Method Article

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה חשובים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות רבות. שינויים בנפח המיטוכונדריה, בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), בייצור מיטוכונדריאלי של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובמספר העתק הדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) הם לעתים קרובות מאפיינים של תהליכים אלה. דו"ח זה מפרט גישה חדשנית המבוססת על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. אסטרטגיה מבוססת זרימה זו משתמשת בתאים חיים למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP ורמות ROS, כמו גם בתאים קבועים כדי להעריך רכיבים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) וחלבונים הקשורים ל-mtDNA כגון גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM).

על ידי צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, כולל MitoTracker Green (MTG), טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE) ו-MitoSox Red, ניתן לכמת שינויים בנפח המיטוכונדריה, ב-MMP וב-ROS המיטוכונדריאלי וקשורים לתכולת המיטוכונדריה. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-יחידות מורכבות של MRC וטרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20 (TOMM20) מאפשרת הערכה של ביטוי תת-יחידות MRC. מכיוון שכמות ה-TFAM פרופורציונלית למספר העותקים של mtDNA, המדידה של TFAM ל-TOMM20 נותנת מדידה עקיפה של mtDNA לכל נפח מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע תוך 2-3 שעות. חשוב לציין שפרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים הנמצאים כמעט בכל התאים האאוקריוטים. המיטוכונדריה אחראים על אספקת האנרגיה על ידי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני ומשמשים כמתווכים מטבוליים לביוסינתזה ולחילוף חומרים. המיטוכונדריה מעורבת עמוקות בתהליכים תאיים חשובים רבים אחרים, כגון ייצור ROS, מוות של תאים וויסות תוך-תאישל Ca 2+. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD), אטקסיה של פרידריך (FRDA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)1. גם תפקוד לקוי מוגבר של המיטוכונדריה וחריגה ב-mtDNA נחשבים כתורמים להזדקנות האנושית 2,3.

סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים במחלות נוירודגנרטיביות, ושינויים בנפח המיטוכונדריה, דה-פולריזציה של MMP, ייצור ROS ושינויים במספר עותק mtDNA נפוצים 4,5,6,7. לכן, ליכולת למדוד תפקודים מיטוכונדריאליים אלה ואחרים יש חשיבות רבה כאשר חוקרים את מנגנוני המחלה ובודקים גורמים טיפוליים פוטנציאליים. יתר על כן, לאור היעדרם של מודלים חייתיים המשכפלים נאמנה מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות, הקמת מערכות מודל in vitro מתאימות המשחזרות את המחלה האנושית בתאי המוח היא צעד חשוב לקראת הבנה טובה יותר של מחלות אלה ופיתוח טיפולים חדשים 2,3,8,9.

ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי ליצור תאי מוח שונים, כולל תאים עצביים ולא עצביים (כלומר, תאי גליה), ונזק מיטוכונדריאלי הקשור למחלות נוירודגנרטיביות נמצא בשני סוגי התאים 3,10,11,12,13. שיטות מתאימות להתמיינות iPSC לשושלות עצביות וגליאליות זמינות14,15,16. תאים אלה מספקים פלטפורמה ייחודית לבני אדם/מטופלים למידול מחלות במבחנה ולבדיקת תרופות. יתר על כן, מכיוון שאלה נגזרים מחולים, נוירונים שמקורם ב- iPSC ותאי גליה מספקים מודלים של מחלות המשקפים את מה שקורה בבני אדם בצורה מדויקת יותר.

נכון להיום, קיימות מעט שיטות נוחות ואמינות למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים, במיוחד תאי עצב חיים ותאי גלייה. השימוש בציטומטריה של זרימה מספק למדען כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים ביולוגיים, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי, בתאים בודדים. פרוטוקול זה מספק פרטים ליצירת סוגים שונים של תאי מוח, כולל תאי גזע עצביים (תאי גזע עצביים), נוירונים ואסטרוציטים גליאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים, כמו גם גישות חדשניות המבוססות על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל iPSCs ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. הפרוטוקול מספק גם אסטרטגיית צביעה משותפת לשימוש בציטומטריה של זרימה למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP, רמת ROS מיטוכונדריאלית, מתחמי MRC ו- TFAM. על ידי שילוב מדדים של נפח או מסה מיטוכונדריאלית, פרוטוקולים אלה מאפשרים גם מדידה של הרמה הכוללת והרמה הספציפית לכל יחידת מיטוכונדריה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה המשלימה S1 לקבלת מתכונים של כל המדיות והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים לתאי NCS, נוירונים דופמינרגיים (DA) ואסטרוציטים

  1. הכינו צלחות מצופות מטריצה.
    1. להפשיר בקבוקון של 5 מ"ל של מטריקס על קרח לילה. יש לדלל 1 מ"ל של מטריצה עם 99 מ"ל של ה-F-12 של הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM/F12 מתקדם) (ריכוז סופי של 1%). הפוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C (70 °F).
    2. הפשירו את תמיסת המטריצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (שמרו על קור) וציפו 6 בארות (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
    3. מניחים את הלוח המצופה במטריצה באינקובטור אווירלח של 5% CO 2/95% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור ותנו לה להתאזן לטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: מומלץ להשתמש בצלחת תוך 3 ימים מיום הציפוי. עם זאת, צלחת מצופה ניתן לאחסן עד 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס. רק זכרו להוציא אותו ולתת לו להתחמם ל-RT לפני השימוש. לאחסון ממושך, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית iPSC לצלחת המצופה כדי למנוע ייבוש של המטריצה.
  2. הפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים
    1. מחממים את הלוחות המצופים במטריצה ב-RT או באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את הכמות הנדרשת של מדיום תרבות iPSC ב-RT.
    2. יש לערבב 6 מ"ל של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש עם 12 μL של מעכב Y-27632 ROCK כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
    3. הפשירו חלקית את הבקבוקון הקפוא של iPSCs בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שתישאר חתיכת קרח קטנה.
    4. הוסיפו באיטיות 1 מ"ל של תרבית iPSC שחוממה מראש עם 12 μL של מעכב ROCK טיפה לתאים. העבירו את תכולת הנוזל של הבקבוקון באמצעות iPSCs לבאר אחת של צלחת מצופה מראש בגודל 6 מ"ל באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
    5. הזיזו את הצלחת בכיוונים מאונכים כדי לערבב את תכולת הבאר והחזירו את הצלחת לאינקובטור. החליפו את מדיום תרבית ה-iPSC לאחר 24 שעות לאחר שטיפה עם תמיסת מלח (DPBS) של דולבקו (1x) (Ca 2+/Mg2+-free ) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      הערה: אין להוסיף מעכב ROCK להאכלות הבאות. שנה את מדיום תרבות ה- iPSC מדי יום.
  3. תת-תרבות של iPSCs
    1. מחממים את הלוחות המצופים במטריצה ב-RT או באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את הכמות הנדרשת של מדיום תרבות iPSC ב-RT.
    2. שאפו את מדיום התרבית מהצלחות המכילות את התאים. שטפו את תאי ה-iPSCs עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free ) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
    3. מוסיפים EDTA (0.5 מ"מ) (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). דוגרים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבות מתחילים להתרומם מהבאר (בדרך כלל 3-5 דקות). שאפו את ה- EDTA.
    4. הוסיפו מדיום תרבית iPSC שחומם מראש (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ונתקו בכוח את מושבות ה-iPSC באמצעות פיפטה סטרילית של 10 מ"ל פעם אחת. אין לבצע פיפטה למעלה ולמטה מכיוון שהדבר עלול לשבור גושים של תאים לתאים בודדים.
    5. מעבירים את תכולת כל באר לשתי בארות נפרדות בצלחת 6 בארות מצופה מטריצה (2 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אין ליצור בועות בהשעיה בזמן הפיפטציה.
      הערה: נערו את הצלחת בעדינות לפני שתשמרו אותה באינקובטור. יחס הפיצול יכול להיות 1:2 (באר אחת ל-2 בארות חדשות) ל-1:4 (אחת ל-4 בארות חדשות).
    6. החליפו את המדיום מדי יום עד שהמושבות יגיעו למפגש של 60% עם גודל וחיבורים טובים.
  4. אינדוקציה עצבית ויצירת אבות עצביים
    1. הכן 500 מ"ל של מדיום מוגדר כימית (CDM), 500 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבית (NIM), ו-500 מ"ל של מדיום ללא סרום תאי גזע עצביים (NSC SF).
    2. יש לשטוף את התאים עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף NIM (3 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). מוגדר כיום 0.
    3. החלף את ה- NIM (3 מ"ל לבאר בלוח של 6 בארות) ביום 1, יום 3 ויום 4 והתבונן מתחת למיקרוסקופיה מדי יום.
    4. ביום החמישי, נתקו את הרוזטות העצביות לתרבית מתלים כמתואר להלן.
      1. יש לשטוף פעם אחת בעדינות עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). מוסיפים קולגן IV (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ושומרים באינקובטור למשך דקה אחת. שאפו את הקולגן IV ושטפו פעם אחת עם DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) בעדינות.
      2. יש להוסיף 2 מ"ל של NSC SF Medium לכל באר לצלחת של 6 בארות. נתק את התאים על ידי גירוד תחתית הבארות על ידי ציור רשתות באמצעות קצה פיפטה של 200 μL.
      3. אספו את מתלה התאים מצלחת 6 הבארות לצלחת של 10 ס"מ שאינה דבקה. השלם את עוצמת הקול ל-12 מ"ל עם NSC SF Medium.
      4. יש לנער את המנה הלא דבקה ב-65-85 סל"ד על שייקר אורביטלי באינקובטור כדי למנוע צבירה.
  5. דיפרנציאציה של תאי עצב DA
    1. ביום 7, הוסיפו 12 מ"ל של CDM בתוספת 100 ng/mL גורם גדילה פיברובלסטי-8b (FGF-8b) והניחו את המנה על השייקר האורביטלי באינקובטור.
    2. בימים 8-13, לשנות את המדיום כל 2 ימים ולהתבונן תחת מיקרוסקופיה מדי יום.
    3. ביום ה-14, יש להוסיף 12 מ"ל של CDM בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b ו-1 μM פורמורפמין (PM). מניחים את המנה על השייקר האורביטלי באינקובטור.
    4. בימים 15-20, לשנות את המדיום כל 2 ימים ולבחון את התאים תחת מיקרוסקופיה מדי יום.
    5. מעבר מכני של הספירות באמצעות 1000 קצוות μL כדי לפרק את הספירות הגדולות יותר.
      הערה: היחס יכול להיות 1:2 (מנה אחת לתוך 2 מנות חדשות).
  6. הפסקת ההבחנה
    1. מצפים צלחת בת 6 בארות או מכסים בפולי-ל-אורניתין (אש"ף) ולמינין כמתואר להלן.
      1. מצפים צלחת של 6 בארות עם 1 מ"ל אש"ף לכל באר, ומדגרים את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לשאוף לפתרון אש"ף.
      2. יש לעקר את הצלחת תחת UV למשך 20 דקות. שטפו את הבארות פעמיים עם DPBS (1x) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
      3. יש להוסיף תמיסת למינין של 5 מיקרוגרם/מ"ל (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים. שאפו את הלמינין ושטפו את הבארות לזמן קצר עם DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) פעם אחת לפני הציפוי.
    2. אסוף את כל הכדורים (משלב 1.5.5) בצינורות של 50 מ"ל ומלא DPBS (1x). סובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נטנט.
    3. דגירה עם 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה של 200 μL (20-50 פעמים בהתאם לגודל הכדורים, הימנעות מהיווצרות בועות).
    4. נטרול מגיב הדיסוציאציה של התאים עם 2 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) וצנטריפוגה של 50 מ"ל חרוטית המכילה את התאים ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופר-נט.
    5. הוסף 1 מ"ל של CDM בתוספת 10 ng/mL גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) ו-10 ng/mL גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF) כדי להשהות מחדש את כדורי התא על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים.
    6. שאפו את תמיסת הלמינין מהצלחת (שלב 1.6.1.3), שטפו לזמן קצר ב-DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות), וזרעו את התאים (משלב 1.6.5) בלוחות המצופים מראש או בכיסויים ב-3 מ"ל CDM בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF. להאכיל את התאים כל 4 ימים.
      הערה: ניתן לשמור על תרבויות מבדילות במשך שבועות רבים עד 3 חודשים. המורפולוגיה העצבית מופיעה בדרך כלל לאחר שבועיים של סיום וניתן להשתמש בה לניתוחים במורד הזרם מנקודה זו ואילך. BDNF ו- GDNF אינם נחוצים לגידול לתחזוקה ארוכה יותר (עד חודשיים).
  7. דור המל"ל
    1. צלחות מטריצת מעיל.
    2. אסוף את כל הכדורים העצביים (שנוצרו משלב 1.4) בצינורות של 50 מ"ל ומלא DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free). סובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטים.
    3. לדגום את הכדורים עם 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה 200 μL (20-50 פעמים בהתאם לגודל של כדורים, הימנעות היווצרות בועה).
    4. נטרל עם 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS וצנטריפוגה של 50 מ"ל צינורות חרוטיים המכילים את התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף את supernatants. השהה את כדורי התא על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה כדי לקבל מתלים חד-תאיים.
    5. שאפו את תמיסת המטריצה מצלחת מצופה מראש וזרעו את התאים בלוחות המצופים מראש ב- NSC SF Medium (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מזינים את התאים כל 2-3 ימים ומפצלים את התאים כאשר הם נפגשים.
      הערה: משלב זה ואילך, ניתן להרחיב ולהקפיא תאי גזע עצביים כלפי מטה.
  8. הבחנה של גליה אסטרוציטים
    1. התמיינות אסטרוציטים מ- NSCs
      1. הכן 500 מ"ל של מדיום הבחנה אסטרוציטים.
      2. זרעים של NSCs על צלחות/כיסויים מצופים פולי-D-ליזין (PDL) עם מדיום NSC SF.
      3. למחרת, יש לשטוף את התאים ב-DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף מדיום התמיינות אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מוגדר כיום 0.
      4. התבונן ב- NSCs מתחת למיקרוסקופ מדי יום והחלף את מדיום ההבחנה של אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בלוח 6 בארות) כל יומיים מימים 1 עד 27.
    2. הבשלת אסטרוציטים
      1. הכן מדיום התבגרות אסטרוציטים.
      2. ביום 28, יש לשטוף את התאים ב-DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף מדיום התבגרות אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      3. ביום 29 ואילך, התבונן בתאים שמתחת למיקרוסקופ מדי יום והחלף את מדיום ההבשלה של אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) כל יומיים.
      4. לאחר חודש של התבגרות, הרחיבו את התאים והקפיאו אותם משלב זה ואילך.
        הערה: במהלך שלב זה, מספר התאים יגדל. בעת פיצול התאים, כיסויים מצופים PDL אינם נחוצים לתרבות.

2. אפיון תאים על ידי אימונוציטוכימיה וצביעת אימונופלואורסצנציה

  1. בתום תקופת התרבית, מעבירים את הכיסויים עם התאים לצלחת של 12 בארות.
    שטפו את התאים בתמיסת מלח (PBS) (1x) פעמיים ודגרו במשך 10 דקות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) (0.5 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות) ב-RT.
    הערה: ניתן לכסות את הדגימה הקבועה ב-2 מ"ל של PBS (1x) ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C עד שתידרש לטיפול חיסוני. PFA הוא רעיל וחשוד כגורם לסרטן. למנוע חשיפה לעור ולעיניים, ולעבוד תחת מכסה אדים כימיים.
  2. לחסום ולחדור את התאים ולדגור עם מאגר חוסם המכיל PBS (1x), 0.3% טריטון X-100, ו 10% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת ב- RT.
  3. דגירה עם נוגדנים ראשוניים בחסימת חיץ לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס: iPSCs כתומים עם גורם שעתוק אנטי-אוקטמר-קושר 4 (Oct4) ואנטיגן עוברי ספציפי אנטי-שלב (SSEA4), NSCs עם אזור אנטי-קובע מין Y box-2 (Sox2) ואנטי-נסטין, כדורים עצביים עם קופסה-6 אנטי-זוגית (Pax6) ואנטי-נסטין, אסטרוציטים עם חלבון חומצי אנטי-גליאלי (GFAP) ואנטי-S100 חלבון קושר סידן β (S100β), ונוירוני DA עם אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH), אנטי-β III טובולין (Tuj 1), אנטי-סינפטופיסין ואנטי-PSD-95 (0.5 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר בלוח של 12 בארות; לפרטים ראו טבלת חומרים ).
  4. שטפו את הדגימות עם PBS (1x) שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם נדנדה עדינה.
  5. דגירה עם תמיסת נוגדנים משנית (1:800 בחיץ חוסם, 0.5 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית Alexa Fluor לכל באר בצלחת של 12 בארות) במשך שעה אחת ב-RT עם נדנדה עדינה.
  6. דגרו על התאים עם Hoechst 33342 (1:5,000, 0.5 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות) ב-PBS (1x) למשך 15 דקות ב-RT כדי לסמן את הגרעינים.
  7. הרכב את התאים עם הרכבה בינונית ויבש במשך הלילה ב- RT להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחושך. ראה איור משלים S1 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.

3. מדידת ציטומטריה של זרימה של נפח המיטוכונדריה, MMP ו-ROS מיטוכונדריאלי בתאים חיים

  1. זרעו את התאים בנפרד ל-4 בארות בצלחת של 6 בארות עד שהתאים מגיעים למפגש של 50%-60%. תייג את ארבע הבארות האלה כ-#1, #2, #3 ו-#4.
  2. בסוף תקופת התרבית, הכינו 5 תמיסות צביעה בודדות (500 μL לבאר בצלחת של 6 בארות) כדלקמן: #1 רק מדיום תרבית (לבאר #1 המכיל רק תאים לבקרה); #2-1 המכיל FCCP (100 μM); #2-2 המכיל FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) במדיום תרבית; #3 המכיל TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) במדיום תרבות; #4 המכיל MitoSox אדום (10 μM) + MTG (150 ננומטר) ב- PBS (1x) עם 10% FBS. ראו איור 1A, טבלה משלימה S2 וטבלת חומרים לקבלת פרטים על תרכובות אלה ועל מערך הציטומטריה של הזרימה.
    הערה: השתמש במדיום התרבית כדי להכין את תמיסת הצביעה. חמם את המדיום ואת ה-PBS (1x) ב-RT לפני השימוש. FCCP הוא רעיל; למנוע חשיפה של העור והעיניים ולעבוד תחת מכסה אדים כימיים.
  3. שאפו את המדיום מהבאר #2 והוסיפו פתרון #2-1 (FCCP בלבד). לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  4. שאפו את המדיום מבארות #2 ו #3 והוסיפו פתרון #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) בבאר #2 ובפתרון #3 (TMRE + MTG) ב #3. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  5. שאפו את המדיום מהבאר #4 והוסיפו פתרון #4 (MitoSox Red + MTG). לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. לשאוף את המדיום מכל הבארות. יש לשטוף עם PBS (1x) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). נתק את התאים באמצעות מגיב דיסוציאציה של 1 מ"ל (1 מ"ל לכל באר בלוח של 6 בארות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. נטרול מגיב הדיסוציאציה של התא ב-1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS (2 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
  7. לאסוף את התוכן של כל הבארות ב 15 מ"ל צינורות חרוטיים. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 × גרם במשך 5 דקות. לשטוף את הכדורים עם PBS (1x) פעם או פעמיים.
  8. שאפו את הסופרנאטנטים אך השאירו כ-100 μL בצינורות. השהה את כדורי התא ב-300 μL של PBS (1x). העבר את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שמור את הצינורות בחושך ב- RT.
  9. לנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו 1 אדום). זהה MTG במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס 530/30, TMRE במסנן 2 (FL2) באמצעות מסנן bandpass 585/40, ו- MitoSox Red במסנן 3 (FL3) באמצעות מסנן פס פס 510/580.

4. מדידת ציטומטריה של זרימה של תת-יחידות מורכבות MRC ו- TFAM בתאים קבועים

  1. בסוף תקופת התרבית, נתק את התאים (~106) על ידי הוספת מגיב הדיסוציאציה של התא; לאחר מכן, גלולה ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  2. תקן את התאים ב-1.6% PFA (1 מ"ל של 1.6% PFA בצינור של 15 מ"ל) ב-RT למשך 10 דקות. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  3. חלחלו לתאים עם 90% מתנול קר כקרח (1 מ"ל של 90% מתנול בצינור של 15 מ"ל) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. חסום את הדגימות במאגר חוסם המכיל 0.3 M גליצין, 5% סרום עיזים ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) - שבר V ב-PBS (1x) (1 מ"ל של מאגר חוסם בצינור של 15 מ"ל). לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים (כמו בשלב 3.7).
  5. דגירה של התאים עם הנוגדנים הראשוניים הבאים למשך 30 דקות: אנטי-NDUFB10 (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת I, תת-יחידה מורכבת של פלבופרוטאין אנטי-סוקסינט דהידרוגנאז תת-יחידה A (SDHA, 1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת II ואנטי-COX IV (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת IV, ונוגדן אנטי-TFAM מצומד לאלקסה פלואור 488 (1:400). הכתימו את אותו מספר תאים בנפרד עם נוגדן anti-TOMM20 מצומד עם Alexa Fluor 488 (1:400) למשך 30 דקות (1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית בצינור של 15 מ"ל; ראו טבלת חומרים לפרטים על הנוגדנים).
  6. לשטוף את התאים עם PBS (1x) פעם אחת עם צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. הוסף נוגדן משני (1:400) לצינורות של NDUFB10, SDHA ו- COX IV ודגירה של התאים עם פתרונות אלה למשך 30 דקות.
  7. לשטוף את התאים עם PBS (1x) פעם אחת על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטים, והשאירו כ-100 μL בצינורות. השהה את כדורי התא ב-300 μL של PBS (1x). העבירו את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המוחזקים בחושך על קרח.
  8. לנתח את התאים על ציטומטר זרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו 1 אדום). זהה אותות במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס 530/30. ראה איור משלים S2 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.

5. רכישה וניתוח של ציטומטריה של זרימה

  1. השתמש בצינור הבקרה שאינו מוכתם כדי להגדיר את חלקות הפיזור הקדמיות (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) בהתבסס על הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים שנותחו. ראה איור משלים S2 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.
    הערה: הגדר פקדים שאינם מוכתמים עבור סוגי תאים בודדים.
  2. השתמש בצינורות הבקרה שאינם כתמים כדי לבחור את השערים החיוביים, והשתמש בצינורות בקרה בצבע יחיד כדי לפצות על החפיפה הספקטרלית הפלואורסצנטית בין MTG (פלואורופור-1 [FL-1]) ו- TMRE (FL-2) בציטומטריית זרימה צבעונית. השתמש בבקרת איזוטיפ לבקרה שלילית כדי לנטר כתמי רקע בדגימות MRC ו- TFAM. השתמש בצינור FCCP כבקרת דה-פולריזציה לצביעת TMRE.
  3. שער החוצה פסולת חיצונית כדי לבחור תאים חיים ואת המעטפת העיקרית מחלקת הפיזור הקדמית והצדדית (איור 2A). שער החוצה כפילים באמצעות גובה פיזור קדימה (FSC-H) לעומת (לעומת) FSC-A מתווה צפיפות כדי לא לכלול כפילים וגם לבנות גובה פיזור צדדי (SSC-H) לעומת תרשים SSC-A (איור 2A).
  4. איסוף נתונים (ציטומטר זרימה)
    1. באמצעות שימוש בדגימות לא מוכתמות או איזוטיפיות כבקרה שלילית, צור שער מעל האוכלוסייה העיקרית של האירועים החד-תאיים תוך כדי צפייה ב-SSC-A ובמסננים השונים (FL1, FL2, FL3, FL4) (איור 1B ואיור 2B).
  5. ניתוח נתונים (תוכנת CFlow)
    1. העתיקו את מיקום השערים על דגימות התאים המוכתמים, ותעדו את כמות התאים המוכתמים חיובית עבור הכתמים החיוביים.
    2. עבור כל תת-אוכלוסייה של תא, בחר תרשים היסטוגרמה ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של ערוצי הסינון השונים (FL1, FL2, FL3, FL4) (ציר x).
      1. חשב את רמות TMRE על ידי הפחתת ה- MFI של FL2 של #2 תאים שטופלו ב- FCCP מה- MFI של FL2 מדגימות מוכתמות ב- TMRE #3 בהיסטוגרמה, כמו ב- Eq (1) להלן.
        רמות TMRE = MFI של FL2 מתוך #3 דגימות מוכתמות TMRE - MFI של FL2 של #2 תאים מטופלים FCCP (1)
      2. חשב את הערכים הספציפיים עבור MMP ו- ROS מיטוכונדריאלי על ידי MFI ב- TMRE או ב- MitoSox Red, תוך חלוקת מחוון נפח המיטוכונדריה MTG.
      3. חשב את הערך הספציפי עבור תת-יחידה מורכבת ו- TFAM באמצעות MFI בביטוי מרוכב או TFAM, חלוקת מחוון נפח המיטוכונדריה TOMM20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיאור סכמטי של שיטת ההתמיינות והאסטרטגיות הציטומטריות של הזרימה מוצג באיור 3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מובחנים לרוזטות עצביות ואז מורמים לתרבית תרחיף לצורך התמיינות לתחומים עצביים. התחומים העצביים מובחנים עוד יותר ומבשילים לנוירוני DA. הכדורים העצביים מפורקים לתאים בודדים כדי ליצור אסטרוציטים גליאליים, מצופים מחדש במונו-שכבות כתאי גזע עצביים, ולאחר מכן מתמיינים לאסטרוציטים. פרוטוקול זה מספק את האסטרטגיות הדרושות לרכישה וניתוח של הדגימות על ידי ציטומטריה של זרימה למדידת MMP, נפח מיטוכונד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן פרוטוקולים ליצירת נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC ולהערכת היבטים רבים של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקולים אלה מאפשרים המרה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הן לתאי עצב והן לאסטרוציטים גליים, ואפיון מפורט של תפקוד המיטוכונדריה, בעיקר בתאים חיים. הפרוטוקולים מספקים גם אסטרטגיה מבוססת ציטומטריה של זרימה משותפת לרכישה וניתוח של פונקציות מיטוכונדריאליות מרובות, כולל נפח, MMP ורמות ROS מיטוכונדריאליות בתאים חיים וקומפלקסים של MRC ו- TFAM בתאים קבועים. באופן ספציפי, פרוטוקולים אלה מאפשרים ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בחביבות למרכז ההדמיה המולקולרית ולמתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת ברגן בנורווגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממועצת המחקר הנורבגית (מספר מענק: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ומועצת המלגות של סין (מספר הפרויקט: 201906220275).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עכבר עז (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11005) כנוגדן משני.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
אנטי-נסטיןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-23927, RRID:AB_627994נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:50, 20 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עכבר עז (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11005) כנוגדן משני.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;   להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עוף עיזים (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11042) כנוגדן משני.
אנטי-S100&בטא;   מצומד עם Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:400, 2.5 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;
אנטי-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751נוגדן ראשוני; יש להשתמש כ-1:1000, 1 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עכבר עז (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11005) כנוגדן משני.
אנטי-סינפטופיזיןAbcamab32127, RRID:AB_2286949נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;   להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עוף עיזים (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11042) כנוגדן משני.
אנטי-TFAM מצומד עם נוגדן ראשוני Alexa Fluor 488Abcamab198308לשימוש כ-1:400, 2.5 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; השתמש בעכבר חד-שבטי IgG2b  אלכסה פלואור&רג; 488 כבקרת איזוטיפ.
אנטי-TOMM20 מצומד עם Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:400, 2.5 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; השתמש בעכבר חד שבטי IgG2a  אלכסה פלואור&רג; 488 כבקרת איזוטיפ.
נוגדן ראשוני נגד NDUFB10Abcamab196019; לשימוש כ-1:1000, 1 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים; השתמש ב-IgG חד-שבטי של ארנב כבקרת איזוטיפ.
נוגדן ראשוני anti-SDHAAbcamab137040; לשימוש כ-1:1000, 1 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;   להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים; השתמש ב-IgG חד-שבטי של ארנב כבקרת איזוטיפ.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:1000, 1 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; שימוש  אלכסה פלואור ® 488 עז נגד עכבר IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11001) כנוגדנים משניים; השתמש ב-IgG חד-שבטי של עכבר כבקרת איזוטיפ.
Activin APeproTech120-14Eאסטרוציטים מרכיב בינוני מרכיב בינוני
ABM בסיסי בינונילונזהCC-3187מדיום בסיסי לתרבית אסטרוציטים
AGM SingleQuots תוסףלונזהCC-4123תוסף לתרבית אסטרוציטים
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיתתרמו פישר מדעי15240062מרכיב CDM
מתקדם DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010מדיום בזאלי לדילול
סרום בקר Geltrex AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000חומר חוסם למניעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים במבחני צביעה חיסונית ומרכיב CDM
BDNFPeproTech450-02DA נוירונים מרכיב בינוני
תוסף B-27 ThermoFisher Scientific17504044אסטרוציטים דיפרנציאציה מרכיב בינוני
BD Accuri C6 Plus Flow CytometerBD Biosciences, ארה"ב
תרכיז שומנים מוגדר כימיתThermo Fisher Scientific11905031מרכיב CDM
קולגנאז IVThermo Fisher Scientific17104019 מגיב לדיסוציאציה עדינה של iPSCs אנושיים
CCD מיקרוסקופ מצלמה Leica DFC3000 GLeica Microsystems, גרמניה
קורנינג כלי תרבית לא מטופליםSigma-AldrichCLS430589תרבית תרחיף
DPBSThermo Fisher Scientific14190250משמש למגוון שטיפת תרבית תאים
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte Differentiation Basal
Medium EDTAThermo Fisher מגיב 15575020 מדעילדיסוציאציה עדינה של iPSCs אנושיים
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher Scientific A1516901מדיום בסיסי לתרבית iPSC
תוסף Essential 8 (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101תוסף לתרבית iPSC
EGF חלבון אנושי רקומביננטיתרמו פישר תוסף PHG0314 מדעילתרבית NSC
FGF-בסיסי (AA 10– 155) חלבון אנושי רקומביננטיתרמו פישרתוסף PHG0024 מדעי לתרבית NSC
סרום בקר עובריסיגמא-אולדריץ'12103Cמרכיב בינוני
FGF-בסיסיPeproTech100-18Bאסטרוציטים מרכיב בינוני
FCCPAbcamab120081מבטל את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית וצביעה TMRE
מערכת שאיבת נוזלים בקרת BVCVacuubrand, גרמניה
פורמלדהיד (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908קיבוע תאים
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302משמש לחיבור ותחזוקה של iPSCs אנושיים
תוסף GlutaMAX תוסףThermo Fisher Scientific35050061לתרבית NSC
GDNFPeprotech450-10DA נוירונים מרכיב בינוני
גליציןסיגמא-אולדריץ'G8898משמש לחסימת
מאגר תערובת התזונה F-12 של HamThermo Fisher Scientific31765027מדיום בסיסי עבור CDM
הרגולין בטא-1'SRP3055אסטרוציטים מרכיב בינוני בידול
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399מכתים את הגרעינים לתמונה קונפוקלית
Heracell 150i CO2 אינקובטוריםפישר סיינטיפיק, ארה"ב
IMDMThermo Fisher Scientific21980032מדיום בסיסי
לאינסוליןCDM מרכיב 1376497CDM
InSolution AMPK מעכבSigma-Aldrich171261אינדוקציה עצבית מרכיב בינוני
גורם גדילה דמוי אינסולין-Iסיגמא-אולדריץ'I3769אסטרוציטים מרכיב בינוני
נוקאאוט DMEM/F-12 בינוניתרמו פישר מדעי12660012מדיום בסיסי לתרבית NSC
למיניןסיגמא-אולדריץ'L2020מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
Leica TCS SP8 STED מיקרוסקופ קונפוקליLeica Microsystems, גרמניה
מונותיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'M6145מרכיב CDM
MitoTracker ירוק FMתרמו פישר מדעיM7514משמש למחוון נפח מיטוכונדריאלי
MitoSox אדוםתרמו פישר מדעיM36008משמש למחוון ROS מיטוכונדריאלי
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'A7250עצבי אינדוקציה מרכיב בינוני
N-2 תוסףThermo Fisher Scientific17502048אסטרוציטים מרכיב בינוני
סרום עיזים רגילThermo Fisher ScientificPCN5000משמש לחסימת
בופר שייקרים אורביטליים - SSM1Stuart Equipment, בריטניה
תמיסת פולי-L-אורניתיןSigma-AldrichP4957מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204מקדם התמיינות נוירונים DA
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930הרכבת הכיסוי לתמונה
קונפוקליתPBS 1xThermo Fisher Scientific18912014משמש למגוון שטיפה
רקומביננטי אדם/עכבר FGF-8b חלבוןR& D Systems423-F8-025/CFמקדם התמיינות נוירונים DA
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPאינדוקציה עצבית מרכיב בינוני
תוסף עצבי StemPro ThermoFisher ScientificA10508-01תוסף לתרבית NSCs
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific12604013מגיב דיסוציאציה של תאים
טרנספריןמרכיב Roche652202 CDM
TRITON X-100VWR International9002-93-1משמש לחדירות תאים בבדיקות צביעה חיסונית
TMREAbcamab113852משמש לצביעה פוטנציאלית של ממברנה מיטוכונדריאלית
מים Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, ארה"ב
; תזונה סיגמא-אולדריץ אנושי אנושי אמבט

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryMitochondrial ParametersInduced Pluripotent Stem CellsNeural DerivativesGlial DerivativesMitochondrial Membrane PotentialReactive Oxygen SpeciesMitochondrial VolumeMitochondrial DNA CopyMitochondrial Respiratory Chain

Related Articles