מאמר שיטה

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

DOI:

10.3791/63116

⸱

8 בנובמבר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה חשובים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות רבות. שינויים בנפח המיטוכונדריה, בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), בייצור מיטוכונדריאלי של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובמספר העתק הדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) הם לעתים קרובות מאפיינים של תהליכים אלה. דו"ח זה מפרט גישה חדשנית המבוססת על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. אסטרטגיה מבוססת זרימה זו משתמשת בתאים חיים למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP ורמות ROS, כמו גם בתאים קבועים כדי להעריך רכיבים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) וחלבונים הקשורים ל-mtDNA כגון גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM).

על ידי צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, כולל MitoTracker Green (MTG), טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE) ו-MitoSox Red, ניתן לכמת שינויים בנפח המיטוכונדריה, ב-MMP וב-ROS המיטוכונדריאלי וקשורים לתכולת המיטוכונדריה. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-יחידות מורכבות של MRC וטרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20 (TOMM20) מאפשרת הערכה של ביטוי תת-יחידות MRC. מכיוון שכמות ה-TFAM פרופורציונלית למספר העותקים של mtDNA, המדידה של TFAM ל-TOMM20 נותנת מדידה עקיפה של mtDNA לכל נפח מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע תוך 2-3 שעות. חשוב לציין שפרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים הנמצאים כמעט בכל התאים האאוקריוטים. המיטוכונדריה אחראים על אספקת האנרגיה על ידי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני ומשמשים כמתווכים מטבוליים לביוסינתזה ולחילוף חומרים. המיטוכונדריה מעורבת עמוקות בתהליכים תאיים חשובים רבים אחרים, כגון ייצור ROS, מוות של תאים וויסות תוך-תאישל Ca 2+. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD), אטקסיה של פרידריך (FRDA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)1. גם תפקוד לקוי מוגבר של המיטוכונדריה וחריגה ב-mtDNA נחשבים כתורמים להזדקנות האנושית 2,3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה המשלימה S1 לקבלת מתכונים של כל המדיות והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים לתאי NCS, נוירונים דופמינרגיים (DA) ואסטרוציטים

  1. הכינו צלחות מצופות מטריצה.
    1. להפשיר בקבוקון של 5 מ"ל של מטריקס על קרח לילה. יש לדלל 1 מ"ל של מטריצה עם 99 מ"ל של ה-F-12 של הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM/F12 מתקדם) (ריכוז סופי של 1%). הפוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C (70 °F).
    2. הפשירו את תמיסת המטריצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (שמרו על קור) וציפו 6 בארות (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
    3. מניחים את הלוח....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיאור סכמטי של שיטת ההתמיינות והאסטרטגיות הציטומטריות של הזרימה מוצג באיור 3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מובחנים לרוזטות עצביות ואז מורמים לתרבית תרחיף לצורך התמיינות לתחומים עצביים. התחומים העצביים מובחנים עוד יותר ומבשילים לנוירוני DA. הכדורים העצביים מפורקים לתאים בודדים כדי ליצור אסטרוציטים גליאליים, מצופים מחדש במונו-שכבות כתאי גזע עצביים, ולאחר מכן מתמיינים לאסטרוציטים. פרוטוקול זה מספק את האסטרטגיות הדרושות לרכישה וניתוח של הדגימות על ידי ציטומטריה של זרימה למדידת MMP, נפח מיטוכונד.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להלן פרוטוקולים ליצירת נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC ולהערכת היבטים רבים של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקולים אלה מאפשרים המרה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הן לתאי עצב והן לאסטרוציטים גליים, ואפיון מפורט של תפקוד המיטוכונדריה, בעיקר בתאים חיים. הפרוטוקולים מספקים גם אסטרטגיה מבוססת ציטומטריה של זרימה משותפת לרכישה וניתוח של פונקציות מיטוכונדריאליות מרובות, כולל נפח, MMP ורמות ROS מיטוכונדריאליות בתאים חיים וקומפלקסים של MRC ו- TFAM בתאים קבועים. באופן ספציפי, פרוטוקולים אלה מאפשרים .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים בחביבות למרכז ההדמיה המולקולרית ולמתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת ברגן בנורווגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממועצת המחקר הנורבגית (מספר מענק: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ומועצת המלגות של סין (מספר הפרויקט: 201906220275).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עכבר עז (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11005) כנוגדן משני.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
אנטי-נסטיןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-23927, RRID:AB_627994נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:50, 20 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עכבר עז (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11005) כנוגדן משני.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;   להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עוף עיזים (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11042) כנוגדן משני.
אנטי-S100&בטא;   מצומד עם Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:400, 2.5 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;
אנטי-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751נוגדן ראשוני; יש להשתמש כ-1:1000, 1 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עכבר עז (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11005) כנוגדן משני.
אנטי-סינפטופיזיןAbcamab32127, RRID:AB_2286949נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:100, 10 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;   להשתמש ב-Alexa Fluor ® 594 IgG נגד עוף עיזים (1:800, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11042) כנוגדן משני.
אנטי-TFAM מצומד עם נוגדן ראשוני Alexa Fluor 488Abcamab198308לשימוש כ-1:400, 2.5 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; השתמש בעכבר חד-שבטי IgG2b  אלכסה פלואור&רג; 488 כבקרת איזוטיפ.
אנטי-TOMM20 מצומד עם Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:400, 2.5 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; השתמש בעכבר חד שבטי IgG2a  אלכסה פלואור&רג; 488 כבקרת איזוטיפ.
נוגדן ראשוני נגד NDUFB10Abcamab196019; לשימוש כ-1:1000, 1 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים; השתמש ב-IgG חד-שבטי של ארנב כבקרת איזוטיפ.
נוגדן ראשוני anti-SDHAAbcamab137040; לשימוש כ-1:1000, 1 ו-mu; L ב-1000 μ תמיסת מכתים L;   להשתמש ב-Alexa Fluor ® 488 עז נגד ארנב IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11008) כנוגדנים משניים; השתמש ב-IgG חד-שבטי של ארנב כבקרת איזוטיפ.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443נוגדן ראשוני; לשימוש כ-1:1000, 1 μ L ב-1000 μ תמיסת מכתים L; שימוש  אלכסה פלואור ® 488 עז נגד עכבר IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, קטלוג # A-11001) כנוגדנים משניים; השתמש ב-IgG חד-שבטי של עכבר כבקרת איזוטיפ.
Activin APeproTech120-14Eאסטרוציטים מרכיב בינוני מרכיב בינוני
ABM בסיסי בינונילונזהCC-3187מדיום בסיסי לתרבית אסטרוציטים
AGM SingleQuots תוסףלונזהCC-4123תוסף לתרבית אסטרוציטים
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיתתרמו פישר מדעי15240062מרכיב CDM
מתקדם DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010מדיום בזאלי לדילול
סרום בקר Geltrex AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000חומר חוסם למניעת קשירה לא ספציפית של נוגדנים במבחני צביעה חיסונית ומרכיב CDM
BDNFPeproTech450-02DA נוירונים מרכיב בינוני
תוסף B-27 ThermoFisher Scientific17504044אסטרוציטים דיפרנציאציה מרכיב בינוני
BD Accuri C6 Plus Flow CytometerBD Biosciences, ארה"ב
תרכיז שומנים מוגדר כימיתThermo Fisher Scientific11905031מרכיב CDM
קולגנאז IVThermo Fisher Scientific17104019 מגיב לדיסוציאציה עדינה של iPSCs אנושיים
CCD מיקרוסקופ מצלמה Leica DFC3000 GLeica Microsystems, גרמניה
קורנינג כלי תרבית לא מטופליםSigma-AldrichCLS430589תרבית תרחיף
DPBSThermo Fisher Scientific14190250משמש למגוון שטיפת תרבית תאים
DMEM/F-12, תוסף GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte Differentiation Basal
Medium EDTAThermo Fisher מגיב 15575020 מדעילדיסוציאציה עדינה של iPSCs אנושיים
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher Scientific A1516901מדיום בסיסי לתרבית iPSC
תוסף Essential 8 (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101תוסף לתרבית iPSC
EGF חלבון אנושי רקומביננטיתרמו פישר תוסף PHG0314 מדעילתרבית NSC
FGF-בסיסי (AA 10– 155) חלבון אנושי רקומביננטיתרמו פישרתוסף PHG0024 מדעי לתרבית NSC
סרום בקר עובריסיגמא-אולדריץ'12103Cמרכיב בינוני
FGF-בסיסיPeproTech100-18Bאסטרוציטים מרכיב בינוני
FCCPAbcamab120081מבטל את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית וצביעה TMRE
מערכת שאיבת נוזלים בקרת BVCVacuubrand, גרמניה
פורמלדהיד (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908קיבוע תאים
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302משמש לחיבור ותחזוקה של iPSCs אנושיים
תוסף GlutaMAX תוסףThermo Fisher Scientific35050061לתרבית NSC
GDNFPeprotech450-10DA נוירונים מרכיב בינוני
גליציןסיגמא-אולדריץ'G8898משמש לחסימת
מאגר תערובת התזונה F-12 של HamThermo Fisher Scientific31765027מדיום בסיסי עבור CDM
הרגולין בטא-1'SRP3055אסטרוציטים מרכיב בינוני בידול
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399מכתים את הגרעינים לתמונה קונפוקלית
Heracell 150i CO2 אינקובטוריםפישר סיינטיפיק, ארה"ב
IMDMThermo Fisher Scientific21980032מדיום בסיסי
לאינסוליןCDM מרכיב 1376497CDM
InSolution AMPK מעכבSigma-Aldrich171261אינדוקציה עצבית מרכיב בינוני
גורם גדילה דמוי אינסולין-Iסיגמא-אולדריץ'I3769אסטרוציטים מרכיב בינוני
נוקאאוט DMEM/F-12 בינוניתרמו פישר מדעי12660012מדיום בסיסי לתרבית NSC
למיניןסיגמא-אולדריץ'L2020מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
Leica TCS SP8 STED מיקרוסקופ קונפוקליLeica Microsystems, גרמניה
מונותיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'M6145מרכיב CDM
MitoTracker ירוק FMתרמו פישר מדעיM7514משמש למחוון נפח מיטוכונדריאלי
MitoSox אדוםתרמו פישר מדעיM36008משמש למחוון ROS מיטוכונדריאלי
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'A7250עצבי אינדוקציה מרכיב בינוני
N-2 תוסףThermo Fisher Scientific17502048אסטרוציטים מרכיב בינוני
סרום עיזים רגילThermo Fisher ScientificPCN5000משמש לחסימת
בופר שייקרים אורביטליים - SSM1Stuart Equipment, בריטניה
תמיסת פולי-L-אורניתיןSigma-AldrichP4957מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405מקדם התקשרות וצמיחה של תאים עצביים במבחנה
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204מקדם התמיינות נוירונים DA
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930הרכבת הכיסוי לתמונה
קונפוקליתPBS 1xThermo Fisher Scientific18912014משמש למגוון שטיפה
רקומביננטי אדם/עכבר FGF-8b חלבוןR& D Systems423-F8-025/CFמקדם התמיינות נוירונים DA
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPאינדוקציה עצבית מרכיב בינוני
תוסף עצבי StemPro ThermoFisher ScientificA10508-01תוסף לתרבית NSCs
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific12604013מגיב דיסוציאציה של תאים
טרנספריןמרכיב Roche652202 CDM
TRITON X-100VWR International9002-93-1משמש לחדירות תאים בבדיקות צביעה חיסונית
TMREAbcamab113852משמש לצביעה פוטנציאלית של ממברנה מיטוכונדריאלית
מים Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, ארה"ב
; תזונה סיגמא-אולדריץ אנושי אנושי אמבט

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים