התוצאות מסרטוני וידאו וניתוח יאוחסנו בקובץ היעד המוגדר בשלב 10.2. פעולה זו דורשת כמות גדולה של אחסון. נטר והעבר להתקן אחסון משני לפי הצורך.

11. ניתוח מחדש של הדגימה הנוכחית בספי איתור שונים

הערה: מיד לאחר ניתוח NTA (שלב 10), ניתן לנתח מחדש את הנתונים באמצעות הגדרות סף זיהוי שונות. עם זאת, אין אפשרות לשנות את רמת המצלמה לאחר הלכידה.

  1. סמן את כל חמשת סרטוני הלכידה המפורטים בניסוי הנוכחי.
  2. לחץ על עבד קבצים נבחרים והמתן להופעת התיבה אישור הגדרה ולתיבה תהליך כדי להבהב כדי לשנות את סף הזיהוי.
  3. התאם את סף הזיהוי לרמה הרצויה ולחץ על הגדרת אישור.
  4. המתן לעיבוד אוטומטי של סרטוני הווידאו והיסטוגרמה של תוצאות והודעת תיבת דו-שיח על השלמה יוצגו לפני שתלחץ על אישור.
  5. לחץ על ייצוא הגדרות. כאשר מתבצעות הערכות נוספות במדגם האחרון, הקפד ללחוץ על התיבה ייצוא תוצאות בניסוי הנוכחי מכיוון שהתיבה המוקפצת תוצאות ייצוא לא תוצג לאחר הניתוח מחדש לדוגמה.
    הערה: מכיוון שאין תזכורות לעשות זאת, ניתן להתעלם מכך בקלות, והניתוח יאבד. עם זאת, הנתונים הבסיסיים יישארו וניתן לנתח אותם מחדש מאוחר יותר.

12. ניתוח קבצים המאוחסנים בארכיון

הערה: אם ניסויים שניתחו בעבר לא נשמרו או שיש לבצע ניתוח נוסף בדגימות אלה, ניתן לטעון מחדש את הקבצים הבודדים לתוכנת NTA להערכות נוספות של סף האיתור . אין אפשרות לשנות שינויים ברמת המצלמה לאחר הלכידה.

  1. טען את תוכנת NTA משולחן העבודה.
  2. לחצו על הכרטיסייה 'ניתוח ' בחלונית האמצעית התחתונה.
  3. לחץ על פתח ניסוי ונווט אל קובץ ה- .nano הרצוי.
    הערה: קבצי הווידאו המשויכים לניסוי .nano שנבחר חייבים להיות באותה תיקיה כמו קובץ הניסוי הראשי; אחרת, תופיע שגיאה בעת ניסיון לעבד את הקבצים. 6 הספרות הראשונות של שם הקובץ הן התאריך שבו בוצע הניסוי (xx-xx-xx). 6 הספרות האחרונות של שם הקובץ הן הזמן שבו הווידאו הוקלט (xx-xx-xx) ומזהה הווידאו הבודד. קובץ PDF של כל ניסוי משולב מפרט את קבצי ה- .nano הכלולים לניתוח זה.
  4. לחץ על עבד קבצים נבחרים כדי להפעיל את הניתוח.
  5. לאחר שהתיבה תהליך מהבהבת כדי לאפשר שינויים בסף הזיהוי, הגדר את הסף לרמה הרצויה ולחץ על אישור.
  6. המתן לעיבוד אוטומטי של סרטוני הווידאו והיסטוגרמה של תוצאות והודעת תיבת דו-שיח על השלמה יוצגו לפני שתלחץ על אישור.
  7. לחץ על יצא תוצאות. הקפד ללחוץ על התיבה ייצוא תוצאות בניסוי הנוכחי, מכיוון שהתיבה המוקפצת תוצאות ייצוא לא תוצג לאחר הניתוח מחדש.
    הערה: מכיוון שאין תזכורות לעשות זאת, ניתן להתעלם מכך בקלות, והניתוח יאבד.

13. ניקוי ופירוק של מודול הלייזר

  1. כבה את תיבת בקרת הלייזר.
  2. לשטוף את הדגימה כולה ממודול הלייזר ולהשליך אותו כראוי.
  3. החזק את מודול הלייזר מוטה עם יציאת המזרק הפתוחה מוגבהת כדי לאפשר לטהר את האוויר מהתא כאשר ה- DPBS מוזרק לאט לתוך מודול הלייזר והוא נשטף מיציאת מזרק השקע.
  4. רוקן את ה- DPBS הנותרים ממודול הלייזר והשלך.
  5. חזור על השטיפה 2 פעמים נוספות ולרוקן את מודול הלייזר לחלוטין ככל האפשר לאחר הסומק האחרון.
  6. מורידים את הלחץ האחיד על כיסוי תאי הזרימה, משחררים באופן אחיד את האגודלים באופן אלכסוני לסירוגין עד להתנתקות מחוטים, מסירים את האגודלים ומאחסנים במקרה מודול הלייזר.
  7. הסר את כיסוי תא הזרימה ממודול הלייזר.
  8. נקו את שני משטחי הזכוכית בעדינות עם מנקה עדשות באיכות טובה ונייר עדשה. אין להשתמש בנייר טישו או במגבות נייר על משטחי זכוכית.
  9. בדוק באופן חזותי את מודול הלייזר ואת כיסוי תא הזרימה "חלונות" עבור שריטות או פגמים לאחר השימוש ולדווח למפקח.
  10. החלף את מודול הלייזר ואת כיסוי תאי הזרימה במקרים שלהם כדי למנוע נזק למשטחי זכוכית במהלך האחסון.

14. פרוטוקול ניתוח מדגמי

  1. דוגמאות לא מסוננות
    1. מערבולת את המדגם לפני טעינה ולהקליט 5 x 60 s קטעי וידאו ברמת מצלמה 12 ו סף זיהוי רמה 3 כמתואר לעיל. נתח מחדש סרטונים אלה באמצעות סף זיהוי 2 ו- 5.
    2. חזור על אוספי וידאו של אותה דגימה ברמות מצלמה 13 ו- 14 ורמת סף הזיהוי 3. נתח מחדש את שני הסרטונים הנוספים הללו באמצעות סף איתור 2 ו- 5. חזור על כל התהליך באמצעות סרטוני וידאו של 5 x 30 s בהגדרת SOP.
  2. דוגמאות מסוננות
    1. מערבולת את המדגם ולאחר מכן בו זמנית לטעון ולסנן אותו (מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר) ישירות לתוך מודול הלייזר.
      הערה: מסנן המזרק רוקן עם פי 2 מנפח השטח המת של המסנן לפני השימוש כדי להסיר חלקיקים מקומיים. מסנני המזרק (ראו טבלת החומרים) היו בעלי שטח מת מדוד של 0.5 מ"ל ושטומקו ב-1.0 מ"ל מהדגימה לפני המדידות. שים לב לסוג המסנן בשדות הנתונים של SOP . הדגימה המסוננת עובדה בדיוק כמתואר עבור דגימות לא מסוננות בשלב 14.1.

15. ניתוח סטטיסטי של תוצאות נת"ע

  1. לניתוח ההשפעות העיקריות או האינטראקציות, בצע ניתוח של שונות לאחר בדיקה של הנחות ANOVA (נורמליות, חדמודליות, הומוגניות של שונות). השתמש Kruskal-Wallis חד כיווני ANOVA על שורות במקרים של כישלון של הנחות ANOVA.
  2. בעקבות החזרה של השפעות עיקריות משמעותיות, השתמש בשיטה של Dunn כדי לבצע פירושו בדיקה עבור השוואות מראש. שקול p-ערך של 0.05 להיות משמעותי בבדיקות דו-זנביות.
    הערה: קבצי נתונים שנוצרו כאן זמינים מהמחברים לאחר השלמת הסכם העברת חומרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טבלה 1 מכילה את התוצאות של סרטוני NTA עבור דגימות הליפוזום (18 מסוננות ו-18 לא מסוננות) ודילול DPBS מייצג. ההשוואות בין שתי הקבוצות הושלמו ללא קשר לרמת המצלמה או לסף הזיהוי במאמר זה. דגימות מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 108.5 ננומטר, מצב חלקיקים של 86.2 ננומטר, וריכוז של 7.4 × 108 חלקיקים / מ"ל. לעומת זאת, דגימות לא מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 159.1 ננומטר, מצב חלקיקים של 105.7 ננומטר, וריכוז של 7.6 × 108 חלקיקים / מ"ל. ערכי הממוצע והמצב עבור הדגימות המסוננות והלא מסוננות,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנן מספר שיטות זמינות כדי להעריך את הגודל והריכוז של חלקיקים11. אלה כוללים שיטות אנסמבל המייצרות הערכת גודל מאוכלוסייה, כולל פיזור אור דינמי (DLS), משקעים צנטריפוגליים, ומיקרוסקופיה של רמת חלקיק יחיד-אלקטרון, NTA, מיקרוסקופיה של כוח אטומי וחישת דופק התנגדותית טונה. מתוכם, DLS ו- NTA נמצאים בשימוש נרחב, שיטות מדידת גודל וריכוז לא הרסניות, המבוססות על תנועה בראונית במדיום אידיאלי. DLS מסתמך על פיזור האור והעוצמה פרופורציונלית לריבוע של נפח החלקיקים. לכן, DLS רגיש יותר מאשר NTA לנוכחות של חלקיקים גד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי אינטרסים.

תודות

העבודה נתמכה על ידי מדינת קנזס למכון המערב התיכון לביולוגיה השוואתית של תאי גזע (MICSCB), המרכז לחקר הסרטן של ג'ונסון ל- MLW ו- NIH R21AG066488 ל- LKC. OLS קיבל תמיכה GRA מן MICSCB. המחברים מודים לד"ר סנטוש אראל על מתן הליפוזומים המשמשים בפרויקט זה ולחברי מעבדות וייס וכריסטנסון על שיחות ומשוב מועילים. ד"ר הונג הוא מודה על התמיכה הטכנית. MLW מודה לבטי גורן וייס על תמיכתה ויועצתה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות צנטריפוגה אוטומטיים, חרוטי, Nunc 15 מ"לתרמו מדע.339650
Kimwipes
מנקה
עדשות נייר עדשות NanoSight
LM-10Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 מודול לייזרMalvern Panalytical
Nanosight NTA תוכנה גרסה 3.2Malvern Panalytical
מגבות נייר טיפים
לפיפטה, 1-200 ומיקרו; L, מסונן, סטרילי, כריכה נמוכהBioExpressP -3243-200X
קצות פיפטה, 50-1,000 ומיקרו; L, מסונן, סטריליBioExpressP-3243-1250
מלח, פוספט של Dulbecco חוצץ (ללא Ca או Mg)Gibco14190-144
, העברת לטקס- 100 ננומטר (3 מ"ל)תקני MalvernNTA4088
, העברת לטקס- 50 ננומטר  (3 מ"ל)מסנן מזרק MalvernNTA4087
, 33 מ"מ, 0.22 ומיקרו; m, MCE, מותג פישר סטרילי09-720-004
מזרק, שחפת, 1 מ"ל, קצה החלקהBecton Dickinson309659
מיכל
תקני נוזל פסולת

מקורות

  1. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  2. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  3. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  4. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  5. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  6. Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57(2018).
  7. Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).
  8. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  9. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).
  10. Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
  11. Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639(2019).
  12. Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
  13. vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NTA

מאמרים קשורים