הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63127

⸱

5 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Texas Biomedical Research Institute

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הדינמיקה של זיהומים נגיפיים באמצעות לוציפראז ופלואורסצנציה המבטאת רקומביננט (r)SARS-CoV-2 ומערכות הדמיה in vivo (IVIS) בעכברים מהונדסים K18 hACE2 כדי להתגבר על הצורך בגישות משניות הנדרשות לחקר זיהומי SARS-CoV-2 in vivo.

תקציר

מגיפת מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) נגרמה על ידי תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2). עד כה, SARS-CoV-2 היה אחראי ליותר מ-242 מיליון זיהומים וליותר מ-4.9 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. בדומה לנגיפים אחרים, חקר SARS-CoV-2 דורש שימוש בשיטות ניסיוניות כדי לזהות נוכחות של נגיף בתאים נגועים ו/או במודלים של בעלי חיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, יצרנו רקומביננטים בעלי יכולת שכפול (r)SARS-CoV-2 המבטאים חלבונים ביולומינסנטיים (ננולציפראז, נלוק) או פלואורסצנטיים (נוגה). rSARS-CoV-2 אלה המבטאים כתבים מאפשרים לעקוב אחר זיהומים נגיפיים במבחנה וב-in vivo בהתבסס על ביטוי הגנים של Nluc ו-Venus reporter. כאן המחקר מתאר את השימוש ב- rSARS-CoV-2/Nluc ו- rSARS-CoV-2/Venus כדי לזהות ולעקוב אחר זיהום SARS-CoV-2 במודל העכברים הממירים את האנגיוטנסין האנושי K18 שתואר קודם לכן 2 (hACE2) של זיהום באמצעות מערכות הדמיה in vivo (IVIS). rSARS-CoV-2/Nluc ו-rSARS-CoV-2/Venus מראים פתוגניות דמוית rSARS-CoV-2/WT ושכפול נגיפי in vivo. חשוב לציין כי ביטויי Nluc ו-Venus מאפשרים לנו לעקוב ישירות אחר זיהומים נגיפיים ב-vivo וב-ex vivo, בעכברים נגועים. rSARS-CoV-2/Nluc ו-rSARS-CoV-2/Venus מייצגים אפשרות מצוינת לחקור את הביולוגיה של SARS-CoV-2 in vivo, להבין זיהום ויראלי ומחלת COVID-19 הקשורה אליו, ולזהות טיפולים מניעתיים ו/או טיפוליים יעילים למאבק בזיהום SARS-CoV-2.

מבוא

תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2) הוא נגיף RNA עטוף, בעל חוש חיובי וחד-גדילי השייך לשושלת בטאקורונה-וירוס במשפחת הקורונה 1. משפחה ויראלית זו מחולקת לאלפא, בטא, גמא ודלתא-קורונה1. נגיפי אלפא ובטאקורונה מדביקים בעיקר יונקים, בעוד שנגיף גמא ודלתא-קורונה מדביק כמעט אך ורק ציפורים2. עד כה, שבעה נגיפי קורונה (CoV) חצו מחסומי מינים והתפתחו כנגיפי קורונה אנושיים (HCoV): שני אלפא-CoVs (HCoV-229E ו-HCoV-NL63) וחמישה רכבי בטא-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, נגיף הקורונה של תסמונת הנשימה במזרח התיכון [MERS-CoV], ו-SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV ו-SARS-CoV-2 הם פתוגניים מאוד, וגורמים לזיהום חמור בדרכי הנשימה התחתונות7. לפני הופעתו של SARS-CoV-2, היו שתי התפרצויות מגיפה שנגרמו על ידי CoVs: SARS-CoV בגואנגדונג פרובידנס, סין, בין השנים 2002-2003, עם שיעור תמותה ממקרי תמותה (CFR) של כ-9.7%; ו-MERS-CoV במזרח התיכון משנת 2012 ועד היום, עם CFR של כ-34%7,8. ל-SARS-CoV-2 יש CFR כולל בין 3.4%-49%, כאשר מחלות רקע תורמות ל-CFR גבוה יותרשל 8,9%. מאז גילויו בדצמבר 2019, בווהאן, סין, SARS-CoV-2 אחראי ליותר מ-242 מיליון נדבקים בבני אדם וליותר מ-4.9 מיליון מקרי מוות של בני אדם ברחבי העולם, 7,10,11,12. יש לציין כי מאז סוף 2020, וריאנטים חדשים של SARS-CoV-2 של דאגה (VoC) ווריאנטים בעלי עניין (VoI) השפיעו על מאפייני הנגיף, כולל העברה ואנטיגניות 9,13, והכיוון הכללי של מגיפת COVID-19. לטיפול בזיהומי SARS-CoV-2, יש כיום רק ארצות הברית אחת (ארה"ב) מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) טיפול אנטי-ויראלי (remdesivir) ותרופה אחת לאישור שימוש חירום (EUA) (baricitinib, שתינתן בשילוב עם remdesivir)14. ישנם גם 6 נוגדנים חד שבטיים מאושרים של EUA: REGEN-COV (casirivimab ו- imdevimab, הניתנים יחד), sotrovimab, tocilizumab, ו- bamlanivimab ו- etesevimab המנוהלים יחד 15,16,17,18,19. נכון לעכשיו יש רק חיסון מניעתי אחד שאושר על ידי ה-FDA, פייזר-ביונטק, ושני חיסונים מניעתיים אחרים (מודרנה וג'נסן) אושרו על ידי EUA 20,21,22,23,24. עם זאת, עם שיעור ההדבקה הבלתי מבוקר והופעתם של VoC ו- VoI, SARS-CoV-2 עדיין מהווה איום על בריאות האדם. לכן, יש צורך דחוף בגישות חדשות כדי לזהות מניעה וטיפולים יעילים לשליטה בהדבקת SARS-CoV-2 ובמגפת COVID-19 שעדיין נמשכת.

חקר SARS-CoV-2 דורש טכניקות מייגעות וגישות משניות כדי לזהות את נוכחות הנגיף בתאים נגועים ו/או מודלים מאומתים של זיהום בבעלי חיים. השימוש בגנטיקה הפוכה איפשר ליצירת וירוסים רקומביננטיים לענות על שאלות חשובות בביולוגיה של זיהומים ויראליים. לדוגמה, טכניקות של גנטיקה הפוכה סיפקו אמצעים לחשוף ולהבין את המנגנונים של זיהום ויראלי, פתוגנזה ומחלות. באופן דומה, גישות לגנטיקה הפוכה סללו את הדרך להנדס וירוסים רקומביננטיים חסרי חלבונים נגיפיים כדי להבין את תרומתם בפתוגנזה נגיפית. בנוסף, נעשה שימוש בטכניקות של גנטיקה הפוכה כדי ליצור וירוסים רקומביננטיים המבטאים גנים מדווחים ליישומי in vitro ו-in vivo, כולל זיהוי גישות מניעתיות ו/או טיפוליות לטיפול בזיהומים נגיפיים. חלבונים פלואורסצנטיים וביולומינסצנטיים הם הגנים המדווחים הנפוצים ביותר בשל הרגישות, היציבות והזיהוי הקל שלהם בהתבסס על שיפור טכנולוגיות חדשות25,26. במבחנה, חלבונים פלואורסצנטיים הוכחו כאפשרות טובה יותר ללוקליזציה של וירוסים בתאים נגועים, בעוד שלוציפראזות נוחות יותר למחקרי כימות 27,28,29. In vivo, לוציפראזות עדיפות על פני חלבונים פלואורסצנטיים להדמיה של בעלי חיים שלמים, בעוד שחלבונים פלואורסצנטיים מועדפים לזיהוי תאים נגועים או הדמיית ex vivo 30,31,32. השימוש בנגיפים רקומביננטיים המבטאים כתבים שימש ככלי רב עוצמה לחקר וירוסים במשפחות רבות, כולל, בין היתר, פלבי-וירוסים, אנטרו-וירוסים, אלפא-וירוסים, לנטי-וירוסים, נגיפי ארנה ונגיפי שפעת 28,33,34,35,36.

כדי להתגבר על הצורך בגישות משניות לחקר SARS-CoV-2 ולאפיון זיהום SARS-CoV-2 בזמן אמת in vivo, יצרנו רקומביננטים (r)SARS-CoV-2 המוכשרים לשכפול המבטאים חלבונים ביולומינסנטיים (ננולוסיפראז, Nluc) או פלואורסצנטיים (Venus) באמצעות הגנטיקה ההפוכה המבוססת על כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים (BAC) שתוארו קודם לכן, המתוחזקים כעותק יחיד ב- E. coli על מנת למזער את הרעילות של רצפי הנגיף במהלך התפשטותו בחיידקים37,38. יש לציין כי rSARS-CoV-2/Nluc ו-rSARS-CoV-2/Venus הראו פתוגניות דמוית rSARS-CoV-2/WT in vivo. הרמה הגבוהה של ביטוי נוגה מ-rSARS-CoV-2/Venus אפשרה זיהוי זיהום נגיפי בריאות של עכברים מהונדסים K18 hACE2 נגועים באמצעות מערכת הדמיה in vivo (IVIS)39. רמות הביטוי של נוגה תאמו היטב עם טיטרים נגיפיים שזוהו בריאות, והדגימו את ההיתכנות של שימוש בביטוי נוגה כפונדקאית תקפה של זיהום SARS-CoV-2. באמצעות rSARS-CoV-2/Nluc, הצלחנו לעקוב אחר הדינמיקה של זיהום נגיפי בזמן אמת ולהעריך באופן אורכי את זיהום SARS-CoV-2 in vivo באמצעות אותה גישת IVIS בעכברים מהונדסים K18 hACE2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולים הכוללים עכברים מהונדסים מסוג K18 hACE2 אושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של מכון המחקר הביו-רפואי בטקסס (TBRI) (IBC) והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל הניסויים פועלים על פי ההמלצות במדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן של המועצה הלאומית למחקר40. ציוד ההגנה האישית (PPE) המתאים נדרש בעת עבודה עם עכברים.

1. שימוש בעכברים מהונדסים K18 hACE2

  1. לרכוש ולתחזק נקבה בת 4-6 שבועות B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J עכברים (K18 hACE2 עכברים מהונדסים) במתקן לטיפול בבעלי חיים ברמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2 בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים.
    1. לאחר ההגעה למתקני BSL2, לאפשר לבעלי החיים להתאקלם במשך 7 ימים ולהעביר אותם למתקן בעלי החיים BSL-3 לזיהומים והליכי ניסוי אחרים.
    2. בהתאם לפרוטוקולי IACUC, הניחו 4 עכברים בכל כלוב. כדי להבטיח שהחיה תיפטר, לאחר הידבקות בעכברים ב-rSARS-CoV-2 והדמיית in vivo , המתינו את בעלי החיים במינון קטלני של Fatal-Plus (>100 מ"ג/ק"ג).

2. בטיחות ביולוגית

הערה: בכתב יד זה, rSARS-CoV-2 נוצר באמצעות מערכות גנטיות הפוכות מבוססות BAC עבור זן SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, כפי שתואר קודם לכן37. כל ההליכים in vivo הכוללים זיהומים rSARS-CoV-2/Nluc או rSARS-CoV-2/Venus חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי בתנאי BSL-3.

  1. נקו את ארון הבטיחות הביולוגית עם 2% Wexicide ו-70% חומר חיטוי אתנול ברצף לפני ואחרי ביצוע כל ההליכים הניסיוניים המתוארים במאמר זה.
  2. לעקר את כל חומר הנתיחה (מספריים, מלקחיים ניתוח וכו ') ואת ההומוגנייזר לפני ואחרי כל שימוש.
  3. נקו את תא הבידוד וחטאו באמצעות טבליות MB10 לפני ואחרי כל שימוש בהתאם להוראת היצרן.
  4. יש להשליך את כל החומר הביולוגי המיוצר במהלך ההליכים בהתאם להנחיות IBC ו-IACUC.

3. אפיון In vivo של rSARS-CoV-2

  1. זיהומים בעכברים
    1. הניחו את נקבות העכברים המהונדסים K18 hACE2 בנות 4-6 שבועות בכלובים מסומנים, זהו את העכברים בכל כלוב באמצעות קוד ניקוב אוזניים והניחו 4 עכברים לכל כלוב. השתמשו בקבוצת עכברים למשקל הגוף ולהישרדותו ובקבוצה נוספת של בעלי חיים לצורך טיטרציה והדמיה ויראלית.
    2. לפני ההדבקה, גילחו את חזה העכברים בצד הגחון מפטמת החזה לאזור הפטמה המפשעתית כדי להקל על אות הביולומינסנציה.
    3. הכינו את האינוקולום rSARS-CoV-2 עם 105 יחידות יוצרות פלאק (PFU)/עכבר בתנאים סטריליים בנפח כולל של 50 μL באמצעות מלח חיץ פוספט סטרילי 1x (PBS).
      הערה: חשב את כמות rSARS-CoV-2 לשימוש בדילול הנגיף עם הנוסחה: וירוס נחוץ = (105 PFU לכל עכבר / 50 μL) x נפח סופי) / מלאי ויראלי titer.
    4. שמור על האינוקולום של הנגיף מצונן על הקרח.
    5. השתמש בעכברים הנגועים דמה (1x PBS) ובעכברים הנגועים ב-rSARS-CoV-2/WT כבקרות פנימיות. הניחו את העכברים הנגועים בדמה בכלוב נפרד מאשר עכברים נגועים ב-rSARS-CoV-2.
    6. מרדימים את העכברים באמצעות 5% איזופלורן סדציה גזית בתא הרדמה ושומרים עם 3% איזופלורן.
    7. לאחר אישור תגובת היציבה ורפלקס הימין, הניחו את העכבר בתנוחת ההשעיה הגבית.
    8. קשקשו את צוואר העכבר בין האצבע המורה לאגודל והצמידו את הזנב לכף היד עם האצבע הוורדרדה כדי להחזיק את החיה בתנוחה הגבית.
    9. מניחים את קצה הפיפטה המכיל 50 μL של אינוקולום הנגיף בנחיריים ופולטים באיטיות את התמיסה. ודא כי אינוקולום הנגיף נשאף ואין רפלוקס על ידי התבוננות בטיפת האינוקולום נעלמת.
  2. ניטור ביולומינסנציה של עכברים מהונדסים K18 hACE2 הנגועים ב-rSARS-CoV-2/Nluc (איור 1 ואיור 2)
    הערה: ניסוי זה עוקב אחר הייצוג הסכמטי ומשתמש בווירוסים המוצגים באיור 1. נדרש חיבור הרדמה איזופלורן עבור מערכת ההדמיה in vivo (IVIS). ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים על מכשירים ומערכות הנדרשים.
    1. יזום את תוכנת ההדמיה והגדר את הפרמטרים, לחץ על מצב תמונה ל - Bioluminescence, פתח את המסנן והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי.
    2. לאחר אתחול מכונת ה-IVIS, הניחו את העכברים בתא הבידוד בעודם בתוך ארון הבטיחות הביולוגית. לגרום לעכברים עם איזופלורן בריכוז של 5%. לאחר אובדן התגובה היציבה ורפלקס הימין מאושר, יש לשמור עם 3% איזופלורן.
    3. לאחר שהעכברים מורדמים, מוציאים אותם מתא הבידוד ומנהלים באופן רטרו-מסלולי את מצע הלוציפראז מדולל 1:10 ב-1x PBS (נפח סופי 100 μL/עכבר) עם מחט של 25 גרם.
    4. לאחר מתן מצע לוציפראז, הניחו את העכברים בחזרה בתא הבידוד כאשר החזה שלהם פונה כלפי מעלה וחלל האף בתוך חרוט הסעפת כדי לשמור על החיה מורדמת במהלך הליך ההדמיה.
    5. העבר את תא הבידוד למכונת IVIS, ובאופן מיידי לאחר סגירת דלת ה-IVIS imager, בחר באפשרות רכוש בתוכנה כדי לאתחל (איור 2A).
    6. כדי לנתח תמונות bioluminescence שנרכשו, השתמש בכלי ROI (אזור העניין) בתוכנה כדי לייעד את האות המדויק ולמדוד את השטף (איור 2B).
    7. לחץ על מדידה ואפשר למערכת להתחיל להעריך את הביו-לומינסנציה בפוטונים כדי לספק את פליטת הפוטונים המוחלטת הדומה למדידות הפלט המסופקות על ידי הפרמטרים השונים.
    8. צלמו עכברים ב-1, 2, 4 ו-6 ימים לאחר ההדבקה.
    9. לאחר ההדמיה מניחים עכברים בחזרה לכלוב.
  3. ניתוח פלואורסצנטי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 הנגועים ב-rSARS-CoV-2/Venus (איור 3 ואיור 4)
    הערה: ניסוי זה עוקב אחר הייצוג הסכמטי וה-rSARS-CoV-2 המוצגים באיור 3. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים על מכשירים ומערכות הנדרשים.
    1. הפעל את תוכנת ההדמיה והגדר את הפרמטרים, הגדר עירור (500 ננומטר) ומסנני פליטה (530 ננומטר), לחץ על מצב תמונה לפלואורסצנציה והגדר את זמן החשיפה לאוטומטי.
    2. הרדמה תוך-צפקית של העכברים באמצעות מינון קטלני של Fatal-Plus (>100 מ"ג/ק"ג). לאחר המתת חסד, יש לחטא את אתר החתך ב-70% אתנול.
    3. באמצעות פינצטה, למשוך את העור, לעשות חתך מן עצם החזה לבטן לחתוך את החתך מן הצדדים עם מספריים. חותכים את וריד הכבד כדי למזער את כמות הדם בריאות ולהימנע מאותות רקע גבוהים במהלך ההדמיה.
    4. באמצעות מספריים, חותכים את עצם החזה ופותחים את הצלעות. לאחר מכן, לחתוך את קצה קנה הנשימה עם מספריים ולהסיר את הריאות עם פינצטה.
    5. מניחים את הריאות שנכרתו בצלחת של 6 בארות המכילה 2 מ"ל של 1x PBS ושוטפים כדי להסיר דם עודף. מזער את האפשרות של זיהום בין דגימות על ידי חיטוי וניקוי כלי ניתוח בין דגימות באמצעות 70% אתנול.
    6. לאחר אתחול מכונת IVIS, הניחו את הריאות במגש שחור והפרידו את הרקמות זו מזו.
    7. הניחו את המגש בתוך תא הבידוד בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, ולאחר מכן העבירו את תא הבידוד ל-IVIS. סגור את הדלת ולחץ על רכש כדי ליזום את מערכת ההדמיה (איור 4A).
    8. כדי לנתח פלואורסצנציה, השתמש בכלי ההחזר על ההשקעה וצייר ROIs סביב כל אחת מהריאות הבודדות. מדוד כל החזר השקעה באופן ידני ולאחר מכן השתמש בערכי היעילות הקורנים הממוצעים שניתנו והפחת מאלו של העכברים הנגועים בדמה (איור 4B).
    9. לאחר השלמת ההדמיה, הניחו את הרקמות על הקרח לצורך ניתוח באותו יום או ב-cryotube להקפאת קרח יבש כדי לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר.
  4. הדמיית שדה בהיר ריאה וניקוד פתולוגי של עכברים מהונדסים K18 hACE2 הנגועים ב-rSARS-CoV-2/Nluc (איור 2A-C) וב-rSARS-CoV-2/Venus (איור 4A-C)
    1. לאחר הדמיה של ביולומינסנציה של עכברים הנגועים ב-rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT ומזוהמים מדומים, מחזירים את העכברים לכלובים שלהם. המשך עם המתת חסד והדמיית השדה הבהיר ex vivo של ריאות עכברים (איור 2A).
    2. לאחר הדמיה של אקס-ויוו פלואורסצנציה של ריאות של עכברים נגועים, צלם תמונות בשדה בהיר של הריאות (איור 4A).
    3. נתחו את הנגעים הגסים על פני השטח של הריאה באמצעות ImageJ (איורים 2C ו-4C).
    4. פתח את תמונת הריאה לניתוח ב- ImageJ.
    5. חשב את היחס בין פיקסל לס"מ, השתמש בכלי ישר ומדוד את אורך התמונה בפועל.
    6. לאחר הבחירה, לחץ על נתח > מדידה כדי לחשב את אורך הפיקסלים עבור האורך.
    7. לחץ על ניתוח > הגדר קנה מידה והזן את המספרים המחושבים מהשלב הקודם.
    8. השתמשו בכלי Freehand Selections ובחרו את כל משטח הריאה. לחץ על נתח > מדידה למדידת שטח הריאה הכולל.
    9. לחץ על ערוך > בחירה > הפוך כדי לבחור את שאר אזור הריאה, ולאחר מכן הקש delete או backspace כדי להסיר את הרקע.
    10. הסר את האזור שנבחר ולאחר מכן לחץ על תמונה > התאם את סף הצבע >.
    11. כדי לבחור את אזור הנגע הפתולוגי, התאימו את הבהירות למינימום (בין 1 ל-50) ולמקסימום (בין 50 ל-200), בהתאם לרמות הגודש והדימומים הקיימים.
    12. לאחר בחירת נגעים פתולוגיים, לחץ על בחר בתחתית לוח צבעי הסף, ולאחר מכן לחץ על נתח > מדידה למדידת אזורים פתולוגיים.
    13. חשב את אחוז הנגעים הגסים עם הנוסחה: % של שטח פתולוגי = (מדידת שטח פתולוגי / משטח ריאה כולל) x 100.
  5. טיטרציות ויראליות (איור 2D ואיור 4D)
    1. לאחר ההדמיה, השלימו את המתת החסד של העכברים ואספו את הריאות, המוח ורירית האף.
    2. מכניסים את הריאות, המוח ורירית האף להומוגנייזרים נפרדים של רקמות סטריליות ומוסיפים 1 מ"ל של PBS קר 1x.
    3. הומוגניזציה של הדגימות על ידי צנטריפוגה ברזולוציה של 21,500 x g למשך 10 דקות לפסולת תאים כדורית. לאסוף ולהעביר את supernatants לתוך צינור סטרילי חדש ולהשליך את הכדור.
    4. אם טיטרציות ויראליות מבוצעות באותו יום, אחסן את supernatants ב 4 °C (66 °F). לחלופין, הקפיאו את הסופרנטנט של הדגימות ההומוגניות ב-80 מעלות צלזיוס עד שיוערכו מאוחר יותר.
    5. שימוש בסופרנאטים המתקבלים מההומוגנטים של הרקמות יוצר דילולים סדרתיים פי 10 ומדביק חד-שכבתיים של מפגשים של תאי Vero E6 עם 1 מ"ל מכל דילול של הסופרנאטנט (פורמט צלחת 6-well, 1.2 × 106 תאים/באר, טריפליקטים).
    6. תנו לנגיף לסלוח במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% CO2 לחה.
    7. לאחר ספיחה ויראלית, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS ולדגום ב 2 מ"ל של מדיה לאחר זיהום המכיל 1% אגר באינקובטור 5% CO2 לח ב 37 °C ב 37 °C במשך 72 שעות.
    8. לאחר הדגירה, השביתו את הלוחות בפורמלין נייטרלי של 10% במשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ודא שהצלחת כולה שקועה.
    9. הוציאו צלחות מ-BSL3 ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS וחדרו עם 1 מ"ל של 0.5% טריטון X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    10. חסום את התאים עם 1 מ"ל של 2.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-1x PBS למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הדגירה ב-1 מ"ל של 1 מיקרוגרם/מ"ל של הנוגדן הנוקליאוקפסיד של SARS-CoV (N) ב-1x PBS (N) למשך שעה אחת של הנוגדן החד-שבטי הצולב-תגובתי (1C7C7), המדולל ב-2.5% BSA למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    11. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS ולפתח את הפלאקים באמצעות ערכת ABC וערכת מצע DAB Peroxidase על פי הוראות היצרנים.
    12. חשב את הטיטרים הנגיפיים כ-PFU/mL.
      הערה: חשב עם הנוסחה PFU/mL = גורם דילול x מספר פלאקים x (נפח 1 מ"ל/אינוקולום).
  6. פעילות Nluc ברקמות של עכברים מהונדסים K18 hACE2 הנגועים ב-rSARS-CoV-2/Nluc (איור 2E)
    1. לכמת את הימצאותם של Nluc בעכברים המהונדסים של האיברים מדמה, rSARS-CoV-2/WT, ו-rSARS-CoV-2/Nluc הנגועים בעכברים מהונדסים מסוג K18 hACE2 באמצעות בדיקת לוציפראז בהתאם להוראות היצרנים.
  7. הערכת תחלואה ותמותה (איור 2F, G ואיור 4E, F)
    1. זיהום תוך רחמי נקבה בת 4-6 שבועות K18 hACE2 עכברים מהונדסים עם 105 PFU של rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, או נגועים דמה כמתואר בסעיף 3.1.
    2. נטר ושקל את העכברים במשך 12 יום בו זמנית כדי למזער את הווריאציה במשקל עקב בליעת מזון. המתת חסד את העכברים שמאבדים 25% ממשקל גופם הראשוני מאז שהגיעו לנקודת קצה הומאנית ושימו לב לעכברים אלה כמי שנכנעו לזיהום נגיפי.
    3. לאחר 12 יום, המתים את העכברים ששורדים את הזיהום הנגיפי וחשבו את אחוז השינוי וההישרדות במשקל הגוף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהום rSARS-CoV-2/Nluc בעכברים מהונדסים K18 hACE2 (איורים 1 ו-2)
איור 1A מראה ייצוג סכמטי של rSARS-CoV-2/WT (למעלה) ו-rSARS-CoV-2/Nluc (למטה) המשמשים להערכת זיהומים in vivo. איור 1B מציג את תרשים הזרימה הסכמטית שהוחל כדי להעריך את הדינמיקה של זיהום rSARS-CoV-2/Nluc בעכברים מהונדסים K18 hACE2. נקבות K18 hACE2, עכברים מהונדסים בני ארבעה עד שישה שבועות (N = 4) היו נגועות דמה ב-1x PBS או נדב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מדגים את ההיתכנות של שימוש בגנים אלה של rSARS-CoV-2 המבטאים את הכתבים כדי לנטר זיהומים ויראליים in vivo. שני הנגיפים הרקומביננטיים המבטאים כתבים מספקים כלי מצוין לחקר זיהומי SARS-CoV-2 in vivo. מערכות ההדמיה המתוארות ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) ו-in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) מייצגות אפשרות מצוינת להבין את הדינמיקה של זיהום SARS-CoV-2, פתוגנזה נגיפית ולזהות תאים/איברים נגועים בזמנים שונים לאחר זיהום ויראלי. על מנת לערוך מחקרי ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) ו - in viv...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר כל ניגוד עניינים מסחרי, פיננסי ולא כספי, או אישי ביחס לעבודה המתוארת.

תודות

אנו רוצים להודות לחברים במכון שלנו (מכון המחקר הביו-רפואי של טקסס) על מאמציהם לשמור על המתקנים שלנו פעילים ובטוחים באופן מלא במהלך מגיפת COVID-19. אנו רוצים גם להודות לוועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית שלנו (IBC) ולאיות (IACUC) על סקירת הפרוטוקולים שלנו בצורה יעילה בזמן. אנו מודים לד"ר תומס מורן מבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני על שסיפק את הנוגדן החד-שבטי של חלבון הנוקליאוקפסיד 1C7C7 (N) המגיב SARS-CoV. מחקר SARS-CoV-2 במעבדתו של מרטינז-סוברידו נתמך כיום על ידי מענקי NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 ו-R43AI165089-01; משרד ההגנה (DoD) מעניק את W81XWH2110095 ואת W81XWH2110103; שותפות סן אנטוניו לטיפול מדויק; פורום מכון המחקר הביו-רפואי בטקסס; המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו; הקרן הרפואית של סן אנטוניו; ועל ידי המרכז לחקר פתוגנזה והעברה של שפעת (CRIPT), מרכז מצוינות במימון NIAID למחקר ותגובה לשפעת (CEIRR, חוזה # 75N93021C00014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5% Triton X-100J.T.BakerX198-07יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT)
1% DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10% תמיסת פורמלין, ניטרלי חוצץSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24 בארות צלחת תרבית תאיםגריינר ביו-אחד662160
5% נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S-5761
6 בארות צלחת תרבית תאיםגריינר ביו-וואן657160
96 בארות צלחת תרבית תאיםגריינר ביו-וואן655-180
תאי אפיתל כליה של קופים ירוקים אפריקאים (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTמכשירים ספקטרליים הדמיה
הילה תוכנת הדמיה 3.2.0מכשירים ספקטרליים הדמיהתוכנת ניתוח תמונה
בקר סרום אלבומין (BSA), 35%Sigma-AldrichA9647חנות ב-4 מעלות;
C מים בדרגת תרבית תאיםקורנינג25-055-CV
Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVחנות ב 4 מעלות;
C מכונת גז הרדמהמערכות הרדמה וטרינרית, בע"מVAS 2001R
סרום בקר עוברי (FBS)Seradigm1500-050חנות ב-20 מעלות; C
עכברים טרנסגניים K18-hACE2 נקבות בנות ארבעה עד שישה שבועותמעבדת ג'קסון34860
Graphpad Prism גרסה 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxterחנות 1001936040ב-RT
MARS תוכנת ניתוח נתוניםBMG LABTECH
MB10 טבליותQUIP LaboratoriesMBTAB1.5חנות ב-RT
מגיב בדיקת Nano-Glo LuciferasePromegaN1110מגיב זה משמש למדידת פעילות Nluc. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין (PSG) 100xCorning30-009-CIחנות ב-20 מעלות; C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHHERAstar FSX
Precelleys Evolution הומוגנייזרBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
הומוגניזציה של רקמות רכות CK14 – 7 מ"לBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
ערכת VECTASTAIN ABC-HRP, פרוקסידאזABC PK-4002וערכת מצע DAB Peroxidase
ערכת של Vector Laboratories

מקורות

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

SARS CoV 2K18 hACE2SARS CoV 2In Vivo
הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי בעכברים מהונדסים K18 hACE2 באמצעות דיווח-מבטא רקומביננטי SARS-CoV-2
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.