הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל Xenograft ללא תוויות לחקירת ההתנהגות של ספרואידים של תאי גזע אנושיים בעוברי אפרוחים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63067

⸱

15 באוקטובר 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטה להשתלה וזיהוי של ספרואידים של תאים אנושיים בעוברי אפרוחים. מודל קסנוגרפט זה משתמש במיקרו-סביבה העוברית כמקור לאותות מאלפים לבדיקת נדידת תאים, התמיינות וטרופיזם ומתאים במיוחד לחקר אוכלוסיות תאים ראשוניות ו/או הטרוגניות.

תקציר

Xenografts הן שיטות חשובות לחקירת ההתנהגות של תאים אנושיים in vivo. בפרט, הסביבה העוברית מספקת רמזים לנדידת תאים, התמיינות ומורפוגנזה, עם אותות מאלפים ייחודיים וזהות שכבת נבט שלעתים קרובות נעדרים ממודלים של קסנוגרפט בוגרים. בנוסף, מודלים עובריים אינם יכולים להבחין בין רקמות עצמיות לעומת רקמות שאינן עצמיות, מה שמבטל את הסיכון לדחיית השתל ואת הצורך בדיכוי חיסוני של המארח. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשתלת ספרואידים של תאים אנושיים בעוברי תרנגולות, הנגישים, ניתנים למניפולציה ומתפתחים ב-37 מעלות צלזיוס.

ספרואידים מאפשרים בחירה של אזור ספציפי בעובר להשתלה. לאחר ההשתלה, התאים משתלבים ברקמת המארח, ומאפשרים מעקב אחר נדידתם, צמיחתם והתמיינותם. מודל זה גמיש מספיק כדי לאפשר ניצול של אוכלוסיות דבקות שונות, כולל אוכלוסיות תאים ראשוניות הטרוגניות ותאים סרטניים. כדי לעקוף את הצורך בתיוג תאים קודם, מתואר גם פרוטוקול לזיהוי תאים תורמים באמצעות הכלאה של בדיקות Alu ספציפיות לאדם, וזה חשוב במיוחד בעת חקירת אוכלוסיות תאים הטרוגניות. יתר על כן, ניתן להתאים בקלות בדיקות DNA לזיהוי מינים תורמים אחרים. פרוטוקול זה יתאר את השיטות הכלליות להכנת ספרואידים, השתלה בעוברי תרנגולות, קיבוע ועיבוד רקמות לחיתוך פרפין, ולבסוף זיהוי התאים האנושיים באמצעות הכלאה של DNA באתר . בקרות מוצעות, דוגמאות לפירוש תוצאות והתנהגויות תאים שונות שניתן לבחון יידונו בנוסף למגבלות של שיטה זו.

מבוא

Xenografts הם כלים שימושיים לחקירת ההתנהגות של תאים אנושיים in vivo. מודלים אלה סיפקו מידע רב ערך למגוון רחב של נושאים מדעיים, כגון הביולוגיה של תאי גזע אנושיים1, תצפית על אירועים תאיים בזמן אמת2, וחקירת אנגיוגנזה גידולית וגרורות3. בנוסף, מספר היבטים של ביולוגיה של סרטן, כולל הגידול של קסנוגרפטים ספציפיים לחולה, נחקרו 4,5. לכל אחד מדגמי הקסנוגרפט הללו יש את היתרונות והחסרונות שלו, ולכן, כל אחד מהם מתאים יותר לשאלות מדעיות ספציפיות. עוברי אפרוח הם מודל ביולוגיה התפתחותי פופולרי מכיוון שהם מודל מי שפיר נגיש הניתן למניפולציה כירורגית. שתלים הטרולוגיים אפשרו לחוקרים ליצור מפות גורל מדויקות6 או לחקור אם תכונה היא אוטונומית תאית או מונחית על ידי הסביבה 7,8. רציונל דומה מאפשר להשתמש בעובר הגוזל כמודל קסנוגרפט לחקר התנהגותם של תאים אנושיים.

הסביבה העוברית מתזמרת באופן פעיל מורפוגנזה של רקמות עם אותות נדידה והתמיינות, כמו גם אינטראקציות תא-תא. לפיכך, בהשוואה למודלים של קסנוגרפט בוגרים, העובר מספק סביבה מאלפת יותר לבדיקת ההתנהגות של תאים מושתלים, למשל, על ידי חיקוי אותות הקיימים בנישות תאי גזע בוגרים (למשל, BMPs, WNTs, NOTCH ו-SHH9). בנוסף, היעדר מערכת חיסון נרכשת במהלך ההתפתחות המוקדמת מאפשר לבצע קסנוגרפלים ללא סיכון לתגובה חיסונית או דחייה של רקמת התורם10. מחקרים קודמים חקרו השתלות של תאים אנושיים בעוברי תרנגולות למטרה זו. הפוטנציאל הנוירוגני של תאי גזע אנושיים נבדק לאחר הזרקה לצינור העצבי או לכלי הדם11 בנוסף לשילוב של תאי גזע עובריים12 ותאי גזע פלוריפוטנטייםמושרים 13 לעובר. תאי מלנומה אנושיים נחקרו גם באמצעות הסביבה העוברית של הגוזל, שגילתה קשרים בין הגידול שלהם להתנהגות תאי הפסגה העצבית14, כמו גם תכנות מחדש של תאי הגידול עם המידע מהעובר15. מאמר זה מתאר פרוטוקול המתאים במיוחד לחקר ההתנהגות של אוכלוסיות תאים ראשוניות והטרוגניות אנושיות.

בעשורים האחרונים, המרכיב הסטרומלי של רקמות מגוונות נחקר כמקור אוטולוגי של תאי אב/גזע ובשל תכונותיו הפראו-אנגיוגניות והחיסוניות, שנודעו בעבר כ"תאי גזע מזנכימליים"16,17,18. הראשונה מבין אוכלוסיות התאים הללו שאופיינה הייתה אוכלוסיית תאי הסטרומה / תאי הגזע של מח העצם (BMSCs), שיש להם פוטנציאל אוסטאו, אדיפו ובמידה פחותה, כונדרוגני in vivo 19,20. תאי סטרומה שמקורם בשומן (ADSCs) הם אוכלוסייה הטרוגנית המתקבלת על ידי עיכול אנזימטי של דגימות הליפואספירט או הדרמוליפקטומיה, ואחריו בידוד של השבר הסטרומלי-וסקולרי (SVF) ולבסוף הרחבה בתרבית21. בתרבית, תאים אלה מאופיינים פנוטיפית על ידי סמנים המשותפים לאוכלוסיות מזנכימליות אחרות, כגון CD90, CD73, CD105 ו-CD44, סמנים ייחודיים כגון CD36, והיעדר סמנים המטופויאטיים (CD45) או אנדותל (CD31)22. בנוסף, ל-ADSCs יש פוטנציאל אוסטאו, אדיפו וכונדרוגני במבחנה, וניתן להגדיר את מספר תאי הגזע/אב באוכלוסייה זו על ידי בדיקת היחידה ליצירת מושבה פיברובלסטואידית (CFU-F)22. in vivo, דווח על קיומם של תאים עם פנוטיפ ADSC בתאים סטרומליים23 ו/או פריוסקולריים24. מתברר יותר ויותר שלמרות שיתוף סמנים לאחר תרבית חוץ גופית, תא הסטרומה של רקמות שונות משקף מאפיינים מהותיים של איבר נתון, ולאוכלוסיות תאים אלה יש תכונות שונות בהתאם למקורן 17,25,26,27. יתר על כן, מכיוון שתאים אלה מבודדים על סמך הדבקתם לצלחת תרבית תאים, הם עשויים להיות מורכבים מתאים משכבות נבט מגוונות28. לפיכך, שימוש בשיטת xenograft כדי לחקור את פוטנציאל ההתמיינות והטרופיזם של תאי סטרומה בצורה בלתי משוחדת יכול לספק מידע רב ערך על אוכלוסיות תאים אלה כדי להנחות את הפיתוח של טיפולים תאיים עתידיים.

הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1) הוא שיטת קסנוגרפט שמנצלת את העלות הנמוכה והקלות של מניפולציה של עוברי אפרוחים. הוא שימש בעבר לחקר ההתנהגות של ADSC29 אנושי, פיברובלסטים של העור29, תאי סטרומה שמקורם בדם הווסת30 ותאי גליובלסטומה31. שיטה זו תכלול השתלת תאים כספרואידים32, שאפשר להכין מכל אוכלוסייה של תאים נצמדים (איור 2). פרוצדורות כירורגיות והכנת חומרים כירורגיים מותאמים אישית - המיקרואזמל ונימי הזכוכית - יתוארו גם הם (איור 3). תאים אנושיים מתגלים בחתכים היסטולוגיים על ידי הכלאה של בדיקות Alu ספציפיות לאדם (איור 4), ובכך מבטלים את הצורך בתיוג מוקדם של התאים המושתלים. התוצאות המייצגות מתארות את ההתנהגות של ADSC אנושי שהושתל הן באזור הסומיטי ברמת ניצני הכנף (איור 5, איור 6 ואיור 7) והן בקשת הלוע הראשונה (איור 8), כמו גם ספרואידים ראשוניים אנושיים של גליובלסטומה שהושתלו בפרוסנצפלון (איור 8). יתוארו נדידת תאים, התמיינות ואינטראקציה עם רקמות עובריות של אפרוחים, כמו גם בדיקות מוצעות לחקירה נוספת של התנהגות התאים באמצעות צביעה משותפת או צביעה של קטעים סמוכים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים in vivo ששימשו במחקר זה עמדו בכל ההנחיות הניסיוניות הרלוונטיות לניסויים ומחקר בבעלי חיים, בהתאם להנחיות השימוש בבעלי חיים ניסיוניים בברזיל (L11794). הפרוטוקולים המשמשים לטיפול בעוברי תרנגולות אושרו כולם על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים בניסויים מדעיים (המרכז למדעי הבריאות של האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו). השימוש בתאים אנושיים אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי Clementino Fraga Filho (מספרים 043/09 ו-088/04). נעשה שימוש בביצים ספציפיות נטולות פתוגן (SPF) של עוף לגהורן לבן (Gallus gallus).

1. הכנת ספרואידים של תאים

הערה: ניתן להכין ספרואידים של תאים עם מגוון רחב של סוגי תאים כל עוד הם נצמדים. עבור פרוטוקול זה, בודדו תאי סטרומה אנושיים שמקורם בשומן (ADSCs) כפי שתואר קודם לכן21,27 ישמשו (איור 2A). התאים הושגו על ידי עיכול שברי רקמת שומן או ליפואספירטים עם קולגנאז IA למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה, ולאחר מכן ציפוי ב-1-2 ×-104 תאים/סמ"ר ודגירה למשך הלילה. תאים שאינם דבקים הושלכו, והתאים הדבקים הורחבו למשך 3-6 מעברים. ADSCs היו הומוגניים לביטוי האנטיגנים על פני השטח CD105, CD90, CD13 ו-CD44 ושליליים לאנטיגנים המטופויאטיים CD45, CD14, CD34, CD3 ו-CD1927. בעוד שהשיטה המתוארת כאן יכולה להתבצע בקלות עם חומרים מינימליים מעבר למה שמשמש באופן שגרתי לתרבית תאים, יש לקבוע באופן אמפירי את זמן הצבירה האופטימלי ואת הצורך בדיסוציאציה חלקית. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות להכנת ספרואידים תאיים, כגון שיטת הטיפה התלויה33 או בארות מצופות אגרוז34; ראה את הדיון לפרטים נוספים. יש לבצע את כל ההליכים על ספסל נקי תוך שימוש בטכניקות אספטיות.

  1. לחמם PBS סטרילי (מי מלח חוצץ פוספט), מדיום תרבית ותמיסת טריפסין ל-37 מעלות צלזיוס לפני מניפולציה של תאים.
  2. תרבית ADSCs ב-DMEM עם גלוקוז נמוך בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/מ"ל פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין. השתמש בבקבוק משולב בגודל 25 ס"מ2 של ADSCs להכנת שתי צלחות ספרואידים. השליכו את מדיום התרבות ושטפו את כלי התרבות שלוש פעמים בכמות מתאימה של PBS סטרילי (5 מ"ל PBS לכל שטיפה אם משתמשים בבקבוק תרבית2 תאים בגודל 25 ס"מ).
  3. הוסף מספיק תמיסת טריפסין (המכילה 0.78 מ"מ EDTA) כדי לכסות את התאים (1 מ"ל של תמיסת טריפסין אם משתמשים בבקבוק תרבית תאים25 ס"מ) ותן לבקבוק התרבית לשבת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. פיפטה בעדינות את התאים למעלה ולמטה כדי לנתק אותם. הוסף את אותה כמות של מדיום תרבית המכיל FBS כדי לנטרל את הטריפסין, והעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה למשך 10 דקות בחום של 180 × גרם. השלך את הסופרנטנט והקש על הצינור כדי לשחרר את הגלולה.
  6. השעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר-2 מ"ל של מדיום תרבית המתאים לסוג התא (ראה שלב 1.2).
    הערה: הריכוז המינימלי הוא 5 × 105 תאים/מ"ל עבור תאים דבקים כגון ADSCs ופיברובלסטים. יש לתלות בקבוק משולב של 25 ס"מ2 של ADSCs ב -2 מ"ל בינוני ומצופה ב -2 צלחות פטרי, באמצעות 1 מ"ל כל אחת. תאים פחות נצמדים, כגון גליה, עשויים להפיק תועלת מציפוי ב-~2 ×-106 תאים/מ"ל בנפח נמוך יותר.
  7. העבירו בזהירות את תרחיף התאים לצד אחד של צלחת פטרי סטרילית בגודל 60 מ"מ (לא מצופה ולא מטופלת, כמו אלה המשמשות להכנת צלחות אגר). נסו להגביל את מדיום התרבית לאזור הקטן ביותר האפשרי (איור 1B) על ידי הנחת הצלחת על פיסת גזה מקופלת ונקייה כדי לשמור אותה מוטה באינקובטור.
  8. דגרו את תרחיף התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, עד שנוצרים אגרגטים של תאים (6-8 שעות לאחר ציפוי ה-ADSCs).
    הערה: זמן הצבירה של הספרואידים עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא.
  9. במידת הצורך (ראה דיון), נתק חלקית אגרגטים של תאים גדולים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה באמצעות קצות של 1000 מיקרוליטר. נתק את הספרואידים ADSC 6-8 שעות לאחר הציפוי.
  10. הניחו את הצלחת באינקובטור עד שהספרואידים מוכנים להשתלה: עגולים עם קצוות מוגדרים ולא מתפזרים בקלות (איור 1C,D).
    הערה: ספרואידים ADSC מוכנים יומיים לאחר דיסוציאציה חלקית.

2. השתלת ספרואידים לעוברי אפרוחים

  1. הכנה
    1. הכינו ביצי עוף על ידי דגירה של 15-30 ביצים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס עד להגעה לשלב המבורגר-המילטון (HH) הרצוי35: 40-45 שעות עבור שתלים בסומיטים ברמת ניצני הגפיים (HH11-12 או 13-19 סומיטים) או 29-33 שעות עבור שתלים באזור הצפאלי (HH8-9 או 5-8 סומיטים). מקמו את הביצים בצורה אופקית, וציירו קו עם עיפרון על החלק העליון של הביצים לפני הדגירה (איור 3D).
      הערה: זמני הדגירה עשויים להשתנות מעט בהתאם לחממות בודדות. שרטוט קו יבטיח שניתן יהיה לזהות בקלות את החלק העליון של הביצית, שבו נמצא העובר, אם הביצית מסובבת לפני הניסוי.
    2. הכן מחטים חדות ("מיקרואזמלים") על ידי הצמדת מחט תפירה למחזיק מחט מתכת (איור 3B). בעזרת אבן משחזת משומנת, השחיזו את המחט עד שהיא דומה לאזמל קטן עם קצה דק (איור 3C). לחלופין, הכינו מחט טונגסטן חדה על ידי אלקטרוליזה36.
    3. הכן נימי זכוכית באמצעות להבה של מבער בונסן כדי להמיס לזמן קצר את החלק הדק של פיפטת פסטר מזכוכית. הסר את החלק המותך מהלהבות ומתח אותו ליצירת נימים דקים. חלקו בזהירות את הנימים לשני חלקים על ידי שבירתו בעזרת מיקרו-מלקחיים. הכינו נימי דם דקים להזרקת דיו בהודו ונימים עבים להעברת ספרואידים (איור 3B).
      הערה: על ידי שינוי חוזק המשיכה, ניתן ליצור מדי נימים שונים. יש להכין נימים ממש לפני הניתוח.
    4. הכינו את משטח העבודה וחומרים אחרים למניפולציה של ביצים (איור 3A). עקר את כל החומרים הכירורגיים בתנור 100 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עם אתנול 70% מיד לפני השימוש. יש לחמם PBS סטרילי ל-37 מעלות צלזיוס. חבר קצה של 200 מיקרוליטר (עם מחסום) למכלול צינור השואב להזרקת דיו בהודו והעברת ספרואידים.
      הערה: השתמש בטיפים עם מחסומים בעת העברת ספרואידים של תאים אנושיים.
    5. רגע לפני הניסוי, הוסיפו 2 טיפות של תמיסת דיו הודו לצלחת פטרי 30 מ"מ וערבבו אותה עם 1 מ"ל PBS סטרילי. הוציאו את צלחת הכדור מהאינקובטור והניחו אותה מעל קופסת קרח למשך שארית הניסוי.
  2. הכנת כל ביצה
    1. מוציאים ביצה אחת מהחממה ומניחים אותה מעל מחזיק ביצים. צרו חור קטן בקצה החד של הביצה (איור 2D) ושאבו 1.5 מ"ל של חלבון באמצעות מזרק ומחט. הכנס את המחט בניצב לביצה כדי למנוע פגיעה בחלמון הביצה. אטום את החור בעזרת סרט דבק. לחלופין, חזור על שלב זה עבור כל הביצים לפני הניסוי, ודגר מחדש את שאר הביצים.
    2. חתכו בזהירות חלון בחלק העליון של הביצה באמצעות מספריים (איור 3D). בעזרת הפיפטה מוסיפים 1-2 טיפות PBS מעל החלמון. במידת הצורך, הסירו בועות חלבון גדולות (כמו אלה שנראות באיור 3F) באמצעות הפיפטה.
    3. חבר את הנימים הדקים למכלול צינור השואב. מלאו את נימי הזכוכית חלקית בתמיסת הדיו ההודית על ידי שאיפה. הזריקו מספיק דיו הודי לחלמון שמתחת לעובר עד שהמבנים העובריים נראים (איור 3E,F).
    4. באמצעות סטריאומיקרוסקופ, ספרו את מספר הסומיטים (איור 4A). מספור את הביצים בנפרד באמצעות עיפרון (איור 4B).
  3. השתלת ספרואיד
    1. זהה את אזור השתל: מזודרם פרקסיאלי ברמת ניצן הכנף (מזודרם פרסומיטישל הסומיטים המשוער15עד 20 3 7) (איור 3G ואיור 5A) או אזור קשת הלוע הראשון המשוער (בין האקטודרם לאנדודרם לרוחב למזנספלון האחורי / מעוין ראשון38) (איור 8A).
    2. חותכים את קרום הוויטלין מעל אזור המטרה באמצעות מיקרואזמל.
    3. באמצעות זוג מיקרו-אזמלים, בצעו חתך רדוד באזור שבו הספרואיד יושתל (איור 3H).
      הערה: הימנע מפגיעה באנדודרם הבסיסי; אחרת, החלמון ידלוף (אם זה קורה, השליכו את הביצה).
    4. הסר את הנימים הדקים מהשואב והחלף אותו בנימים העבים. התבוננו בספרואידים תחת הסטריאומיקרוסקופ ובחרו ספרואיד בערך באותו גודל כמו הסומיט (איור 2D). שאפו את הכדור הזה לנימים.
    5. הפקידו בעדינות את הכדור ליד האזור החתוך (איור 3H). בעזרת המחטים החדות, דחפו את הכדור לאזור החתוך (איור 3I,J).
    6. הוסף 1-2 טיפות PBS על העובר באמצעות הפיפטה כדי להבטיח שהספרואיד מוכנס היטב.
      הערה: אם השתל נעקר, יש להשתיל ספרואיד חדש (שלבים 2.3.4 ו-2.3.5).
    7. נקה כל דליפת אלבומין מקליפת הביצה באמצעות נייר טישו כדי להבטיח שניתן לאטום את הביצה לחלוטין, ולהימנע מזיהום. אוטמים את החלון בביצה בעזרת סרט דבק.
    8. שימו לב לאזור המושתל (איור 4A). מחזירים בזהירות את הביצה לחממה הלחה בטמפרטורה של 37.5 מעלות צלזיוס כדי למנוע עקירת הספרואיד שהוכנס.
    9. דוגרים את הביצה עד לשלב הרצוי.
      הערה: כאשר הקסנוגרפט מבוצע בסומיטים ברמת ניצני הגפיים, נדידה ומוות תאים נבדקו בהצלחה בעוברים בני 3.5 ימים (HH21), והתמיינות תאים וטרופיזם נצפו בעוברים בני 6 ימים (HH29) (איור 5A). אינטגרציה ברקמות המארח בוצעה גם בעוברים בני 8 ימים (HH33). תאי תורם שהושתלו בטריטוריה של קשת הלוע נחקרו בעוברים בני 4.5 ימים (HH25) (איור 8A).

3. דיסקציה, קיבוע, עיבוד והכנת חתכים היסטולוגיים

  1. חיתוך וקיבוע
    1. הכן את הקיבוע (לפחות 1 מ"ל לעובר): אתנול 100%-פורמלדהיד 37%-חומצה אצטית קרחונית ביחס של 6:3:1. נקה את משטח העבודה, זוג מיקרו-מלקחיים, מספריים כירורגיים או מספריים לקשתית וכף מחוררת. מלאו צלחת פטרי מזכוכית 60 מ"מ ב- PBS קר והניחו אותה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
    2. פתח את הביצה על ידי חיתוך סרט ההדבקה.
    3. חותכים את הממברנות סביב העובר ומסירים אותו בעזרת הכף המחוררת.
    4. מעבירים את העובר לצלחת הפטרי. אם העובר בן 5 ימים (HH26) ומעלה, ערפו את ראשו מיד לפני כל מניפולציה ex ovo.
    5. הסר את כל הממברנות שנותרו באמצעות מיקרו-מלקחיים ומספריים. מערבבים בעדינות את הדגימה ב-PBS כדי לשטוף את כל טיפות החלמון שנותרו.
    6. אם הקסנוגרפט בוצע בגובה הכנף, השליכו את הראש. אם הושתלו תאים באזור הצפלי, חתכו והשליכו את המחצית התחתונה של הגוף, והבטיחו שאזור הלב יישמר שלם.
    7. העבירו כל דגימה לצינור נפרד של 2.0 מ"ל המכיל 1 מ"ל של הקיבוע. זהה את הצינורות בנפרד כמו קודם (איור 4B). דגרו אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
    8. השתמשו בכדור של תאים או ספרואידים (איור 4F) כבקרה חיובית. לשם כך, צנטריפוגה תרחיף תאים (שלב 1.5) או ספרואידים של תאים (שלב 1.10) בטמפרטורה של 180 × גרם למשך 10 דקות בצינור של 1.5 מ"ל, השליכו את מדיום התרבות והוסיפו 1 מ"ל של הקיבוע מבלי להפריע לגלולה. דגרו את הצינור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ללא תסיסה, והמשיכו באותו אופן כמו עבור דגימות הגוזלים.
  2. התייבשות והטמעה
    1. יבש את העוברים על ידי שטיפות רצופות של 1 מ"ל של 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול ב-1x PBS למשך שעה אחת לפחות כל אחד עם תסיסה.
    2. דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-1 מ"ל של 100% אתנול בטמפרטורת החדר עם תסיסה.
    3. דגרו את הדגימות ב-1 מ"ל של 100% קסילן למשך שעה אחת במכסה אדים. חזור על הפעולה פעמיים נוספות.
    4. העבירו את תכולת הצינור לגוש הצביעה והשליכו את הקסילן. הוסף מספיק פרפין מותך כדי לכסות את העובר ולכסות את גוש הצביעה במכסה הזכוכית שלו. דוגרים לילה בתנור בחום של 65 מעלות.
    5. הכינו צלחת חמה ותבנית לגושי פרפין להטמעה.
      הערה: זוג מהדקי נייר מתוחים שימושיים למיקום העובר.
    6. ממלאים את התבנית בפרפין מותך ומעבירים אליה את העובר. מקם את העובר כדי לקבל חתך רוחבי של תא המטען (איור 5A) או קטע עטרה של הראש (איור 8A).
    7. הכניסו תג שם מנייר בפרפין, מול המשטח שאותו יש לחתך, כדי לסייע לחתוך את העובר בכיוון הנכון (איור 4C).
    8. אם אתה בשימוש, הנח את קלטת ההטבעה מעל הדגימה. הניחו לבלוק להתקרר לחלוטין לפני שמוציאים אותו מהתבנית. לחלופין, חבר את גוש הפרפין המוקשה לקסטה או למחזיק בלוק אחר באמצעות פרפין מותך ותן לו להתקרר שוב.
  3. חלוקה
    1. הכן את החומרים לחיתוך. מחממים פלטה חמה ל-42 מעלות ומכסים צלחת קרטון או קלקר בנייר אלומיניום נקי בגודל של כ-30 ס"מ על 20 ס"מ. נקה את כל המשטחים לפני השימוש.
      הערה: השתמש בכפפות כדי למנוע זיהום בנוקלאזות, במיוחד אם חלקים מסוימים ישמשו להכלאת RNA באתר . הימנע משימוש באמבט היסטולוגי כדי למתוח את חלקי הפרפין מאותה סיבה, אלא אם כן ניתן לנקות היטב את המים והמשטחים לפני כן.
    2. חתוך את עודפי הפרפין בעזרת להב מיקרוטום. צרו שיפוע משני הצדדים, בצורה טרפזית, להפרדה קלה של כל חלק באמצעות להב אזמל בשלב מאוחר יותר (איור 3A).
    3. חבר את הבלוק למיקרוטום. מקם את הבלוק בזהירות כדי להבטיח שהצד השמאלי והימני מקבילים זה לזה. בצע התאמה עדינה יותר לאחר חיתוך כמה חלקים מהדגימה והתבוננות בהם במיקרוסקופ.
    4. כאשר הושג אזור היעד (ניצן הגפה או קשת הלוע הראשונה), חותכים 7 קטעים של מיקרומטר ומניחים את סרטי הפרפין מעל הצלחת המכוסה בנייר אלומיניום. חתכו את כל אזור המטרה (איור 4C).
    5. להכנת קטעים סדרתיים, יש לכסות את המספר המתאים של כוסות השקופיות בטיפות מים סטריליים נטולי יונים. העבירו חלקים בודדים לשקופיות ברצף, בעזרת מברשות ואזמל. העבר חלקים סמוכים לשקופיות שונות כדי ליצור מקטעים טוריים (איור 4D). הכן סדרה של 3 שקופיות לעוברים בני 3.5 ימים, 4 שקופיות לעוברים בני 4.5 ימים ו-5 שקופיות לעוברים בני 6 ימים. מכתים קטעים סמוכים עם בדיקות שונות, נוגדנים או כתמים היסטולוגיים קלאסיים.
      הערה: אותה סדרה עשויה להכיל מספר שקופיות סמוכות אם חלק גדול מהעובר נחתך. ניתן להעביר מספר קטעים לכל שקופית, תוך שמירה על מרווח מסוים בין החלקים כדי לאפשר להם להימתח. אל תניח את השקופית על הצלחת החמה עדיין.
    6. לאחר שכל החלקים הועברו למגלשות, הוסיפו עוד מים עד שכל החלקים צפים מעל טיפת מים אחת. הניחו את השקופית על צלחת חמה ותנו לחלקים להימתח. הסר את השקופית מהצלחת החמה, והסר את המים על ידי הטיית זכוכית השקופיות בזהירות כנגד נייר טישו.
      הערה: אל תתנו לחלקים לגעת ישירות בזכוכית לפני שהם נמתחים.
    7. הניחו למגלשות להתייבש למשך הלילה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

4. סינתזה של בדיקות Alu עם תווית דיגוקסיגנין על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR)

  1. הכן תמיסת מלאי של הפריימרים הבאים הספציפיים לאדם39: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3' ו-AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. הכן 50 מיקרוליטר של תגובת ה-PCR הבאה40: 1x מאגר PCR, 2.0 מ"מ MgCl2, 0.1 מ"מ dCTP, 0.1 מ"מ dGTP, 0.1 מ"מ dATP, 0.065 מ"מ dTTP, 0.035 מ"מ dig-11-dUTP, 0.4 מיקרומטר פריימרים AluFw, 0.4 מיקרומטר פריימרים AluRev, 0.05 U/μL Taq פולימראז ו-1 ננוגרם/מיקרוליטר DNA גנומי אנושי.
  3. הפעל את ה-PCR באמצעות ההגדרות הבאות: דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ואחריה 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, ולאחר מכן דנטורציה סופית של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. מדוד את ריכוז הבדיקה באמצעות ספקטרופוטומטר. אחסן את הבדיקות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: מוצר ה-PCR צריך להיות 200-300 bp זמן רב לאחר אלקטרופורזה בג'ל אגרוז2% 29.

5. הכלאה באתרה של חתך עם בדיקות Alu

  1. יום 1: חדירות והכלאה
    הערה: יש להשתמש בצנצנת זכוכית מעוקרת לכל השלבים שבוצעו ביום הראשון.
    1. יש לחמם שטיפה אחת של PBT (0.1% Tween 20 ב-PBS) באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולהכין תא לח עם 50% פורממיד/50% מים נטולי יונים.
      הערה: חשב את נפח כל הכביסות על סמך גודל צנצנת הזכוכית. אלא אם צוין, כל השטיפות מבוצעות על ידי טבילה של השקופיות בתמיסה.
    2. הסר את הפרפין בשלוש שטיפות רצופות בקסילן, 5 דקות כל אחת, במכסה אדים.
    3. החזר את הסדרה בשתי שטיפות ב-100% אתנול למשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן שטיפות 90/70/30% אתנול ב-PBS למשך 2 דקות כל אחת.
    4. יש לכבס ב-PBT (0.1% Tween 20 ב-PBS) שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחת.
    5. לחדירה, הוסף 2 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאינאז K ל-PBT שחומם מראש, טבל את השקופיות בתמיסה ודגר אותן למשך 14 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    6. תקן את החלקים על ידי טבילה ב-4% פרפורמלדהיד/PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. שוטפים עם PBS למשך 5 דקות.
    8. לאחר ניגוב עודפי PBS מכל שקופית, כסו את החלקים ב-300 מיקרוליטר של מאגר הכלאה (50% פורממיד נטול יונים, 4x SSC pH 5.0, 1x תמיסת דנהרדט, 5% דקסטרן סולפט, 100 מיקרוגרם/מ"ל DNA של זרע סלמון) (טבלה 1). יש לדגור למשך שעה בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס בתא הפורממיד.
    9. הכן תמיסה של בדיקת Alu של 0.2 ננוגרם/מ"ל במאגר הכלאה. הטה את השקופית כדי להסיר את מאגר ההכלאה ולהוסיף 120 מיקרוליטר של תמיסת בדיקת Alu מעל החלקים. מכסים בכיסוי זכוכית, מקפידים להימנע מבועות.
      הערה: אין להשתמש בפרפילם לכיסוי השקופיות בשלב זה, מכיוון שהוא יימס בטמפרטורות מעל 70 מעלות צלזיוס.
    10. מחממים את השקופיות על פלטה חמה בחום של 95 מעלות למשך 5 דקות.
      הערה: אין לנשום את אדי הפורממיד.
    11. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס בתא הפורממיד למשך הלילה.
  2. יום 2: שטיפות מחמירות ואימונוהיסטוכימיה
    1. הכן מאגר SSC 20x (3 M NaCl, 0.3 M נתרן ציטראט, pH 7.5) (טבלה 1). יש לחמם מראש שתי שטיפות של 0.1x מאגר נתרן ציטראט (SSC), pH 7.5 עד 42 מעלות צלזיוס.
    2. מלאו צנצנת זכוכית שקופיות עם מאגר SSC 2x, pH 7.5. הנח בעדינות את השקופיות בתמיסה והמתן עד שהכיסויים יתנתקו מעצמם. הסר את החלקות הכיסוי באמצעות צבתות ודגר את השקופיות במאגר SSC 2x למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. שטפו מחדש את השקופיות עם מאגר SSC 2x, pH 7.5, למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר SSC 0.1x, pH 7.5, ב-42 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כל אחת.
    5. שטפו את השקופיות פעמיים עם MABT (מאגר חומצה מאלית עם טווין; 0.1 M חומצה מאלית, 0.15 M נתרן כלורי, 0.1% טווין 20, pH 7.5) (טבלה 1) למשך 30 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר.
    6. נגב את המאגר העודף מכל שקופית וכסה את החלקים ב-400 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (10% סרום עזים רגיל מושבת, 2% מגיב חוסם ב-MABT). דגירה למשך שעתיים בתא לח (מוכן עם מים דה-יונים) בטמפרטורת החדר.
    7. הטה את השקופיות כדי להסיר את הנוזל ולהוסיף 150 מיקרוליטר של שברי Fab anti-DIG מצומדים לפוספטאז אלקליין בדילול של 1:2,000 בתמיסת חסימה. מכסים בכיסוי זכוכית או פרפילם ודוגרים בתא הלח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  3. יום 3: התפתחות צבע
    1. הסר בעדינות את הכיסויים או הפרפילם בתוך צנצנת עם MABT (כמו בשלב 5.2.2), ודגר את השקופיות ב-MABT למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. שטפו עם MABT שלוש פעמים נוספות למשך 30 דקות כל אחת.
    3. שטפו עם MAB (מאגר חומצה מאלית; 0.1 M חומצה מאלית, 0.15 M נתרן כלורי, pH 7.5) (טבלה 1) למשך 30 דקות.
    4. יש לשטוף פעמיים עם NTM (מאגר NaCl-Tris-MgCl2 ; 100 מ"מ Tris-HCl pH 9.5, 100 מ"מ נתרן כלורי, 50 מ"מ מגנזיום כלוריד) (טבלה 1) למשך 10 דקות כל אחד.
    5. הוסף את תמיסת הצביעה (0.45 μL/mL 4-Nitro blue tetrazolium chloride, 3.5 μL/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine ב-NTM) (טבלה 1) לצנצנת הצביעה וטבול את השקופיות בתמיסה. מכסים את הצנצנת בנייר אלומיניום ונותנים לצבע להתפתח למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  4. יום 4: צביעה והרכבה
    1. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחת.
      הערה: ודא שתמיסת הצביעה מסולקת כראוי כפסולת הלוגן.
    2. הרכיבו את השקופיות כפי שהן על ידי הוספת טיפות של אמצעי הרכבה מימי וכיסוי החלקים בכיסוי זכוכית. לחלופין, המשיכו לצבע אדום מהיר גרעיני או כחול אלציאני.
    3. נגב עודפי PBS והוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת צביעה גרעינית של 0.1% אדום מהירגרעיני 41 (טבלה 1) מעל החלקים ודגר את המגלשות בתא לח למשך 10 דקות. טיפ להסרת עודפי גרעין מהיר אדום והמשך להתייבשות (שלב 5.4.5).
    4. טבלו את החלקים בתמיסה כחולה אלציאנית של 0.5% (כתם נגד סחוס)42 למשך 10 דקות; שוטפים במים מזוקקים ודוגרים בחומצה פוספומוליבדית 1% למשך 10 דקות. יש לשטוף שוב במים ולהמשיך להתייבשות.
      הערה: אם שטיפת החומצה הפוספומוליבדית מושמטת, כחול אלציאני הופך לכתם נגד גרעיני.
    5. יש לייבש באתנול 70/95/100/100% למשך 5 דקות כל אחד.
    6. שטפו עם קסילן שלוש פעמים במשך 5 דקות בכל פעם בקולט אדים.
    7. הר עם מדיום הרכבה על בסיס קסילן וכיסויי זכוכית.
    8. הניחו לשקופיות להתייבש לפחות 16 שעות במכסה אדים.

6. רכישת תמונות

  1. לאחר ייבוש יסודי של השקופיות המותקנות, בדוק את כל החלקים לנוכחות תאים אנושיים מושתלים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף (איור 4E). חפשו תאים חיוביים ל-Alu בצבע כחול-סגול (איור 4F,G) וסמנו את החלקים שמכילים תאים חיוביים ל-Alu באמצעות עט סמן (איור 4E).
    הערה: סימון הקטעים בתאים חיוביים ל- Alu יקל על מציאתם בעת צילום והשוואה בין שקופיות סמוכות המוכתמות בסמנים אחרים.
  2. הקפד לצלם קטעים המכילים את הקסנוגרפט באותו סדר כמו מיקומם על השקופית (כיוון אנטרו-אחורי). תן שם לכל תמונה עם כל המידע הרלוונטי, כגון [תאריך הקסנוגרפ]_[סוג תא]_[גיל עוברי]_[סוג בדיקה]_[מספר סעיף]_001. כלול קובצי מטא-נתונים כדי להוסיף את סרגל קנה המידה במועד מאוחר יותר.
  3. אם שקופיות אחרות מאותה סדרה מוכתמות בסמן אחר, למשל, הכלאה של RNA באתרו או אימונוהיסטוכימיה, צלמו ושמו קטעים סמוכים (איור 6) באותו אופן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהוי ADSCs חיוביים ל-Alu בחתכים היסטולוגיים
רצפי Alu הם אלמנטים חוזרים המהווים ~10% מהגנום האנושי ולכן הם מטרות מצוינות לזיהוי תאים אנושיים באופן ספציפי למין43. ניתן להשתמש בהכלאה באתרה עם בדיקות DNA לזיהוי אלמנטים גנומיים בחתכים היסטולוגיים, כולל תאים אנושיים ראשוניים 29,30,40,44,45,46.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1) מציג אפשרות אפשרית לסינון ההתנהגות של אוכלוסיות ראשוניות של תאים אנושיים in vivo, תוך שימוש בעוברי אפרוחים כמודל. מאמר זה מתאר את היווצרותם של ספרואידים תאיים (איור 2), השתלת הספרואיד לתוך עובר הגוזל (איור 3), עיבוד דגימות והכלאה באתרה (איור 4), תוצאות מייצגות של ADSCs אנושיים שהושתלו במזודרם הפרסומיטי (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי האוניברסיטה הפדרלית של ריו דה ז'ניירו (UFRJ for J.B.), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq for J.B.) ו-Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ for J.B). אנו מודים ל-T. Jaffredo (CNRS, פריז, צרפת) על הגשושית Runx2 (Cbfa1). הנוגדן HNK1 התקבל מבנק ההיברידומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה-NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242 ארה"ב. אנו מודים ל-V. Moura-Neto על הענקת גישה למיקרוטום, ול-R. Lent על הענקת גישה למיקרוסקופ. אנו מודים ל-E. Steck על העזרה בסינתזה של בדיקות Alu .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>בעלי חיים
ביצי גאלוס גאלוסגרניה טולומייללא SPFעוף רגליים לבן
<חזק>ריאגנטים
כחול אלסיאני 8GXסיגמא-אולדריץ'A5268
AluFw פריימריםסיגמא-אולדריץ'אוליגו5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
פריימרים AluRevSigma-aldrichOLIGO5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
אלומיניום סולפטסיגמא-אולדריץ'368458להכנת תמיסה אדומה מהירה גרעינית
אנטי דיגוקסיגנין-AP, שברי FabRoche11093274910מזהה רישום נוגדנים: AB_514497
נוגדן אנטי-אנושי רוצח טבעי 1 (HNK1, CD57)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה3H5מזהה רישום נוגדנים: AB_2314644
נגד עכברים, עז IgM-HRPסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-2973מזהה רישום נוגדנים:
AB_650513 נגד עכברים, עז IgG (H+L)-HRPNovexG-21040מזהה רישום נוגדנים: AB_2536527
נוגדן נגד שריר חלק אקטין/ACTA2DakoM085129מזהה רישום נוגדנים: AB_2811108
AquatexMerck1085620050חומר הרכבה מימי
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate מלח p-toluidine (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
מגיב חוסםרוש11096176001
חומצת לימוןVETEC238להכנת מאגר SSC
קולגנאז מסוג IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP סטתמיסת Roche11969064001
Denhardt 50XInvitrogen750018להכנת מאגר הכלאה
Dextran sulphate מלח נתרןThermo Scientific15885118להכנת מאגר הכלאה
תיוג RNA DIGRoche11277073910מכיל Dig-11-dUTP
DMEM דל גלוקוזSigma-aldrichD5523
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)סיגמא-אולדריץ'D5905-50TAB
N,N-Dimethylformamide (DMF)227056 סיגמא-אולדריץ'להכנת תמיסת NBT ו-BCIP
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא-אולדריץ'E6758להכנת תמיסת טריפסין
Entellan NewMerck107961מדיום הרכבה לא מימי
אתנולProquí miosN/A
סרום בקר עובריThermoFisher12657029Inactivate ב-56 מעלות; C לפני השימוש
בתמיסת פורמלדהיד 37%Proquí miosN/A
FormamideVetecV900064
חומצה אצטית קרחוניתProquí miosN / A
הודו דיוPelikan221143
תמיסת L-גלוטמין (200 מ"מ)Gibco25030-149
מגנזיום כלורידMerck8147330100להכנת מאגר NTM
חומצה מאליתSigma-aldrichM0375-500Gלהכנת מאגר MAB
מתנולProquí mios
סרום עיזים רגילSigma-aldrichNS02LInactivate ב-56 מעלות; C לפני השימוש
4-Nitro כחול טטרזוליום כלוריד (NBT)Roche11585029001
גרעיני מהיראדום סיגמא-אולדריץ'60700
Paraplast פלוססיגמא-אולדריץ'P3558
פניצילין G מלח נתרןסיגמא-אולדריץ'P3032
פוספט חוצץ מלח (PBS)סיגמא-אולדריץ'P3813
חומצה פוספומוליבדיתMerck100532
Proteinase KGibco BRL25530-015
זרע סלמון DNAInvitrogen15632011להכנת מאגר הכלאה
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888להכנת מאגר SSC, MAB ו-NTM
סטרפטומיצין סולפטסיגמא-אולדריץ'S6501
ערכת Taq PolymeraseCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TrypsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
XyleneProquí miosN/A
<חזק>מיקרוסקופ וציוד
Axioplan מיקרוסקופ זקוףקרל זייס מיקרוסקופיהN/A
תוכנת Axiovisionקרל זייס מיקרוסקופיהN/A
אינקובטור תאיםThermoForma3110
חממת ביצים- 50 ביציםGP
מנורת צוואר אווזBiocamN / Aלמניפולציה של ביצים
תוכנת פיג'י; תוסף מונה תאיםImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
קולט אדים זרימה למינריתTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
מיקרוטום סיבוביLeica BiosystemsRM2125 RTSלחיתוך
סטריאומיקרוסקופLabomedLuxeo 4Dלמניפולציה
של ביציםתנור עיקורREALIS7261690לעיקור חומרים כירורגיים
<חזקים>חומרים מתכלים
0.2 מ"ל (PCR) צינורות צנטריפוגה פוליפרופילןEppendorf30124707
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילןקורנינגCLS430791
1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילןAxygenMCT-150-C
2 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילןAxygenMCT-200-C
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילןקורנינגCLS430829
טיפים למחסום (מסנן), 200 μ AM12655Invitrogenלמניפולציה של ביצים
גוש זכוכית חפור (בלוק כתמים) עם כיסוי זכוכיתהכט קארל42020010
הטמעת קלטותSimportM480משמש כמחזיק בלוק פרפין
מגלשות כיסוי זכוכית, 24 x 40 מ"מKasviK5-2440
פיפטות פסטר זכוכית 230 מ"מNORMAX5426023להכנת נימי זכוכית
להבי מיקרוטוםLeica BiosystemsHIGH-PROFILE-DISPOSABLE-BLADES-818לחיתוך
Parafilm MParafilmP7793
צלחת פטרי מפלסטיק, 30 מ"מKasviK13-0035למניפולציה של ביצים
צלחת פטרי מפלסטיק, 60 מ"מProlab0303-8להכנת ספרואידים בתאים. אין לטפל בהידבקות תאים. 
שקופיות זכוכית סילאן (Starfrost)Knittel Glass198למזרק חתך
1 מ"ל, מחטים 26 גרם (0.45 x 13 מ"מ)Descarpack32972למניפולציה של ביצים (שאיבת אלבון)
<כלים כירורגיים חזקים>
צינור שואבדראמונד2-000-000למניפולציה של ביצים
מספרייםלדיסקציהFine ScienceTools 14061-11למניפולציה
של ביצים מיקרו-מלקחיים (פינצטה)Fine ScienceTools 00108-11למניפולציה של ביצים והכנת נימי זכוכית
מחזיק מחט (צ'אק מחט חיתוך מתכוונן)Fisherbrand8955למניפולציה של ביצים
אבן משחזת שמן, 10.000 חצץN / AN / Aלחידוד מחטים
זוג קטן מברשות צבעN/AN/A לטיפולבקטעי פרפין. ניתן להשתמש בכל מותג.
מחטי תפירהN/AN/Aלחידוד למיקרואזמל. ניתן להשתמש בכל מותג.
אזמל חד פעמי סטרילי מס' 23Swann-Norton110לחיתוך
ידית אזמל כירורגיתSwann-Norton914לחיתוך
מספריים לקשתית Wecker, SurtexSS-641-11למניפולציה של ביצים
תערובת בגודל L חד/חד

מקורות

  1. Herbert, K. E., Lévesque, J. P., Haylock, D. N., Prince, M. The use of experimental murine models to assess novel agents of hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 14 (6), 603-621 (2008).
  2. Parada-Kusz, M., et al. Generation of mouse-zebrafish hematopoietic tissue chimeric embryos for hematopoiesis and host-pathogen interaction studies. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (11), (2018).
  3. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  4. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicological Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  5. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nature Genetics. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  6. le Douarin, N., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
  7. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  8. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  9. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  10. Douarin, N., et al. le et al. Evidence for a thymus-dependent form of tolerance that is not based on elimination or anergy of reactive T cells. Immunological Reviews. 149 (1), 35-53 (1996).
  11. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e2071(2010).
  12. Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells and derivatives to the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 584, 367-385 (2010).
  13. Akhlaghpour, A., et al. Chicken interspecies chimerism unveils human pluripotency. Stem Cell Reports. 16 (1), 39-55 (2021).
  14. Kulesa, P. M., Morrison, J. A., Bailey, C. M. The neural crest and cancer: A developmental spin on melanoma. Cells Tissues Organs. 198 (1), 12-21 (2013).
  15. Hendrix, M. J. C., et al. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 246-255 (2007).
  16. Singer, N. G., Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of inflammation. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6, 457-478 (2011).
  17. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  18. Griffin, M. D., et al. Concise review: Adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: How well are we joining the dots. Stem Cells. 31 (10), 2033-2041 (2013).
  19. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposium. 136, 42-60 (1988).
  20. Bianco, P., Robey, P. G., Saggio, I., Riminucci, M. "Mesenchymal" stem cells in human bone marrow (skeletal stem cells): A critical discussion of their nature, identity, and significance in incurable skeletal disease. Human Gene Therapy. 21 (9), 1057-1066 (2010).
  21. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  22. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  23. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: Localization, morphology and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  24. Zannettino, A. C. W., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214 (2), 413-421 (2008).
  25. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  27. Baptista, L. S., et al. marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: How close are they. Journal of Stem Cells. , 73-90 (2007).
  28. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS ONE. 8 (12), 84206(2013).
  29. Cordeiro, I. R., et al. Chick embryo xenograft model reveals a novel perineural niche for human adipose-derived stromal cells. Biology Open. 4 (9), 1180-1193 (2015).
  30. Santos, R. deA., et al. Intrinsic angiogenic potential and migration capacity of human mesenchymal stromal cells derived from menstrual blood and bone marrow. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 1-23 (2020).
  31. Menezes, A., et al. Live cell imaging supports a key role for histone deacetylase as a molecular target during glioblastoma malignancy downgrade through tumor competence modulation. Journal of Oncology. 2019, 9043675(2019).
  32. Brito, J. M., Teillet, M. A., le Douarin, N. M. Induction of mirror-image supernumerary jaws in chicken mandibular mesenchyme by Sonic Hedgehog-producing cells. Development. 135 (13), 2311-2319 (2008).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments JoVE. (51), e2720(2011).
  34. de Barros, A. P. D. N., et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 5 (2), 9093(2010).
  35. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1951).
  36. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  37. Tickle, C. How the embryo makes a limb: Determination, polarity and identity. Journal of Anatomy. 227 (4), 418-430 (2015).
  38. Couly, G., Grapin-Botton, A., Coltey, P., le Douarin, N. M. The regeneration of the cephalic neural crest, a problem revisited: The regenerating cells originate from the contralateral or from the anterior and posterior neural fold. Development. 122 (11), 3393-3407 (1996).
  39. Walker, J. A., et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 315 (1), 122-128 (2003).
  40. Steck, E., Burkhardt, M., Ehrlich, H., Richter, W. Discrimination between cells of murine and human origin in xenotransplants by species specific genomic in situ hybridization. Xenotransplantation. 17 (2), 153-159 (2010).
  41. Sams, A., Davies, F. M. R. Commercial varieties of nuclear fast red. Stain Technology. 42 (6), 269-276 (1967).
  42. Lison, L. Alcian blue 8 g with chlorantine fast red 5 B. A technic for selective staining of mucopolysaccharides. Biotechnic and Histochemistry. 29 (3), 131-138 (1954).
  43. Cordaux, R., Batzer, M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 691-703 (2009).
  44. Brüstle, O., et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats. Nature Biotechnology. 16 (11), 1040-1044 (1998).
  45. Warncke, B., Valtink, M., Weichel, J., Engelmann, K., Schäfer, H. Experimental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation - Unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridisation of human-specific Alu sequences. Virchows Archiv. 444 (1), 74-81 (2004).
  46. Kasten, P., et al. Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier. Biomaterials. 26 (29), 5879-5889 (2005).
  47. Baptista, L., et al. Adipose tissue of control and ex-obese patients exhibit differences in blood vessel content and resident mesenchymal stem cell population. Obesity Surgery. 19 (9), 1304-1312 (2009).
  48. Christ, B., Huang, R., Scaal, M. Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anatomy and Embryology. 208 (5), 333-350 (2004).
  49. Scaal, M., Christ, B. Formation and differentiation of the avian dermomyotome. Anatomy and Embryology. 208 (6), 411-424 (2004).
  50. Tucker, G. C., Delarue, M., Zada, S., Boucaut, J. C., Thiery, J. P. Expression of the HNK-1/NC-1 epitope in early vertebrate neurogenesis. Cell and Tissue Research. 251 (2), 457-465 (1988).
  51. Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G., le Douarin, N. M. Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4843-4847 (2004).
  52. Charrier, J. B., Lapointe, F., le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development. 129 (20), 4785-4796 (2002).
  53. Kordes, U., Cheng, Y. C., Scotting, P. J. Sox group e gene expression distinguishes different types and maturational stages of glial cells in developing chick and mouse. Developmental Brain Research. 157 (2), 209-213 (2005).
  54. Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., Mundlos, S. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Developmental Biology. 245 (1), 95-108 (2002).
  55. Grottkau, B. E., Lin, Y. Osteogenesis of adipose-derived stem cells. Bone Research. 1 (2), 133(2013).
  56. Culling, C. F. A. Handbook of histopathological and histochemical techniques. Including museum techniques. , Elsevier. (1974).
  57. Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P. M., Tickle, C. Bone morphogenetic proteins and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb. Development. 120 (1), 209-218 (1994).
  58. Huber, K., et al. Persistent expression of BMP-4 in embryonic chick adrenal cortical cells and its role in chromaffin cell development. Neural Development. 3, 28(2008).
  59. Pouget, C., Gautier, R., Teillet, M. A., Jaffredo, T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development. 133 (6), 1013-1022 (2006).
  60. Kirby, M. L., Hutson, M. R. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adhesion and Migration. 4 (4), 609-621 (2010).
  61. Isern, J., et al. The neural crest is a source of mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell niche function. eLife. 3, 03696(2014).
  62. Yamazaki, S., et al. Nonmyelinating schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell. 147 (5), 1146-1158 (2011).
  63. Carr, M. J., et al. Mesenchymal precursor cells in adult nerves contribute to mammalian tissue repair and regeneration. Cell Stem Cell. 24 (2), 240-256 (2019).
  64. Walker, J. A., et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Analytical Biochemistry. 316 (2), 259-269 (2003).
  65. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  66. Yong, K. S. M., Her, Z., Chen, Q. Humanized mice as unique tools for human-specific studies. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 66 (4), 245-266 (2018).
  67. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
  68. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  69. Puente, B. N., et al. The oxygen-rich postnatal environment induces cardiomyocyte cell-cycle arrest through DNA damage response. Cell. 157 (3), 565-579 (2014).
  70. Colton, C. K. Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplantation. 4 (4), 415-436 (1995).
  71. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Situ HybridizationAlu

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.