הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

In Vivo שליטה אופטוגנטית אלחוטית בהתנהגות מוטורית מיומנת

3.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63082

⸱

22 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Cellular Physiology, National University of Mexico, 2Department of Neurosurgery, Stanford University, 3Facultad de Psicologia, National University of Mexico, 4Brain Mechanisms for Behaviour Unit, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש באופטוגנטיקה אלחוטית בשילוב עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת הושטת יד לתפיסה של כדור יחיד כדי לאפיין את המעגלים העצביים המעורבים בביצוע ההתנהגות המוטורית המיומנת בעכברים הנעים בחופשיות.

תקציר

מיומנויות מוטוריות עדינות חיוניות בחיי היומיום ועלולות להיפגע במספר הפרעות במערכת העצבים. הרכישה והביצוע של משימות אלה דורשות אינטגרציה חושית-מוטורית וכרוכות בשליטה מדויקת על מעגלי המוח הדו-צדדיים. יישום פרדיגמות התנהגותיות חד-ממדיות במודלים של בעלי חיים ישפר את הבנת התרומה של מבני מוח, כמו הסטריאטום, להתנהגות מוטורית מורכבת מכיוון שהוא מאפשר מניפולציה ורישום של פעילות עצבית של גרעינים ספציפיים בתנאי בקרה ומחלות במהלך ביצוע המשימה.

מאז הקמתה, אופטוגנטיקה הייתה כלי דומיננטי לחקירת המוח על ידי כך שהיא מאפשרת הפעלה או עיכוב סלקטיביים וממוקדים של אוכלוסיות נוירונים. השילוב של אופטוגנטיקה עם מבחנים התנהגותיים שופך אור על המנגנונים הבסיסיים של תפקודי מוח ספציפיים. מערכות אלחוטיות המותקנות על הראש עם דיודות פולטות אור ממוזערות (LED) מאפשרות שליטה אופטוגנטית מרחוק בחיה הנעה בחופשיות לחלוטין. זה מונע את המגבלות של מערכת קווית להיות פחות מגבילה להתנהגות של בעלי חיים מבלי להתפשר על יעילות פליטת האור. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישה של אופטוגנטיקה אלחוטית עם צילום וידאו במהירות גבוהה במשימת מיומנות חד-ממדית כדי לנתח את התרומה של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות להתנהגות מוטורית עדינה.

מבוא

התנהגות מוטורית מיומנת קיימת במהלך רוב התנועות המבוצעות על ידינו, וידוע שהיא מושפעת ממספר הפרעות מוחיות 1,2,3,4,5,6. יישום מטלות המאפשרות לימוד ההתפתחות, הלמידה והביצועים של תנועות מיומנות הוא חיוני להבנת היסודות הנוירוביולוגיים של התפקוד המוטורי, במיוחד במודלים של פגיעה מוחית, הפרעות נוירודגנרטיביות ונוירו-התפתחותיות 2,7,8,9,10,11,12,13 . הושטת יד ושליפת חפצים נעשית באופן שגרתי בפעולות בחיי היומיום, וזו אחת המיומנויות המוטוריות הראשונות שנרכשו במהלך ההתפתחות המוקדמת ולאחר מכן זוקקו במהלך השנים 5,6. הוא כולל התנהגות מורכבת הדורשת תהליכים חושיים-מוטוריים כגון תפיסת תכונות האובייקט, תכנון תנועה, בחירת פעולה, ביצוע תנועה, תיאום גוף וויסון מהירות 7,14,15,16. לפיכך, משימות חד-ממדיות של מיומנות גבוהה דורשות השתתפות של מבנים מוחיים רבים של שתי ההמיספרות 16,17,18,19,20,21,22. בעכברים, משימת ההגעה לתפיסת הכדורית הבודדת מאופיינת עבור מספר שלבים שניתן לשלוט בהם ולנתח אותם בנפרד 7,13,23. תכונה זו מאפשרת לחקור את התרומה של תת-אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בשלבים שונים של ביצועי רכישה והתנהגות ומספקת פלטפורמה למחקרים מפורטים של מערכות מוטוריות 13,23,24. התנועה מתרחשת תוך מספר שניות; לפיכך, יש להשתמש בצילום וידאו במהירות גבוהה לניתוח קינמטי בשלבים נפרדים של המסלול המוטורי המיומן 7,25. ניתן לחלץ מספר פרמטרים מהסרטונים, כולל תנוחת הגוף, מסלול, מהירות וסוג השגיאות25. ניתן להשתמש בניתוח קינמטי כדי לזהות שינויים עדינים במהלך מניפולציה אופטוגנטית אלחוטית 7,23.

שימוש בדיודות פולטות אור ממוזערות (LED) להעברת אור באמצעות מערכת אלחוטית המותקנת על הראש מאפשר שליטה אופטוגנטית מרחוק בזמן שהחיה מבצעת את המשימה. הבקר האופטוגנטי האלחוטי מקבל פקודות טריגר בפולס יחיד או רציף ממריץ ושולח אותות אינפרא אדום (IR) למקלט המחובר ל-LED23,26 הממוזער. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישה זו של אופטוגנטיקה אלחוטית עם צילום וידאו במהירות גבוהה של משימת מיומנות כדי לנתח את התפקיד של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות במהלך הביצועים של התנהגות מוטורית עדינה23. מכיוון שמדובר במשימה חד-ממדית, היא מאפשרת להעריך את השתתפותם של מבנים בשתי ההמיספרות. באופן מסורתי, המוח שולט בתנועת הגוף באופן אסימטרי מאוד; עם זאת, משימות מיומנות גבוהה דורשות תיאום ושליטה קפדניים ממבנים מוחיים רבים, כולל גרעינים איפסילטרליים ותרומה דיפרנציאלית של תת-אוכלוסיות עצביות בתוך גרעינים 10,20,21,22,23. פרוטוקול זה מראה כי מבנים תת-קורטיקליים משתי ההמיספרות שולטים במסלול של הפורלימב23. פרדיגמה זו יכולה להתאים לחקר אזורים אחרים במוח ומודלים של מחלות מוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים הכרוכים בשימוש בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מקומיות ולאומיות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול IACUC של המכון לפיזיולוגיה תאית IACUC VLH151-19). Drd1-Cre עכברים זכרים מהונדסים27, 35-40 יום לאחר הלידה עם רקע C57BL/6 שימשו בפרוטוקול הנוכחי. עכברים הוחזקו בתנאים הבאים: טמפרטורה 22±1 מעלות צלזיוס; לחות 55%; לוח זמנים אור 12/12 שעות עם אורות כבויים בשעה 19:00 ונגמלו ביום שלאחר הלידה 21. גורים נגמלים שוכנו בקבוצות חד-מיניות של 2-5. בעלי חיים שוכנו בדיור סטטי עם צמרות מיקרו-מחסום. המצעים כללו שבבי אספן סטריליים. כדורי מכרסמים ומים מטוהרים ב-RO סופקו עד ליביטום, למעט כאשר צוין אחרת.

1. הליכים כירורגיים

  1. הכינו צינורית לד באורך הרצוי בהתאם לקואורדינטות הגב-ונטרליות של מבנה העניין (באופן אידיאלי 0.5 מ"מ יותר כדי להסביר את עובי הגולגולת, עבור הסטריאטום הגבי 3.5 מ"מ) (איור 1).
    1. חותכים את סיבי הזכוכית לאורך ארוך יותר מהגודל הסופי הרצוי, טוחנים את קצה הסיבים לאורך המטרה עם נייר זכוכית מחוספס, ולבסוף, מלטשים את קצה הסיבים בנייר זכוכית עדין.
      הערה: צינורית LED היא סיב אופטי מזכוכית בקוטר 250 מיקרומטר המחובר למקלט אינפרא אדום (ראה טבלת חומרים).
  2. משכו פיפטות זכוכית (קוטר חיצוני של 1.14 מ"מ, קוטר פנימי של 0.53 מ"מ ואורך של 3.5 אינץ') עבור הננו-מזרק עם מושך אופקי (ראו טבלת חומרים) ואחסנו אותן למועד מאוחר יותר. תכנת את המושך בלולאה אחת כדי לקבל קוטר קצה של 15-20 מיקרומטר עם מתחדד שיפוע הדרגתי ארוך (4-5 מ"מ).
  3. הכינו את אזור הניתוח על ידי חיטוי יסודי של המנגנון הסטריאוטקסי, מכסה המנוע, המיקרו-מזרק (ראו טבלת חומרים) והמשטחים הסובבים אותם עם 70% אתנול.
    הערה: מנגנון סטריאוטקסי של עכבר הוא חיוני כדי להזריק וירוס הקשור ל- Adeno (AAVs) במדויק ולמקם את צינורית ה- LED באזור העניין.
  4. לבשו את ציוד המגן האישי המתאים להליך, כולל מעיל מעבדה נקי או שמלת ניתוח חד פעמית, כפפות סטריליות, מסכת פנים וכובע ראש חד פעמי.
  5. הניחו את הציוד הדרוש קרוב לאזור הניתוח, כגון כלי ניתוח סטריליים, קצוות כותנה, תמיסות, מיקרופיפט, קצות פיפטה, נימים, מיקרו מילוי בשמן מינרלי וטוש.
  6. ממלאים פיפטה למיקרו-מזרקים בשמן מינרלי ומניחים אותה במיקרו-מזרק. ודא שהמיקרו-מזרק פועל כראוי על ידי הוצאת שמן מינרלי כלשהו.
    הערה: כל המכשירים המשמשים במהלך הניתוח צריכים להיות אוטוקלבים וסטריליים. יש להשתמש בטכניקה אספטית.
  7. מרדימים בעלי חיים עם איזופלורן גזי 4-5% כדי לגרום להרדמה ו-1.2% במהלך הניתוח עם חמצן טהור של 0.5-1 ליטר לדקה. הניתוח מתחיל רק לאחר שהחיה הגיעה לנקודה של הרדמה עמוקה, המוערכת על ידי היעדר נסיגה מכפה לאחר צביטה קלה.
    1. ניטור רציף של קצב הנשימה והטמפרטורה של החיה. שמרו על טמפרטורת הגוף על ידי כרית חימום שנקבעה על 34 מעלות צלזיוס.
  8. יש למרוח משחה אופתלמית. מסירים את השיער מהקרקפת עם קוצץ וקרם להסרת שיער. נגבו את הקרקפת עם צמר גפן עם 8% פובידון-יוד (ראו טבלת חומרים) ו-70% אתנול לסירוגין שלוש פעמים כל אחת.
  9. מניחים את העכבר במנגנון הסטריאוטקסי ומאבטחים את הראש, ומבטיחים שהגולגולת תיישר בצירים הבינוניים והקדמיים-אחוריים.
  10. בצע חתך של 1 ס"מ עם אזמל דרך הקרקפת ברמת העיניים לאורך ציר הסגיטל. נסוגו מהעור כדי לחשוף את הגולגולת ולנקות את הפריוסטאום עם צמר גפן.
  11. נקו את משטח הגולגולת עם תמיסה מלוחה ומטושים מכותנה סטרילית. פתרו כל דימום על פני השטח באמצעות חניתות עיניים סופגות סטריליות (ראו טבלת חומרים) או חומר סופג סטרילי דומה.
  12. יש למרוח טיפה של 2.5% מי חמצן עם מטוש צמר גפן ולתת לו לפעול במשך כמה שניות כדי להפוך את התפרים של הגולגולת גלויים ויש להם התייחסות טובה יותר. לאחר מספר שניות, יש לנקות ביסודיות בעזרת צמר גפן נקייה.
  13. עם פיפטת הזכוכית (קוטר קצה סופי של 15 מיקרומטר), אתרו את הברגמא והמבדה כדי לבדוק שהגולגולת מפולסת בציר הקדמי-אחורי.
    הערה: מומלץ להשתמש במיקרוסקופ סטריאוסקופי או במיקרוסקופ USB כדי לראות את קצה פיפטת הזכוכית. במקרה הצורך, התאם את גובה מחזיק הפה כדי ליישר את הגולגולת.
  14. הזז את הנימים לכיוון הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות (AP) והמדיאליות-רוחביות (ML) שנבחרו (ML) (סטריאטום דורסולטרלי AP 1.2 מ"מ, ML 2.28 מ"מ). ציירו נקודת ייחוס בקרקפת מעל הקואורדינטות שנבחרו באמצעות סמן סטרילי.
  15. בנקודת הייחוס, בצעו כריתת גולגולת בקוטר של כ-1 מ"מ המפעילה לחץ עדין על הגולגולת באמצעות כלי סיבובי סטרילי או מקדחה דנטלית במהירות נמוכה עד בינונית עם מקדחה דנטלית עגולה קטנה (ראו טבלת חומרים).
  16. טען את הנימים עם 300-400 nL של נגיף הקשור לאדנו תלוי Cre (AAV) כגון AAV1-dflox-hChR-2-mCherry כדי להביע Channelrhodopsin או AAV כדי לבטא רק את חלבון הכתב (למשל, mCherry) כבקרה באזור העניין (ראה טבלת חומרים). בדוק כי הקצה אינו סתום, ולאחר מכן להציג את פיפטת הזכוכית במוח בקואורדינטות dorso-ventral (DV) הרצוי (dorsolateral striatum DV -3.35 מ"מ).
    1. הזריקו 200 nL באמצעות מזרק אוטומטי בקצב של 23 nL/s. המתן 10 דקות לאחר סיום ההזרקה, משך את פיפטת הזכוכית באיטיות כדי למנוע שפיכה.
      הערה: ניתן להשתמש במחט של 30 גרם כדי להזריק עם המיקרו-מזרק המתאים.
  17. מנקים ומייבשים את כל השאריות עם צמר גפן.
  18. חברו את צינורית ה-LED הסטרילית מזכוכית סטרילית לזרוע הסטריאוטקסית וכיילו את הקואורדינטות באמצעות bregma כהפניה. הכניסו את הצינורית לאט מאוד (300 מיקרומטר/דקה) כדי למנוע נזק לרקמות והניחו אותה 100 מיקרומטר מעל אתר ההזרקה.
  19. לאחר שצינורית ה-LED נמצאת במקומה, הוסיפו טיפה (100 μL) של דבק רקמה בקצה הגולגולת.
  20. הכינו תערובת מלט דנטלית (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן לקבע את הסיבים לגולגולת.
    הערה: בקצרה, השתמש בצלחת חרסינה מצוננת כדי לקבל יותר זמן עבודה לפני שמלט מתייצב. מוסיפים 2 כפות של אבקת שרף צלולה לצלחת החרסינה, מוסיפים 4 טיפות של בסיס מהיר וטיפה אחת של זרז, ואז מערבבים היטב. ניתן לכוונן את יחס האבקה/נוזל אם יש צורך בצמיגות דקה יותר או עבה יותר.
  21. באמצעות מברשת סטרילית, יש למרוח את תערובת הבטון הדנטלית סביב מחבר הצינורית לאט לאט, ולבנות שכבות עד שהגולגולת מכוסה והמחבר מחובר היטב לגולגולת, ומשאיר את הפינים חופשיים לחלוטין. הימנע מקבלת מלט שיניים על העור של העכבר.
  22. אפשרו ייבוש מלא.
  23. סגרו את העור סביב השתל באמצעות דבק רקמה (ראו טבלת חומרים).
  24. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות מעל כרית חימום בטמפרטורה של 33° צלזיוס. עקבו אחר נוכחותם של אחד או יותר מהסימנים הבאים של כאב/אי נוחות: 1) צפיפות, חוסר או הפחתה של פעילות מוטורית, 2) אי-חתן משתקף בפרווה מלוכלכת לא מטופחת, 3) ליקוק או גירוד מוגזמים, אדמומיות באתר החתך, 4) התנהגות תוקפנית, 5) אנורקסיה או התייבשות, ו-6) חוסר היווצרות קן.
    הערה: שמור את העכבר בכלוב בנפרד במהלך כל ההליכים כדי למנוע ניתוק שתלים. במקרה של ניתוק הצינורית, יש לבצע המתת חסד על ידי הזרקת 150 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל ולאחר מכן עריפת ראשים לאחר הגעה להרדמה עמוקה.
  25. יש להזריק באופן תת עורי (SC) מלוקסיקם במינון של 1 מ"ג/ק"ג פעם ביום במשך שלושה ימים לאחר הניתוח כדי לספק משכך כאבים.
  26. המתן לפחות 7 ימים להחלמה מלאה ו-14 יום לביטוי אופסין לפני הליכים נוספים.
    הערה: בצע מעקב לאחר הניתוח כל 12 שעות במשך שלושה ימים, ולאחר מכן בדוק בעלי חיים כל יום עד יום המתת החסד בסוף הניסוי.

2. אימון הגעה לתפיסה

  1. ביום 7 לאחר הניתוח, התחל את פרוטוקול מניעת המזון28. שקלו את העכברים במשך שלושה ימים רצופים כדי לקבוע את משקל הגוף הממוצע שלהם. לאחר מכן, קבעו הגבלות מזון כך שבעלי החיים יקבלו מספיק חומרים מזינים כדי לשמור על כ-90% ולא פחות מ-85% ממשקל הגוף.
    הערה: זה מושג על ידי מתן 2.5-3 גרם של מזון מדי יום. עקוב אחר משקלם של בעלי החיים מדי יום וציון לרווחתם הכללית תוך התבוננות בהתנהגותם ובמראהם של בעלי החיים, לדוגמה, מראה הפרווה והעיניים. השתמש במערכת הניקוד של מצב הגוף מתוך הפניה29.
  2. במהלך האימונים, האימונים והבדיקות, ספקו לכל עכבר 20 כדורים (20 מ"ג של כדורי שוקולד נטולי אבק) מדי יום (ראו טבלת חומרים) (הנאכלים במהלך המשימה או אחריה) מלבד כדורי המזון הסטנדרטיים.
  3. שלושה ימים לפני ההמלטה, מפזרים 0.4 גרם/חיה/יום 20 מ"ג של כדורים נטולי אבק בטעם שוקולד בכלובים הביתיים שלהם, כדי שהעכברים יכירו את הכדורים המשמשים כפרס במהלך משימת ההגעה לתפיסתם.
  4. התרגלו לעכברים על ידי הנחתם 10 דקות בתא הבדיקה יום אחד לפני האימון המקדים עם כדורים מפוזרים על רצפת התא (איור 1A).
  5. אפשרו אוכל מדי יום לאחר האימון והבדיקות. שמרו על לוח זמנים דומה בכל יום.
  6. ביום הראשון של טרום האימון, הניחו את העכברים בתא ההגעה לתפיסתם והתבוננו מהחזית. מניחים את הכדורים מול החדר קרוב לפתח, כך שהם מתחילים לצרוך את הכדורים. בשלב זה, עכברים מורשים לתפוס את הכדורים בכל צורה שהיא.
  7. ביום השני של האימון המקדים, הניחו את הכדורים רחוק יותר ויותר מהפתח עד שיעבירו אותם לכניסה (1 ס"מ מהפתח) כדי שהעכברים יוכלו לעצב את תנועת ההגעה שלהם לתפיסתם (איור 1C).
  8. לאמן עכברים לרוץ לחלק האחורי של הכלוב ולחזור לפתח הכלוב כדי לקבל את גלולת המזון הבאה כאסטרטגיה להתאמה אישית של הניסויים.
    הערה: ניתן להשיג זאת על ידי המתנה עד שהעכבר נמצא בחלק האחורי של הכלוב לפני הנחת כדור בהזחה עבור כל ניסוי.
  9. הניחו כדורים כדי להיאחז בכפותם הימנית או השמאלית.
    הערה: עכברים מתחילים להשתמש באופן מועדף בכפה אחת כדי לתפוס, אשר תשמש בימים הבאים של אימון ובדיקה.
  10. לאמן בעלי חיים במשך 6 ימים במפגשים יומיים שנמשכים 20 ניסויים או עד לחלוף 10 דקות לכל היותר. מהיום השני של האימון, שים את המקלט המדומה (מידות 12 x 18 x 7 מ"מ, 1 גרם, ראה טבלת חומרים), כך שעכברים רגילים למשקל בזמן ביצוע המשימה (איור 1B). בכל יום יש להבקיע את מספר הניסיונות שנפגעו וההחמצות.
  11. תעד התנהגות באמצעות מצלמה רגילה וצלם 30-60 פריימים לשנייה מחזית החדר. בנוסף, ניתן להציב מראה מתחת לתא האימונים בזווית של 45° כדי לנטר את תנוחת החיות (איור 1D,E).
  12. לצורך ניתוח קינמטי לאחר הוק (איור 2), הרכיבו מצלמה במהירות גבוהה (ראו טבלת חומרים) בזווית של 45° כדי להקליט מצד הכלוב. אם נדרש ניתוח תלת-ממדי, הצב מצלמה שנייה במהירות גבוהה כדי להקליט בזווית של 35° מחזית התא; שתי המצלמות צריכות להיות ממוקמות בצד ימין או שמאל של הכלוב בהתאם לצדיות של בעלי החיים, ועליהן ללכוד באותו קצב פריימים ולהיות מסונכרנות7 (איור 3D,E).
  13. הגדר את המצלמות במהירות גבוהה ל- 100 פריימים לשנייה ברזולוציה של 376 x 252 פיקסלים או יותר במידת האפשר. הניחו קירות קלקר לבנים מאחורי הצדדים והאחוריים של החדר כדי להפחית את הרקע ולהגביר את הניגודיות (איור 1E).
  14. ביום הבדיקה, החליפו את יחידת הדמה במקלט אינפרה-אדום לגירוי אופטוגנטי אלחוטי (איור 1B,C).
  15. כאשר עכברים מתחילים להגיע, סובבו את צינורית ה-LED באופן ידני עם השלט הרחוק כדי שיהיה גירוי רציף לזמן ביצוע ההתנהגות ולמשך לא יותר מ-2 שניות. תכנות פרדיגמת גירוי אוטומטי עדיף. התקן הגירוי מפעיל נורית LED של 470 ננומטר (אור כחול) בעוצמה של 1.0 mW/mm2.
  16. אסוף את הסרטונים לבדיקה נוספת, כולל ניקוד וניתוח קינמטי.

3. אישור היסטולוגי לאחר הוק

  1. עם השלמת הניסוי, אשרו ביטוי נגיפי ומיקום צינורית LED. מרדימים את החיה בקוקטייל של קטמין 100 מ"ג/ק"ג וקסילזין 10 מ"ג/ק"ג. ברגע שהעכבר מציג סימנים של הרדמה עמוקה (שלב 1.7), מנקבים עם מלוחים בעלי מאגר פוספט קר כקרח (PBS) ואחריו 4% PFA.
  2. יש להסיר בזהירות את הצינורית המושתלת על ידי אחיזה חזקה במחבר עם מלקחיים ומשיכתו למעלה בעדינות.
  3. הוציאו וקבעו לאחר מכן את המוח במשך 24 שעות ב-4% PFA23.
  4. בצע שטיפות של 3-10 דקות עם PBS.
  5. חותכים את המוח למקטעים של 50 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום (ראו טבלת חומרים).
  6. הרכיבו את המקטעים בשקופיות עם מדיית הרכבה קשיחה עם DAPI כדי להכתים גרעינים ולכסות שקופיות.
  7. לאחר הייבוש, התבוננו בקטעים שמתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי וודאו את מיקום הצינורית המושתלת ואת הביטוי של Ch2R שהתמזג עם כל חלבון פלואורסצנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטלת Reach-to-grasp היא פרדיגמה המשמשת באופן נרחב לחקר עיצוב, למידה, ביצועים וקינמטיקה של תנועת מיומנות עדינה תחת מניפולציות ניסיוניות שונות. עכברים לומדים לבצע את המשימה תוך מספר ימים ולהשיג דיוק של יותר מ-55% ולהגיע למישור לאחר 5 ימי אימון (איור 2A,B). בדומה למה שדווח בעבר, אחוז מבעלי החיים אינם מבצעים את המשימה כראוי (29.62%), ויש לכלול אותם מניתוח נוסף30. אלה כוללים תת-קבוצה של עכברים שאינם לומדים (6/54 עכברים, 11.1%) שמתחילת האימון מפספסים את המט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השימוש במניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות נוירונים בפרדיגמות התנהגותיות מוגדרות היטב מקדם את הידע שלנו על המנגנונים העומדים בבסיס הבקרה המוטורית 7,23. שיטות אלחוטיות מתאימות במיוחד למשימות הדורשות ניסויים על מספר בעלי חיים או תנועה חופשית34,35. עם זאת, ככל שהטכניקות והמכשירים משתכללים, זו צריכה להיות האפשרות המועדפת על כל משימה התנהגותית בשילוב עם אופטוגנטיקה34,36

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין גילויים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט UNAM-PAPIIT IA203520. אנו מודים למתקן בעלי החיים של IFC על עזרתם בתחזוקת מושבות עכברים וביחידה החישובית לתמיכת IT, במיוחד לפרנסיסקו פרז-יוג'ניו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכונת הרדמהRWDR583Sוופורייזר איזופלורן
אנסקטPiSAקטמין
לוח לחםThorlabsMB3090/Mלחם אופטי אלומיניום מוצק
עדשת מצלמהCanon50mmf / 1.4 עדשות פוקוס ידני (c-mount)
מערכת מצלמהBrainVisionMiCAM02בקר מצלמה ו סנכרון
צמר גפן תמיסת
CS תמיסתנתרן כלורי PiSA
תא אימון מותאם אישיתביתית
#105Dremel2 615 010 5AEחותך חריטה
כדורי שוקולד ללא אבקBio-ServF05301
אלכוהול אתיליJ. T.  Baker9000-02אתנול
EyespearsUltracell40400-8Eyespears מחומר PVA סופג
FlurisoVetOneV1 502017-250נימי זכוכית איזופלורן
Drumond Scientific3-000-203-G/Xפיפטות עבור NanoJect II
הידרוגן מי חמצןFarmacomאנטיספטי
מצלמה במהירות גבוההBrainVisionMiCAM02-CMOSמונוכרום מצלמות מהירות
אינפרא אדוםפולט טלאופטו
מזרק
LED צינוריתטלאופטוTelC-C-L-Dצינורית LED 250um 487nm אור
Micropipette 10uL EppendorfZ740436
חולץ מיקרו-פיפטהSutterP-87חולץ אופקי
מיקרוסקופ LSM780Zeissמיקרוסקופ קונפוקלי
מיקרוטום
מקלט מדומהTeleopto
NanoJect IIDrumond Scientific3-000-204מיקרו מזרק
מיכל חמצןאינפרא אדום
(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpAAddgene20297וקטור ויראלי לביטוי ChR-2
Parafilm
ParaformaldehydeSigmaP-6148
מאגר מלח פוספטSigmaP-4417טבליות חיץ מלח פוספט
קצות פיפטה 10 uLThermoFisherAM126350.5-10 uL  נפח
PisabentalPiSAנתרן pentobarbital
פרספקסמסחריאקריליק גיליון
Povidone יודFarmacomאנטיספטי
פרוצ'יןPiSAXylacine
PuralubePerrigo pharma1228112חומר סיכה לעיניים 15% שמן מינרלי/85% וזלין
כלי סיבוביKmoonמיני מטחנהסטנדרטי
אזמל
להב
מכשיר סטריאוטקסיStoelting51730Dמכשיר דיגיטלי
סופר-בונד C& Bשמש רפואישיניים צמנט
כירורגי חד פעמי כובע
טלאופטו שלט רחוק Teleopto
Tg Drd1-Cre קו עכברGensat036916-UCDהחדרת טרנסגן FK150Gsat
דבק רקמות3M Vetbond1469SB
TPI Vibratome 1000 פלוסPeico
מדיית הרכבה Microtome Vectashield עם מעבדות DAPIוקטורH-1200מדיית הרכבה
מקלט אלחוטיTeleoptoTELER-1-P
לוח 9% מקדחה אינסולין ו-pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2אזמל

מקורות

  1. Balbinot, G., et al. Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans. Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).
  2. Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).
  3. MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats. Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).
  4. Evenden, J. L., Robbins, T. W. Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat. Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).
  5. Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder. Frontiers in Psychology. 9, 2720(2019).
  6. Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41(2018).
  7. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  8. Marques, J. M., Olsson, I. A. Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task. Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).
  9. Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments. The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).
  10. Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. Neural coordination during reach-to-grasp. Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).
  11. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  12. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  13. Ian, Q. W., Sergio, M. P. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).
  14. Proske, U., Gandevia, S. C. The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force. Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).
  15. Yttri, E. A., Dudman, J. T. Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia. Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).
  16. Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. Primary motor cortex is involved in bimanual coordination. Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).
  17. Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions. The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).
  18. d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior. Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).
  19. Fattori, P., et al. Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A. The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).
  20. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization. PLoS One. 6 (3), 17742(2011).
  21. vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers. Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).
  22. Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity. Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).
  23. Lopez-Huerta, V. G., et al. Striatal bilateral control of skilled forelimb movement. Cell Reports. 34 (3), 108651(2021).
  24. Lopez-Huerta, V. G., et al. The neostriatum: two entities, one structure. Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).
  25. Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. Online control of reach accuracy in mice. Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).
  26. Jaidar, O., et al. Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice. European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).
  27. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  28. Rowland, N. E. Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry. Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).
  29. Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  30. Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e51238(2014).
  31. Fink, A. J., et al. Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement. Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).
  32. Li, Q., et al. Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer. Nature Communication. 8, 15834(2017).
  33. Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. Microstimulation activates a handful of muscle synergies. Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).
  34. Miyazaki, T., et al. Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles. Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).
  35. Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).
  36. Kampasi, K., et al. Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis. Scientific Reports. 6, 30961(2016).
  37. Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments. Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).
  38. Packer, A. M., et al. Nature Methods. 9, 1202-1205 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אופטוגנטיקה אלחוטיתמיומנויות מוטוריות עדינותוידאו בצילום מהירמשימה של זריזות יד אחתנוירוני השלכה קוצים D1ניתוח סטריאוטקסיביטוי של Channelrhodopsinמשימת הגעה ותפיסהמעגלי הסטריאטום
In Vivo שליטה אופטוגנטית אלחוטית בהתנהגות מוטורית מיומנת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.