מאמר שיטה

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

DOI:

10.3791/63130

⸱

1 באפריל 2022

 , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים המציגים אנטיגן (נגמ"שים) מציגים שלושה אותות מפעילים לתאי T העוסקים במגע פיזי: 1) אנטיגן, 2) תמחיר / דיכוי ליבה, ו -3) ציטוקינים מסיסים. תאי T משחררים שני סוגים של חלקיקי מפעיל בתגובה להפעלה: שלפוחיות טרנס-סינפטיות (tSVs) וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים, המעבירים שליחים בין-תאיים ומתווכים ציטוטוקסיות, בהתאמה. ישויות אלה מופנמות במהירות על ידי נגמ"שים העוסקים במגע פיזי עם תאי T, מה שהופך את האפיון שלהם להרתיע. מאמר זה מציג את הפרוטוקול כדי לפברק ולהשתמש ב-Belayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים (BSLBs) כחיקויים של תאים מציגי אנטיגן (APC) כדי ללכוד ולנתח חלקיקים טרנס-סינפטיים אלה. כמו כן מתוארים הפרוטוקולים למדידות המוחלטות של צפיפות חלבונים על משטחי תאים, שחזור של BSLBs עם רמות פיזיולוגיות כאלה, ואת הליך ציטומטריית הזרימה למעקב אחר שחרור חלקיקים סינפטיים על ידי תאי T. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ללמוד את ההשפעות של חלבונים בודדים, תערובות ליגנד מורכבות, דטרמיננטים פתוגן virulence, ותרופות על תפוקת האפקט של תאי T, כולל תאי T עוזר, לימפוציטים T ציטוטוקסיים, תאי T רגולטוריים, ותאי T קולטני אנטיגן כימריים מבטאים (CART).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסינפסה החיסונית (IS) היא מבנה מולקולרי מרכזי שנוצר בממשק של תאים העוסקים במגע פיזי המאפשר חילופי מידע מוסדר של juxtracrine. ISs שונים תוארו בספרות, וגוף גדל והולך של ראיות מצביע על כך שרכזות מולקולריות אלה הן תכונה שמורה של רשתות סלולריות. תאי חיסון שונים, כולל תאי B, תאי רוצח טבעיים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים ותאי T, מחליפים מידע באמצעות הרכבה של מגעים קצרי מועד1. מחקרים רב-לאומיים מקדמים את ההבנה של תת-קבוצות חדשות של לויקוציטים ותאי סטרומה המניעים רשתות תאיות פתוגניות ומבטאים חלבוני שטח בעלי פונקציות לא ידועות. כמו APCs סינתטיים, BSLBs לאפשר חקירה ישירה של התפקיד התפקודי של חלבונים בודדים בשילוב של הפעלת אותות, כלומר אנטיגנים ו costimulation / corepression, על ידי תאי T ואת שחרור וכתוצאה מכך שחרור של חלקיקים מפעילים המכונה אות ארבע.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים ואת הנקודות הטכניות הקריטיות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש ב- BSLBs כדי לחקות את הרכב פני השטח של APCs מודל. הפרוטוקולים למדידה כמותית של קולטני מערכת החיסון וחלבוני שטח אחרים ב- APCs מוצגים יחד עם הפרוטוקול לשחזור של נגמ"שים סינתטיים המכילים כמויות נמדדות אלה. לאחר מכן, השלבים הנדרשים עבור coculturing תאי T ו- BSLB מוצגים יחד עם הפרוטוקול למדידה הכמותית של העברת חלקיקים טרנס-סינפטית באמצעות cytometry זרימה. למרבה הפלא, BSLBs להקל על לימוד אוכלוסייה שמקורה קרום פלזמה של tSVs המכונה אקטואוזומים סינפטיים (SEs). תאי T-cell antigen מועשרים בקולטן (TCR+) SEs נשפכים בתגובה TCR מפעיל2 ביעילות נתפס על ידי BSLBs3, המייצג קריאה מצוינת כדי להעריך את המאפיינים האגוניסטיים של אנטיגנים ואת הרכב הממברנה מודל. אקסוזומים CD63+ וחלקיקי התקפה סופרמולקולריים (SMAPs) משתחררים גם הם על ידי תאי T מגורים ונלכדים על ידי BSLBs. הם יכולים לשמש כקריאות נוספות של הפעלה והפרשת גרגיר אקסוציטית וליטית וכתוצאה מכך על ידי תאי T. גיוס שלפוחיות אקסוציאטיות לקוטב האינטראקציה של תא T מקל גם על שחרור כיווני של ציטוקינים, כגון IL-2, IFN-γ ו- IL-10 בתגובה להפעלה 4,5,6,7,8. למרות ציטוקינים שוחררו תאי T ניתן לזהות גם על BSLBs, מחקר ייעודי יותר נמצא כעת בפיתוח כדי לאמת את הניתוח הכמותי של שחרור ציטוקינים בסינפסה החיסונית.

כדי לחקור כיצד הרכבי ממברנה ספציפיים משפיעים על התפוקה הסינפטית של תאי T דורש להגדיר את הצפיפות הפיזיולוגית של רכיב קרום היעד. כימות מבוססי ציטומטריה זרימה של חלבונים על פני התא הם צעד חיוני בפרוטוקול זה ודורשים: 1) שימוש בנוגדנים עם מספר ידוע של פלואורוכרום לנוגדן (F/P), ו -2) חרוזי בנצ'מרק המספקים התייחסות סטנדרטית לאינטרפולציה של מולקולות פלואורוכרום מעוצמות פלואורסצנטיות ממוצעות נמדדות (MFIs).

תקני אמת מידה אלה מורכבים מחמש אוכלוסיות חרוזים, שכל אחת מהן מכילה מספר גדל והולך של פלואורכומים מסיסים מקבילים (MESFs), המשתרעים על פני הטווח הדינמי של זיהוי פלואורסצנטיות שרירותי. אוכלוסיות סטנדרטיות אלה מניבות פסגות פלואורסצנטיות נפרדות, ומאפשרות המרה של יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ל- MESFs על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה. ה- MESFs המתקבלים משמשים לאחר מכן לצד ערכי F/P נוגדנים כדי לחשב את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל תא (או BSLB בשלבים מאוחרים יותר). היישום של אזורי שטח תא משוערים למספר הממוצע של מולקולות שזוהו ואז מאפשר חישוב של צפיפות פיזיולוגית כמו מולקולות / μm2. פרוטוקול כימות זה יכול להיות מותאם גם למדידת צפיפות החלבון על תאי T ולשיקום הביוכימי של הרכבי הממברנה המתווכים את היווצרות הסינפסות ההומוטיפיות של תאי T (כלומר, סינפסות T-T9). במידת הצורך, ניתן להעריך עוד יותר את הערכיות של כריכת נוגדנים באמצעות מטרות רקומביננטיות המסומנות במספרים ידועים של פלואורוכרומים לכל מולקולה. לאחר מכן, ניתן לחשב את הערכיות המחייבת נוגדנים עבור אותה אוכלוסיית BSLB על ידי השוואת מספר חלבונים פלואורסצנטיים מאוגדים ונוגדני כימות (באמצעות שני פלואורוקרומים כימות שונים ותקני MESF).

השחזור של ממברנות APC דורש הרכבה של bilayers השומנים נתמך (SLBs) על חרוזי סיליקה1. מלאי ליפוזום המכיל מינים שונים של פוספוליפידים ניתן לרתום כדי ליצור מטריצת ליפיד-bilayer רב תכליתית, המאפשרת עיגון של חלבונים רקומביננטיים עם כימיה מחייבת שונה (הכנת ליפוזומים מפורטת ב 10). לאחר הגדרת הצפיפות הפיזיולוגית (או הצפיפות) של הליגנד הרלוונטי "על התאים", אותו פרוטוקול ציטומטריית זרימה מותאם להערכת ריכוז החלבון הרומביננטי הדרוש לציפוי BSLBs בצפיפות הפיזיולוגית של המטרה. ניתן להשתמש בשתי מערכות עיגון שונות בשילוב או בנפרד.

ראשית, SLB המכיל 12.5 mol% סופי של Ni2 + המכיל פוספוליפידים מספיק כדי לספק כ -10,000 אתרי כריכת התג שלו לכל micron10 מרובע ועובד היטב כדי לקשט BSLBs עם רוב החלבונים הזמינים מסחרית אשר צפיפות פיזיולוגית שלהם אינה עולה על קיבולת טעינה מקסימלית זו. מערכת הטעינה השנייה רותמת פוספוליפידים המכילים ביוטין (כמו מול%) לטעינת ביו-טיניל נגד CD3e Fab (או מונומרים HLA/MHC) באמצעות גשרי סטרפטאבידין. השילוב של שתי שיטות קישוט BSLB אלה מאפשר תפירה גמישה של BSLBs כנגמ"שים סינתטיים. עבור קומפוזיציות משטח APC מורכבות מאוד, ניתן להגדיל את המול% של פוספוליפידים וחלבונים כדי לטעון חלבונים רבים ככל שהשאלה בהישג יד דורשת. לאחר ריכוזי העבודה של חלבונים מול% של פוספוליפידים biotinylated מוגדרים, BSLBs ניתן להרכיב כדי לחקור את הפלט הסינפטי של תאי T עם cytometry זרימה multiparametric.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מדידה של צפיפות חלבון פני התא עם ציטומטריית זרימה כמותית

  1. הכינו מאגר ציטומטריה של זרימה אנושית מסוננת ב-0.22 מיקרומטר (hFCB) על-ידי הוספת EDTA (לריכוז סופי של 2 מ"מM) וסרום AB אנושי (ל-10%) סופיים לתמיסת מלח סטרילית עם חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4 (ראו טבלה 1). לסנן את הפתרון באמצעות יחידת סינון נקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים בסרום ולאחסן ב 4 °C (6 °F).
  2. לשחזר את התאים ומשקעים אותם על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. בכל שלב כביסה, הגדילו מחדש את התאים ב-PBS לאמצעי האחסון המקורי (לפני צנטריפוגה) והסתובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
  4. לספור השעיות תא מוכתמות כחול טריפאן בהמוציטומטר11. לחלופין, ספור תאים באמצעות אי-הכללת זרם חשמלי. עבור האחרון, בצע את ההוראות של יצרן CASY-TT (עיין בטבלת החומרים).
    הערה: מונה התא CASY-TT מאפשר קביעת אחוז תאים בני קיימא, גודל התא ונפח התא.
  5. חשב את הנפח של PBS המכיל 1:1,000 דילול של צבע קיימא תיקון eFluor 780 או דומה (ראה את טבלת החומרים) הנדרש כדי resuspend התאים לריכוז כתמים של 107 תאים / מ"ל.
  6. לפנק מחדש את התאים באמצעות פתרון צבע קיימא-PBS ודגור על קרח במשך 30 דקות.
  7. הסר את צבע הכדאיות על-ידי הוספת נפח אחד של hFCB קר כקרח. ספין למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
    הערה: מעתה והלאה, שמור על שרשרת הקור לא שבורה.
  8. לשטוף את התאים עם hFCB המכיל 1:50 דילול של פתרון חסימת קולטן Fc (ראה את טבלת החומרים). הביאו את הנפח לריכוז סופי של 107 תאים/מ"ל ודגרו במשך 15 דקות נוספות כדי להשיג חסימת FcgR יעילה.
  9. להפיץ 100 μL של השעיית התא (כלומר, 106 תאים) לכל באר של צלחת U-bottom או V-bottom 96-well. שמור את התאים על קרח מוגן מפני אור (לכסות עם רדיד אלומיניום).
  10. הכן תערובת מאסטר נוגדנים hFCB על ידי הגדרת ריכוזי הנוגדנים האופטימליים עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום, והכי חשוב, עבור אותם נוגדנים המשמשים לקביעת צפיפות חלבון פני השטח. לדוגמה, לכימות ביטוי ICAM-1 על אוכלוסיות תאי שקדים, כפי שמוצג באיור 1, הכינו תערובת המכילה דילול של 1:200 של נוגדנים נגד CD4, אנטי-CD19 ואנטי-CXCR5 יחד עם ריכוזים רוויים של נוגדן אנטי-ICAM-1 עם פלואורוכרום ידוע AF647 לנוגדן (כלומר, 10 מיקרוגרם/מ"ל, שהוגדרו על ידי ניסויי טיטור נוגדנים עצמאיים).
  11. כמו פקדים נוספים, להכין תערובת מאסטר נוגדנים המכילה את פקדי איזוטיפ הנוגדנים הרלוונטיים (באותם ריכוזים יעילים כמו עמיתיהם מצומדים עם אותם פלואורוכרומים לחיסור רקע), כלומר, להשתמש 10 מיקרוגרם / מ"ל של בקרת איזוטיפ AF647 רלוונטית.
    הערה: בדוגמה לעיל, פקד איזוטיפ כזה משמש להפחתת פלואורסצנטיות ברקע מאות ICAM-1 האמיתי בתאים.
  12. בעת כימות צפיפות חלבון בתת-קבוצות תאים הנמצאות בתדרים נמוכים בתוך רקמות, הכן פקדי פלואורסצנטיות פחות אחד (FMO) המכילים את כל הנוגדנים הכתומים למעט סמני העניין (ראו פרטים נוספים ב-12).
  13. ספין למטה צלחת 96-well המכיל את התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (60 °F), להשליך את supernatant, ו resuspend התאים ב 50 μL של תערובת מאסטר נוגדן כימות או תערובת מאסטר נוגדן איזוטיפ.
  14. לדגור על התאים לפחות 30 דקות ב 4 °C (65 °F) ו 400 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. להגן על הצלחות מפני אור (לכסות עם רדיד אלומיניום).
  15. לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות hFCB וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F).
  16. Resuspend גלולה התא באמצעות 200 μL של PBS (כלומר, לריכוז סופי של 5 × 106 תאים / מ"ל).
  17. לרכישה:
    1. אם אתם משתמשים במטען סטנדרטי של BD FACS, העבירו את הדגימות לצינורות עגולים עם 5 מ"ל פוליסטירן (ראו טבלת החומרים).
    2. אם אתה משתמש בסמפלרים בעלי תפוקה גבוהה (HTS, המכונה גם קוראי לוחות), המשך מיד לשלב 1.19.
  18. לפני שתמשיך ברכישת הנתונים עבור תקני MESF, בדוק את המגבלות הליניאריות של עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית והמינימלית עבור ערוצי הכימות.
  19. לפני הפיצוי, רכשו נתונים עבור תקני MESF, והבטיחו שהאוכלוסיות העמומות והמבריקות ביותר ייפלו בטווח המדידה הליניארי.
  20. לרכוש את דגימות הפיצוי. שמור את ערכי המתח של שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) עבור ערוצי הכימות ללא שינוי כדי לשמר את טווח הזיהוי הדינמי. בצע התאמות קלות במתח PMT של ערוצים אחרים לפני חישוב מטריצות הפיצוי.
  21. חשב והחל פיצוי.
  22. לרכוש ולשמור מינימום של 2 × 104 חרוזים MESF סה"כ עבור כל אחד מערוצי הכימות.
  23. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדים בהתבסס על אזורי פיזור האור הצדדי והפנימי שלהם (SSC-A ו- FSC-A, בהתאמה, כפי שמוצג באיור 1A (i)), ולאחר מכן את בחירת האירועים בתוך רצף הזמן (איור 1A (ii)) ונמוך לזמן הטיסה (W) הן ב- FSC והן ב- SSC בהשוואה לגבהים שלהם (כלומר, FSC-W/FSC-H, ואחריו SSC-W/SSC-H gating כפי שמוצג באיור 1A (iii) ו-(iv), בהתאמה). הגדר שער סופי של אירוע יחיד המכיל אירועים עם התפלגות FSC-A פרופורציונלית לעומת FSC-H (איור 1A (v)).
  24. השג דגימות בקרה (פקדי איזוטיפ עם תווית ופקדי FMO).
  25. לרכוש דגימות ולרשום עד לפחות 10,000 תאי יעד נרכשו.
    הערה: הקביעה החזקה של צפיפות מולקולרית ממוצעת דורשת ניתוח של מספר תורמים על פני ניסויים עצמאיים. הדבר חיוני בעת ניתוח תת-קבוצות תאים הנמצאות בתדרים מופחתים או נגזרות מחומר ביולוגי נדיר (למשל, מביופסיות של רקמות אנושיות).
  26. לשטוף את cytometer פועל במשך 5 דקות עם פתרון ניקוי FACS ואחריו 5 דקות של מים ultrapure לפני כיבוי המכשיר. אם אתה משתמש ב- HTS, בצע את האפשרויות תחת הכרטיסיה HTS ותוכנית צלחת נקייה.
    הערה: כדי להפחית את ההובלה מדגם לדגימה, הפעל את האפשרויות לשטיפה לשבת (סמפלר) או לשטוף סמפלר בעל תפוקה גבוהה , אשר ישטפו באופן אוטומטי את הציטומטר בין צינורות או בארות. לפני תחילת הרכישה, להפעיל מים ultrapure במשך 10 דקות בקצב זרימה גבוה כדי להסיר כל מזהמים ביולוגיים לא שטופים מקו מדגם cytometer.
  27. יצא את קבצי תקן Cytometry זרימה (FCS).

2. MESF תיקן יתר על המידה ממוצע (או חציוני) ניתוח רגרסיה פלואורסצנטית (MFI)

  1. פתח את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה וטען את קבצי FCS הניסוי. בחר את אוכלוסיית החרוזים בהתבסס על אזורי פיזור האור בצדם ובחזית (SSC-A לעומת FSC-A), כפי שמוצג באיור 1A (i).
  2. שלוט באיכות הנתונים על-ידי בדיקת ההפצה של אירועים בודדים לאורך זמן, כפי שצוין בשלב 1.24.
    הערה: בועות יוצרות פערים בהתפלגות האירועים לאורך זמן; פעולה זו מופיעה בדרך כלל בתחילת הרכישה באמצעות HTS. הימנע מבחירת אירועים המאגדים פערים בזמן הרכישה מכיוון שאלה מוסיפים שגיאות מדידה עקב סטיות אופטיות.
  3. תתמקד באירועים היחידים.
    1. תאים
      1. זהה תחילה תאים בודדים בהתבסס על התפלגות ה-SSC-A וה-FSC-A שלהם (איור 1A (i)), ולאחר מכן אירועים נמוכים עבור W בשערים הרצופים FSC-W/FSC-H (סינגלים-1, איור 1A החלונית (iii)) ו-SSC-W/SSC-H (סינגלים-2; איור 1A החלונית (iv)). הגדר שער סינגלים-3 נוסף על-ידי בחירת אירועים עם FSC-A ו- FSC-H פרופורציונליים (איור 1A, חלונית (v)). לבסוף, זהה תאים חיים ככאלה שליליים לצבע הכדאיות הניתן לתיקון.
    2. חרוזי MESF
      1. בצע את אותן אפליית סינגלים-1 לסינגלים-3 כמו בשלב 2.3.1.1 (איור 1B, לוחות (i) עד (v)). זהה כל אחת מאוכלוסיות ה-MESF (ריקות, 1, 2, 3 ו-4) בהתבסס על רמות עוצמת הפלואורסצנטיות שלהן (ראו איור 1B, פאנל (vi)).
  4. חלץ את ה- MFI של שברי MESF ריקים ו- 1 עד 4.
  5. צור ערכי MFI מתוקנים (cMFI) עבור שברי MESF 1 עד 4 על-ידי הפחתה של ה- MF של אוכלוסיית החרוזים הריקים מכל שבר.
  6. חשב את שורת ההתאמה הטובה ביותר עבור קשר הגומלין בין מחווני cMF לערכי MESF המסופקים על-ידי הספק (משתנה בלתי תלוי, בהיותה שבר ריק השווה לאפס).
  7. חלץ את השיפוע (b במשוואה שלהלן) של הרגרסיה הליניארית של MESF חלקי cMFI (איור 1B החלונית (viii) מראה רגרסיה שבה y = a + bx; עם = 0).
  8. יש לחלץ את חציון (להפצות פלואורסצנטיות דו-מודולריות) או ממוצע (להפצות פלואורסצנטיות רגילות או רגילות) מעוצמות פלואורסצנטיות מאוכלוסיות העניין (תאי TFH ו-B בחלונית איור 1A (vii)).
  9. כמו בשלבים 2.5-2.7, לחלץ את ערכי MFI מתאי בקרה בעלי תווית איזוטיפ.
  10. אם ה- F/P של פקדי האיזוטיפ זהה לנוגדני הכימות, תקן את ה- MFIs של תאים מוכתמים על-ידי הפחתה של קובצי ה- MFIs מתאים המסומנים באיזוטיפ.
  11. אם ה- F/P של האיזוטיפים שונה מאלה של נוגדני הכימות, חלץ את ה- MESF מהאיזוטיפים על-ידי חלוקת ה- MF של קובצי ה- MF של תאים המסומנים באיזוטיפ עם השיפוע המחושב בשלב 2.7. הפחת איזוטיפ MESF מהכימות MESF לפני הערכת נוגדני כימות מאוגדים.
  12. חלק את ה- MESF ב- F/P של נוגדני הכימות כדי להעריך את מספר המולקולות הכרוכות לתא (Molec). כפי שמוצג בדיאגרמת הזרימה של איור 1C).
  13. חלקו את מספר המולקולות הכרוכות עם שטח הפנים המשוער של התא (CSA (μm2)) כדי לחלץ את צפיפות החלבונים כמופרה./מיקרומטר2 (איור 1C). עיין במקטע התוצאות הייצוגיות לקבלת פרטים נוספים.

3. מינים פונקציונליים של פוספוליפידים לשימוש בכיול חלבונים המצפים BSLBs

  1. השתמש 0.4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) כמרכיב העיקרי של מטריצת השומנים להרכיב bilayer השומנים נתמך. לדלל את כל מינים שומנים אחרים בתמיסת DOPC זו.
  2. השתמש בין 0.2 ל 1 מול% של 0.4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) מצומדים לצבעים, כולל ATTO 390, 488 או 565 (ראה את טבלת החומרים), כדי ליצור BSLBs עם פלואורסצנטיות פנימית.
    הערה: הפלואורסצנטיות הפנימית של BSLBs מאפשרת זיהוי של BSLBs בודדים ותאים בודדים בניסויי העברה סינפטיים.
  3. יש להשתמש ב-12.5 ממול% מ-0.4 מ"מ DGS-NTA(Ni) (1,2-דיאולואיל-סן-גליצרו-3-[N-(5-אמינו-1-קרבוקסיפנטיל) סוקציניל)כדי לעגן את החלבונים המתויגים שלו. שמור על המול% של DGS-NTA(Ni) קבוע ולבצע פי 2 titrations של חלבונים מתויגים His החל מ 100 ננומטר כריכוז הגבוה ביותר. השאר תנאי אחד ללא חלבון כשליטה שלילית לכימות מוחלט.
    הערה: אותות עזר ומולקולות הידבקות, כגון ICAM-1, מתוכננים עם תג 12-His כדי להגדיל את הזיקה של החלבון עבור DGS-NTA(Ni).
  4. השתמש בביוטיניל קאפ PE (1,2-דיאולואיל-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinylyl) כדי לעגן חלבונים ביו-טיניל באמצעות גשרים ביוטין-סטרפטאבידין-ביוטין. השתמש טיטרציה טורית פי 5 של 0.4 mM Biotinyl Cap PE כיסוי בין 10 מול% ו 0 מול% (כמו שליטה שלילית). שמור על ריכוז של חלבונים סטרפטאבידין וביוטינילציה קבוע (200 ננומטר) הן בניסויי כיול והן בשחזור של נגמ"שים סינתטיים לניסויי העברה סינפטיים.
    הערה: ניתוח רגרסיה של צפיפות אמפירית של חלבונים biotinylated על מול% הסופי של Biotinylyl Cap PE במטריצת השומנים (המכיל גם DGS-NTA(Ni) כדי לעגן חלבונים מתויגים שלו) יגדיר את המול% שישמש כדי לשחזר את צפיפות היעד של אנטיגן.

4. הכנת תמיסת מלח חצובה HEPES משלימה המכילה 1% אלבומין בסרום

הערה: תוספת של תמיסת מלח עם חוצץ HEPES המכילה 1% אלבומין בסרום אנושי (HBS/HSA) או 1% אלבומין סרום בקר (HBS/BSA) נדרש בשלבי הכביסה וטעינת החלבון של BSLBs (טבלה 1). הכן פתרון מלאי HBS 10x ואת מאגר העבודה טרי ככל האפשר; יש לשמור בקירור ולהשתמש בו תוך חודש. בעוד BSA הוא חלופה זולה יותר HSA, הוא מספק חסימה יעילה של שומנים Ni-chelating13 ומומלץ לניסויים תפוקה גבוהה.

  1. הכן פתרון מאגר מלאי 10x של HBS הוסיף המכיל 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM גלוקוז, 10 mM CaCl2, ו 20 מ"מ MgCl2.
    הערה: המסת MgCl2 היא אקסותרמית מאוד וסכנת כוויות. מוסיפים מלח זה לאט על נפח גדול של ממס. הימנע מהכנת פתרונות מרוכזים (כלומר, 1 מ ') של מלחים אלה כפי שהם נוטים לזרז לאורך זמן, מה שהופך את התוספת המדויקת שלהם למאגר העבודה קשה.
  2. סנן את פתרון 10x באמצעות יחידת סינון 0.22 מיקרומטר ולשמור אותו סטרילי ב 4 °C (60 °F).
  3. עבור 500 מ"ל של HBS/has, יש ליטול 50 מ"ל של פתרון 10x HBS בתוספת תשלום, להתאים את ה-pH ל-7.4 במידת הצורך ולהרכיב את הנפח ל-483.4 מ"ל עם מים אולטרה-פורר.
  4. הוסף 16.6 מ"ל של פתרון HSA של 30% ל- 483.4 מ"ל של HBS, pH 7.4.
  5. עבור 500 מ"ל של HBS / BSA, להמיס 5 גרם של BSA ב HBS ודגור ב 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות. לאחר מכן, לערבב בעדינות ב RT על ידי היפוך הבקבוק מעת לעת עד שאין גבישי חלבון גלויים או גושים.
  6. סנן את הפתרון המתקבל משלב 4.5 באמצעות יחידת סינון של 0.22 מיקרומטר (עיין בטבלת החומרים) ואחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C (4 °F).

5. כיול צפיפות חלבונים על BSLBs

  1. לפני נטילת 5.00 ±0.05 מיקרומטר קוטר לא פונקציונלי חרוזי סיליקה, לערבב את פתרון המלאי היטב resuspend כל גושים גדולים של חרוזים משקעים בתחתית הבקבוקונים.
    הערה: חרוזי סיליקה נוטים משקעים במהירות, מה שעלול להוביל לשגיאות ספירה. ערבבו במרץ על ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח המרבי של מיקרופיפט P1000.
  2. לדלל 1 μL של פתרון חרוזים ב 1,000 μL של PBS, לספור את החרוזים באמצעות תא hemocytometer, ולחשב את הריכוז שלהם לכל mL.
    הערה: כתמים כחולים של טריפאן אינם נחוצים להדמיית חרוזי סיליקה.
  3. חשב את הנפח של חרוזי סיליקה הדרושים עבור 5 × 105 BSLBs סופיים לכל נקודה של titration.
  4. מעבירים את הנפח הנדרש של חרוזי סיליקה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל.
  5. לשטוף את חרוזי סיליקה שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, צנטריפוגה החרוזים עבור 15 s על microcentrifuge ספסל ב RT (בסל"ד קבוע).
    הערה: בעת הסרת תמיסת הכביסה, יש להימנע מהפרעה לכדור החרוזים. עמודת חיץ קטנה לא תשפיע על התפשטות הליפוזומים המרכיבים את תערובת מאסטר הליפוזום מכיוון שאלה נמצאים גם ב- PBS.
  6. הכן שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום כדי להרכיב את BSLB על חרוזי סיליקה שטף (למשל, אם הנפח הכולל הראשוני של חרוזי סיליקה הוא 20 μL, להכין מינימום של 60 μL של תערובת מאסטר ליפוזום).
  7. עבור ביוטיניל קאפ PE מול% titrations
    1. הכינו את תערובות מאסטר השומנים המכילות דילול של פי 5 של Biotinyl Cap PE.
      1. לדלל את 0.4 mM Biotinyl Cap PE מול% מטריצת DOPC 100%.
      2. ערבבו כל נקודת טיטרציה של Biotinyl Cap PE Mol% ביחס של 1:1 (vol:vol) עם פתרון של 0.4 מ"מ 25% DGS-NTA(Ni) כך ש-12.5 מולן סופי של שומנים המכילים Ni נמצאים בכל התייקרויות.
        הערה: 12.5 mol% (vol:vol%) של שומנים המכילים Ni מייצגים את הרכב השומנים המעורבים של BSLBs שבו חלבונים מתויגים שלו ניתן לבדוק גם כיול מקביל. לדוגמה, מאז כל מניות ליפוזום מוכנים באותו ריכוז טוחן, כדי להגיע ליעד מול% תערובת ב 200 μL של תערובת ליפוזום סופי, פשוט לערבב 100 μL של 25 mol% של Ni המכיל DGS-NTA עם 100 μL של 100 mol% DOPC.
    2. העבר 5 × 105 חרוזי סיליקה שטופים לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל, כך שנקודת טיטרציה אחת של Biotinyl Cap PE מורכבת לכל צינור.
    3. הוסיפו את תערובות ה-Biotinyl Cap PE mol% titration Master לחרוזי הסיליקה השטופים וערבבו בעדינות על ידי צנרת מעלה ומטה של מחצית מהנפח הכולל. הימנע יצירת בועות, אשר עודף להרוס את bilayer השומנים.
    4. הוסף גז ארגון (או חנקן) על הצינור המכיל את BSLBs היוצרים כעת כדי לעקור את האוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.
    5. הוסף ארגון למלאי השומנים 0.4 מ"מ לפני האחסון ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית.
      הערה: חבר צינור קטן לגליל הגז ארגון/חנקן. לפני הוספת גז לצינורות, להתאים את וסת בלון הגז כך הלחץ מוגדר לא יותר מ 2 פסאיי. חברו קצה פיפטה סטרילי לצינורות השקע כדי לכוון את זרם הגז בתוך ציר הליפוזום למשך 5 שניות ולסגור במהירות את המכסה. במקרה של מלאי שומנים בדם, לאטום את המכסה של הצינור עם סרט פרפין לפני אחסונו ב 4 °C (60 °F).
    6. העבירו את ה-BSLBs למערבל מעבדה אנכי בעל זווית משתנה (ראו טבלת החומרים) וערבבו במשך 30 דקות ב-RT באמצעות ערבוב מסלולי של 10 סל"ד.
      הערה: שלב זה ימנע את המשקעים של חרוזים במהלך היווצרות של bilayer השומנים הנתמך.
    7. לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה עבור 15 s ב RT על minicentrifuge ספסל, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS / HSA (BSA) כדי להסיר ליפוזומים עודפים.
    8. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על ידי הוספת 1 מ"ל של 5% קזאין או 5% BSA המכיל 100 מיקרומטר של NiSO4 כדי להרוות אתרי NTA וסטרפטאבידין של 200 nM כדי לצפות את כל אתרי עיגון הביוטין ב- BSLBs באופן אחיד. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה חצי מהנפח הכולל ודגרים במיקסר האנכי לא יותר מ-20 דקות ב-RT ו-10 סל"ד.
    9. לסובב את BSLBs על ידי צנטריפוגה עבור 15 s ב RT על minicentrifuge ספסל, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS / HSA (BSA) חוצץ.
      הערה: שמור חרוזים שטופים אנכית עם נפח קטן של חיץ לשטוף המכסה את BSLBs. הימנע התייבשות של BSLBs כמו אוויר יהרוס את bilayer השומנים.
  8. עבור titration של חלבונים מתויגים שלו על 12.5 mol% של DGS-(Ni) NTA המכיל BSLBs
    1. הכן שלושה כרכים של תערובת מאסטר ליפוזום המכיל 12.5 mol% סופי של DGS-NTA(Ni).
    2. השתמשו בתערובת הראשית של ליפוזום כדי לנפח מחדש את חרוזי הסיליקה השטופים ולערבב בעדינות על ידי צנרת מעלה ומטה מחצית מהנפח הכולל. הימנע יצירת בועות, אשר עודף נזק bilayer השומנים.
    3. הוסף גז ארגון (או חנקן) על הצינור המכיל את BSLBs היוצרים כעת כדי לעקור את האוויר ולהגן על השומנים מפני חמצון במהלך ערבוב.
    4. הוסף ארגון למלאי השומנים 0.4 מ"מ לפני האחסון ולתפעל באמצעות טכניקה סטרילית.
    5. מעבירים את ה-BSLBs למיקסר האנכי ומערבבים במשך 30 דקות ב-RT באמצעות ערבוב מסלולי ב-10 סל"ד.
    6. לסובב את החרוזים על ידי צנטריפוגה עבור 15 s ב RT על minicentrifuge ספסל, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של HBS / HSA (BSA) כדי להסיר ליפוזומים עודפים.
    7. חסום את ה- BSLBs שנוצרו על-ידי הוספת 1 מ"ל של 5% קזאין (או 5% BSA) המכיל 100 מיקרומטר של NiSO4 כדי להרוות אתרי NTA ב- BSLBs. יש לערבב בעדינות ולדגור במיקסר האנכי למשך לא יותר מ-20 דקות ב-RT ו-10 סל"ד.
    8. לשטוף שלוש פעמים באמצעות HBS / HSA (BSA) כדי להסיר את פתרון החסימה עודף.
    9. בלוח חדש של 96 בארות תחתית U להכין דילול סדרתי פי 2 של החלבונים.
      1. הכן ריכוז התחלתי של 100 nM עבור חלבון העניין בנפח כולל של 200 μL של HBS / HSA (BSA) חיץ, להפיץ 100 μL של פתרון זה בעמודה הראשונה, ואת 100 μL הנותרים על גבי עמודה #2 המכיל 100 μL של HBS / HSA (BSA) חיץ.
      2. המשך על-ידי העברה סדרתית של 100 μL מעמודה #2 לעמודה #3 וחזור על הפעולה לפי הצורך כדי לכסות את כל נקודות הטיטורציה. השאר את העמודה האחרונה של הסדרה ללא חלבון, מכיוון שהיא תשמש כהפניה הריקה לכימות.
    10. תנצל מחדש את ה- BSLBs המוכנים באמצעי אחסון כך ש- 5 × 105 BSLB יכילו במאגר HBS/HSA (BSA) של 100 μL.
    11. העבר 100 μL של השעיית BSLB לבארות של צלחת 96-well 96-well תחתית U שנייה, כך שכל באר מקבלת 5 × 105 BSLBs.
    12. לסובב את הצלחת השנייה המכילה BSLBs במשך 2 דקות ב 300 × g ו RT ולהשליך את supernatant.
    13. מעבירים את נפחי 100 ה-μL מלוחית החלבון לצלחת המכילה את ה-BSLBs המשקעים. מערבבים בעדינות, נמנעים מעודף ייצור בועות בזמן ההזרמה, ודגרו במשך 30 דקות ב-RT ו-1,000 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. יש להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    14. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם HBS / HSA (BSA) חיץ באמצעות שלבי משקע של 300 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
    15. אם החלבון רקומביננטי המשמש בכיול מצומד ישירות לפלואורוקרומים ויש לו ערכי F/P ידועים, המשך לשלב 5.8.20.
    16. אם החלבון רקומביננטי המשמש בכיול הוא ללא תווית או מצומד לפלואורוכרומים או שאין תקן חרוזים MESF זמין, השתמש ב- Alexa Fluor 488 או בנוגדנים מצומדים 647 עם ערכי F/P ידועים כדי להכתים את ה- BSLB מצופה החלבון.
    17. כתם בריכוזים רוויים של נוגדני כימות.
      הערה: בהתאם לרמת ביטוי היעד, אלה נעים בין 5 ל 10 מיקרוגרם / מ"ל.
    18. יש להכתים במשך 30 דקות ב-RT ו-1,000 סל"ד באמצעות שייקר צלחת. יש להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום.
    19. לשטוף פעמיים עם HBS / HSA (BSA) חוצץ ופעם אחת עם PBS באמצעות שלבי משקע של 300 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
      הערה: השתמשו ב-PBS, pH 7.4 כדי לחדש את ה-BSLBs שנשטפו לפני הרכישה. אין להשתמש במאגרים המכילים חלבון, שכן זה מוביל להיווצרות בועות במהלך ערבוב אוטומטי של דגימות עם דוגמים בעלי תפוקה גבוהה.
    20. רכשו את תקני MESF וודאו שהפסגות הבהירות ביותר יישארו בטווח הזיהוי הליניארי של גלאי הכימות (ערוץ), כפי שמוצג באיור 1B (vii).
    21. לרכוש את הדגימות באופן ידני או באמצעות HTS. אם משתמשים באפשרות השנייה, resuspend BSLBs ב- 100 μL של PBS ולרכוש 80 μL באמצעות קצב זרימה בין 2.5 ל 3.0 μL / s, נפח ערבוב של 100 μL (או 50% של נפח הכולל אם נפח resuspension הוא פחות), מהירות ערבוב של 150 μL / s, וחמישה תערובות כדי להבטיח BSLBs הם monodispersed.
    22. יצא את קבצי FCS.
    23. התמקדו באירועים בודדים עבור הניתוחים (איור 2A), שכן כפילויות או שלישייה יציגו שגיאה בקביעה. השתמש בזיהוי מקונן של אירועים בודדים כפי שצוין בפרוטוקול שלב 1.2.3.
    24. מדוד את ה- MFI של כל שבר MESF (1-4) והפחת את ה- MFI של חרוזים ריקים כדי לחלץ ממשקי MF מתוקנים (cMFI).
    25. בצע ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לחלץ את השיפוע (ב) של MESF מעל cMFI המחושב עבור תקני MESF, אשר ישמש בשלב 5.33.
    26. לחלץ את ה- MFI של כל נקודת טיטרציה ולהפחית את ה- MFI של חרוזים ללא חלבון כדי להשיג cMFIs.
    27. חלק את ה- cMFIs עם השיפוע המחושב בשלב 5.31 כדי לחלץ את ה- MESF המאוגד ל- BSLBs עבור כל נקודת טיטרציה.
    28. חלק את MESF מאוגד BSLBs על ידי ערך F /P של נוגדן הכימות כדי לחלץ את המספר הממוצע של מולקולות מאוגדות לכל BSLB.
    29. באמצעות הקוטר של BSLBs (5.00 ± 0.05 מיקרומטר), לחלץ את שטח הפנים חרוז (SA = 4pr2) כדי לחשב את הצפיפות הסופית של חלבון (molec./μm2) לכל נקודת טיטרציה (ריכוז חלבון).
    30. בצע ניתוח רגרסיה חדש של ריכוז חלבון על פני צפיפות חלבון כדי לחשב את השיפוע (b) של קו ההתאמה הטובה ביותר.
      הערה: הריכוז של 12.5 mol% של DGS-NTA(Ni) מעניק יכולת עיגון מקסימלית של כ 10,000 molec./μm210 מבלי לגרום להפעלה לא ספציפית של תאי T או להשפיע על הניידות לרוחב של SLBs.

6. ביצוע ניסויי העברה סינפטיים בין תאי T ו- BSLBs

  1. לפני הפעלת ניסוי ההעברה הסינפטית
    1. רכשו BSLBs לא פלואורסצנטיים, BSLBs עם שומנים פלואורסצנטיים, תאים לא מזוהמים (או חרוזי פיצוי; עיין בטבלת החומרים) ותאים מוכתמים בצבע יחיד (או חרוזי פיצוי) כדי לזהות את אינטראקציות ספקטרום הפלואורסצנטיות של המכשיר. התמקד בגלאים אלה עם התפשטות גלישה גבוהה כדי לעצב מחדש את הלוח הפוליכרומטי, להגביר את הרגישות ולהפחית את שגיאת המדידה בגלאים קריטיים (ראה 14).
    2. יש לזרז את נוגדני הזיהוי כדי למצוא את הריכוז האופטימלי, ולאפשר זיהוי אירועים חיוביים מבלי להתפשר על גילוי שליליות.
      הערה: חזור על שלב זה בכל פעם שיש שינוי של מנת נוגדנים מכיוון שערכי ה- F/P והבהירות משתנים מאצווה לאצווה.
    3. אופציונלי: מטב את מתחי ה- PMT על-ידי רכישת המדגם בטווחי מתח שונים (כלומר, הליכות מתח) כדי למצוא את ה- PMTs המובילים לאות אופטימלי על פני רעש (כלומר, הפרדה של שליליות וחיוביות תוך הבטחת האות של האוכלוסייה הבהירה ביותר נשאר בטווח הליניארי).
  2. מדידת העברת פלט תאי T ל- BSLBs
    1. הכינו תוספת של RPMI 1640 (כאן R10 בינוני) המכיל 10% של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 מיקרומטר חומצות אמינו לא חיוניות, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U/ml של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין. השתמש במדיום R10 כדי לתרבות ולהרחיב תאי T.
    2. ביום הראשון, לבודד תאי T מתאי דם היקפי או מערכת לויקורדוקציה (LRS). השתמש בערכות בידוד והפרדה של תאי חיסון (עיין בטבלת החומרים) להעשרת תאי CD4+ ו- CD8+ T אנושיים.
    3. זרע את התאים בריכוז סופי הנע בין 1.5 ל 2.0 × 106 תאים / מ"ל, באמצעות צלחות 6-well עם לא יותר מ 5 מ"ל סה"כ לבאר.
    4. הפעל תאי T באמצעות יחס של 1:1 של הפעלת תאי T אנושיים (אנטי-CD3/anti-CD28) חרוזים מגנטיים (ראה טבלת החומרים) והוסף 100 יב"ל של IL-2 אנושי רקומביננטי כדי לתמוך בשגשוג ובהישרדות של תאים.
    5. ביום 3, הסר את החרוזים המגנטיים המפעילים באמצעות עמודות מגנטיות (ראה טבלת החומרים). ודא כי חרוזים מגנטיים להישאר מחוברים לצדי הצינור לפני שחזור התאים עבור צעדי כביסה נוספים.
    6. לשטוף את החרוזים המגנטיים פעם נוספת עם 5 מ"ל של בינוני R10 טרי, לערבב היטב, ולהחזיר אותם למגנט . שחזר אמצעי אחסון זה וערבב עם התאים ששוחזרו בשלב 6.2.5.
    7. הגדילו מחדש את התאים ל-1.5-2 ×-106 תאים/מ"ל ב-R10 טרי המכיל 100 U/mL של IL-2. לחדש את המדיום לאחר 48 שעות, לוודא כי התוספת האחרונה של IL-2 הוא 48 שעות לפני יום הניסויים (ימים 7 עד 14 של תרבות).
    8. ביום של ניסוי ההעברה הסינפטית, להכין את מדיום בדיקת העברה סינפטית (ראה טבלה 1) על ידי שכשהם פנול אדום RPMI 1640 בינוני עם 10% FBS, 100 μM חומצות אמינו לא חיוניות, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 מ"מ נתרן פירובט, 100 U / מיליליטר של פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין. אין לכלול IL-2 אנושי רקומביננטי.
    9. ספרו תאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן או אי-הכללת זרם חשמלי והגדילו אותם לריכוז סופי של 2.5 × 106 תאים/מ"ל בינוני. אם נצפתה מוות תאי מופרז (>10%), הסר תאים מתים/גוססים באמצעות תערובת של פוליסכריד ונתרן דיאטריזוט (ראה טבלת החומרים) כדלקמן:
      1. שכבה 15 מ"ל של תרבית תאים על גבי 13 מ"ל של פתרון פוליסכריד-נתרן diatrizoate.
      2. צנטריפוגה עבור 1,250 × גרם במשך 20 דקות ב RT עם האצה מינימלית deacceleration. לאסוף את שכבת התא (ענן) בממשק בין המדיום ואת הפתרון דיסכריד-נתרן diatrizoate.
      3. לשטוף את התאים לפחות פעמיים עם מדיום העברה סינפטית מראש (מוכן בשלב 6.2.7).
      4. לספור ולחדש את התאים לריכוז סופי של 2.5 × 106/mL באמצעות מדיום בדיקת העברה סינפטית. Coculture 100 μL של השעיית תא זה עם BSLBs (ראה שלב 6.2.15).
    10. חשב את מספר ה- BSLBs הדרושים לניסוי; שקול את כל תערובות מאסטר חלבון שונות ו titrations אנטיגן להיבדק (או biotinylated HLA / MHC-פפטיד מונומרים או מונוביוטינילט אנטי CD3ε Fab).
    11. הרכיבו את ה-BSLBs על-ידי ביצוע אותם שלבים מפרוטוקול סעיף 5, אך הפעם, שלבו את כל התוספות של חלבונים ושומנים הנדרשים כדי לשקם קרום APC מורכב (איור 3A). שמור על אותו נפח: קשרי וול בין נפח חרוזי הסיליקה הראשוני לבין נפח תערובת החלבון המשמשת במהלך כיול, כמו גם פעמים וטמפרטורות המשמשים בטעינת BSLBs. לדוגמה, אם 0.5 μL של חרוזי סיליקה / טוב ו 100 μL / באר של תערובת חלבון שימשו לכיול הראשוני, לשמור על יחסי 5:1,000 vol: vol כדי להכין את BSLBs להיות cocultured עם תאי T.
    12. לאחר BSLBs כבר טעון עם תערובת חלבון של עניין, לשטוף את BSLBs פעמיים עם HBS / HSA (BSA) כדי להסיר חלבונים בלתי מאוגדים עודפים. השתמש במהירויות משקעים של 300 × גרם במשך 2 דקות ב RT בכל שלב כביסה ולהשליך את supernatants.
    13. resuspend 5 × 105 BSLBs לבאר ב 200 μL.
    14. העבר 100 μL לבאר לצלחת חדשה של U-bottom 96-well כדי ליצור שכפול, כך שהסכום הסופי של BSLB לבאר הוא 2.5 × 105.
    15. לסובב את BSLBs ב 300 × g במשך 2 דקות ו RT ולהשליך את supernatant.
    16. Resuspend BSLBs באמצעות 100 μL של השעיית תא T; מערבבים בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות.
    17. לדגור את cocultures במשך 90 דקות ב 37 °C (50 °F).
      הערה: לחלופין, תאים וחרוזים ניתן resuspended במאגר HBS / HSA (BSA) במקום פנול אדום RPMI חינם עבור coculture. במקרה זה, הדגירה חייבת להתבצע בחממה שאינה CO2 כמו גז זה יהיה במהירות חומצי את המאגר בהיעדר ביקרבונט.
    18. לקרר את cocultures תא BSLB-T על ידי הדגירה הראשונה של התאים ב RT לפחות 15 דקות. הגן עליהם מפני אור.
    19. צנטריפוגה התאים במשך 5 דקות ב 500 × g ו RT; זרוק את הסופר-נרטיב.
    20. לחדש את התאים ב RT 2% BSA-PBS (Ca2 + ו Mg2 + ללא) לחסימה. מניחים את התאים על קרח במשך 45 דקות. הגן מפני אור.
    21. בעת הדגירה של התאים, הכינו את תערובת הנוגדנים הראשית באמצעות קר כקרח 0.22 מיקרומטר מסונן 2% BSA ב- PBS כחוצץ כתמים, אשר יספק חסימה נוספת.
      הערה: קבוצות מסוימות של נוגדנים המחוברים לצבעים סגולים מבריקים נוטים להיקשר ל- BSLBs באופן לא ספציפי. חסימה עם 5% BSA-PBS מסייעת להפחית רעש זה. מעתה והלאה, הקפד לשמור על השרשרת הקרה רצופה.
    22. לסובב את cocultures ב 500 × גרם במשך 5 דקות ו 4 °C (5 °F). לפני השלכת supernatants, בקצרה לוודא את הכדור קיים על ידי בדיקת החלק התחתון של צלחת 96-well באמצעות תאורה אחורית.
    23. באמצעות פיפטה רב ערוצית, resuspened התאים בתערובת מאסטר כתמים המכיל ריכוזי נוגדנים ממוטבים.
      הערה: השתמש בעצות פיפטה ללא מסנן כדי למנוע יצירת בועות ושגיאות בהפצת אמצעי אחסון מכתימים.
    24. כלול תאים בעלי תווית איזוטיפ ו- BSLBs, BSLBs פלואורסצנטיים ולא פלואורסצנטיים, ותאים ו- BSLBs מוכתמים לבדם. כבד את המספר הכולל של אירועים לבאר עבור כל הפקדים (כלומר, רק BSLBs המכילים 5 × 105 BSLB / טוב, ורק פקדי תאים המכילים 5 × 105 תאים / טוב כדי למנוע עלייה יחסית של נוגדנים לכל אירוע מוכתם).
    25. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה חצי מהנפח ודגור במשך 30 דקות על קרח. הגן מפני אור.
    26. לשטוף את התאים BSLBs פעמיים באמצעות קר כקרח 2% BSA-PBS, pH 7.4, ושלבי משקע של 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F). Resuspend cocultures שטף ב 100 μL של PBS לרכוש מיד.
    27. אם יש צורך בקיבעון, תקן באמצעות 0.5% w / v של PFA ב- PBS במשך 10 דקות, לשטוף פעם אחת, ולשמור ב- PBS עד הרכישה. הגן מפני אור.
    28. לפני הפיצוי, רכשו תקני MESF, המבטיחים שהאוכלוסיות העמומות והמבריקות ביותר ייפלו בטווח המדידה הליניארי.
    29. לרכוש דוגמאות פיצוי, לחשב פיצוי, ולהחיל את מטריצת הפיצוי (קישור) לניסוי.
    30. השג ושמור מינימום של 2 × 104 תקני MESF בסך הכל עבור כל אחד מערוצי הכימות.
    31. לרכישה באמצעות דוגמים בעלי תפוקה גבוהה, הגדר רכישת מכשירים כסטנדרט, הגדר רכישת מדגם ל- 80 μL (או 80% מהנפח הכולל), קצב זרימת מדגם בין 2.0 ל- 3.0 μL/s, נפח ערבוב מדגם של 50 μL (או 50% מהנפח הכולל כדי למנוע היווצרות בועות במהלך ערבוב), ערבוב מדגם של 150 μL/s וערבוב לבאר בין 3 ל -5.
    32. רכשו לפחות 1 ×-104 BSLBs בודדים לכל דגימה (עיינו בחלוניות איור 3B (i)-(vi) לאסטרטגיית הייחוס).
    33. לשטוף את cytometer פועל במשך 5 דקות פתרון ניקוי ואחריו 5 דקות של מים ultrapure לפני כיבוי המכשיר. אם אתה משתמש ב- HTS, בצע את האפשרויות תחת הכרטיסיה HTS והאפשרות ניקוי .
    34. יצא קבצי FCS.

7. מדידת ההעברה הסינפטית של חלקיקים ל- BSLB

  1. פתח את קבצי FCS הניסוי. בחר את אוכלוסיית התאים וה-BSLBs בהתבסס על אזורי פיזור האור בצד ובחזית שלהם (SSC-A לעומת FSC-A), כפי שמוצג באיור 3B (i).
  2. בחר את האירועים בחלון הרכישה הרציף (איור 3B (ii)).
  3. התמקד באירועים בודדים של שני התאים וה- BSLB; לזהות תאים בודדים תחילה בהתבסס על W נמוך בשערים הרצופים FSC-W/FSC-H (סינגלים-1, איור 3B החלונית (iii)) ו- SSC-W/SSC-H (סינגלים-2; איור 3B החלונית (iv)). הגדר שער סינגלים-3 נוסף על-ידי בחירת אירועים עם FSC-A ו- FSC-H פרופורציונליים (איור 3B, חלונית (v)).
  4. חלץ את ה- MFI של שברי MESF ריקים ו- 1 עד 4 ותאים בודדים ו- MESF עבור כל דגימת ניסוי.
  5. צור ערכי MFI מתוקנים (cMFI) עבור שברי MESF 1 עד 4 על-ידי חיסור ה- MFI של אוכלוסיית החרוזים הריקה מכל שבר.
  6. צור מחווני cMFIs עבור BSLBs ותאים בודדים (עיין בחלונית איור 3C (i)).
  7. השתמש באות מ- BSLB מוכתם בנוגדני בקרת איזוטיפ כדי לתקן את ה- MFI של BSLB המוכתם בנוגדנים כנגד סמני תאי ה- T הרלוונטיים. השתמשו ב-cMFI לחישוב אחוז ההעברה הסינפטית המנורמלת (NST%) באמצעות המשוואה המוצגת בחלונית איור 3C (ii).
  8. אם אתה מעוניין במקום זאת בחלקיקים שהועברו באופן ספציפי בתגובה להפעלת TCR, הפחת את האות מ- BSLBs ריקים מה- MFI של BSLBs אגוניסטיים. השתמש ב- cMFI זה כדי לחשב את אחוז ה- NST מונחה TCR באמצעות המשוואה המוצגת בחלונית איור 3C (ii).
  9. אם מעוניינים לקבוע את המספר הכולל של מולקולות המועברות כמטען חלקיקים בממשק T cell-BSLB, רכשו חרוזי בנצ'מרק MESF באמצעות אותן הגדרות מכשירים והפעלת רכישה עבור cocultures תא T-BSLB.
  10. לנתח אוכלוסיות חרוזים MESF ולחלץ cMFIs שלהם כפי שצוין בשלבי פרוטוקול 5.8.15 עד 5.8.17. חשב את השיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר לניתוח רגרסיה של MESF חלקי cMFI.
  11. השתמש במדרון המחושב כדי לחלץ את מספר ה- MESF שהופקד על BSLBs. השתמש ב- cMFIs המחושב באמצעות פקדי איזוטיפ או BSLB ריקים כריקים כדי לחלץ את מספר ה- MESF שהועבר במיוחד ל- BSLBs מגרה.
  12. חשב את מספר המולקולות של סמנים המועברים ל- BSLBs על-ידי חלוקת ה- MESFs המחושב (הממוצע) ל- BSLB לפי ערך ה- F/P של נוגדן הכימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FCM לכימות חלבונים מוחלט על פני התא
שחזור של BSLBs המציגים צפיפות פיזיולוגית של ליגנדים דורש הערכה של צפיפות החלבון הכוללת בקבוצת המשנה של התאים המעוצבים. כדי לשקם את ה-BSLBs, כלול כל ליגנד רלוונטי שצפוי למלא תפקיד בציר האיתות של עניין לצד חלבונים התומכים בהידבקות ובאינטראקציה תפקודית בין BSLB לתאים, כגון ICAM-1 ומולקולות תותבות, למשל, קולטני CD40, CD58 ו- B7 (CD80 ו- CD86). ניתן להוסיף חלבונים נוספים בהתאם לשאלה שלפנינו, כולל מולקולות costimulatory כגון ICOSL3, PD-L1 ו- PD-L21...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BSLBs הם כלים רב-תכליתיים לחקר תפוקת החלקיקים של תאי T מגורה עם ממברנות APC מודל. הגמישות של השיטה מאפשרת שחזור של הרכבי ממברנות מורכבים ורדוקציוניסטיים כדי לחקור את ההשפעות של ליגנדים ואת האותות שלהם על הפרשת tSVs וחלקיקי התקפה סופרמולקולרית ורכיביהם. בדקנו טכנולוגיה זו בתאי T שונים, כולל TH, CTL, טרגס ו- CART15. פרוטוקול זה פועל גם למדידת שחרור חלקיקים סינפטיים של תאי T מבודדים טריים ודיכאוניים. מגבלה אחת של שימוש בתאי T מבודדים טריים היא שאוכלוסיות שקטות אלה מייצרות פרופיל שונה של חלקיקים טרנס-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו ולקהילת מכון קנדי לראומטולוגיה על דיונים מדעיים קונסטרוקטיביים, במיוחד מנהל מתקן ציטומטריית הזרימה שלנו, ג'ונתן וובר. עבודה זו מומנה על ידי מלגת המחקר הראשית של Wellcome Trust 100262Z/12/Z, המענק המתקדם של ERC (SYNECT AdG 670930), וקרן קנדי למחקר ראומטולוגיה (KTRR) (כל השלושה ל- MLD). PFCD נתמך על ידי EMBO ארוך טווח מלגה (ALTF 1420-2015, בשיתוף עם הנציבות האירופית (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ומארי Sklodowska-Curie פעולות) ומלגת אוקספורד-בריסטול מאיירס סקוויב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (מלח ניקל)Avanti Polar Lipids790404C-25mg18:1 DGS-NTA(Ni) בכלורופורם

PIPETMAN L רב ערוצי P8x200L, 20-200 ומיקרו; L		GilsonFA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850375C-25mg  18:1 (&דלתא; 9-CIS) PC (DOPC) בכלורופורם
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (מלח נתרן)Avanti Polar Lipids870273C-25mg18:1 Biotinyl Cap PE בכלורופורם
200 ומיקרו; L טיפים צהובים 10 x 96 טיפים, ערימהStarlabS1111-0206
5 מ"ל צינורות פוליסטירן תחתונים עגולים Falcon®
5.00 ± 0.05 & מיקרו; m חרוזי סיליקה לא מתפקדיםBangs Laboratories Inc.
96 באר פולחן תאים צלחת U-תחתית עם מכסה, תרבית רקמות מטופלת, לא פירוגנית.Costar®3799לצביעה של FCM ותרבית משותפת של BSLB ותאים.
96 צלחת פולחן תאים באר V-תחתית עם מכסה, תרבית רקמות מטופלת, לא פירוגנית.Costar®3894לצביעה FCM של תאים או חרוזים בתרחיף.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher מדעי, Invitrogen ומסחר;A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)Thermo Fisher מדעי, Invitrogen ומסחר;A37573 ו-A20006
Allegra X-12R צנטריפוגהבקמן קולטרלצביעה רגילה בצינור של דגימות ביולוגיות עבור
רדיד אלומיניוםכל מותגלהגנה על תאים ו-BSLBs מפני
CD154 אנטי-אנושי קל (CD40L), שיבוט 24-31BioLegend310815 ו-310818Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה.
CD185 אנטי-אנושי (CXCR5) Brilliant Violet 711, שיבוט J252D4BioLegend356934לניתוח FCM כמותי של תאי שקדים כפי שמוצג באיור 1E
אנטי-אנושי CD19 Brilliant Violet 421, שיבוט HIB19BioLegend302234לניתוח FCM כמותי של תאי שקדים כפי שמוצג באיור. 1E
CD2 אנטי אנושי, שיבוט RPA-2.10BioLegend300202מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי CD2, שיבוט TS1/8BioLegend309218מצומד Brilliant Violet 421.
CD252 אנטי אנושי (OX40L), שיבוט 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 מצומד
אנטי אנושי CD28, שיבוט CD28.2eBioscience16-0289-85מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי CD317 (BST2, PDCA-1), שיבוט 26F8ThermoFisher Scientific, invitrogen53-3179-42Alexa Fluor 488 מצומד, מצאנו שהשיבוט הזה נקי יותר משיבוט RS38E.
CD38 אנטי אנושי, שיבוט HB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700 מצומד
CD38 אנטי אנושי, שיבוט HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 מצומד
אנטי אנושי CD39, שיבוט A1BioLegendמתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי CD4 Brilliant Violet 650, שיבוט OKT4BioLegend317436לניתוח FCM כמותי של תאי שקדים כפי שמוצג באיור 1E
, שיבוט A161A1BioLegend357414 ו-357421מצומדים PerCP/Cyanine5.5 ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה
CD4 אנטי-אנושי, שיבוט OKT4BioLegend317414 ו-317422PE/Cy7 ו-Alexa Fluor 647 מצומדים, בהתאמה
CD40 אנטי-אנושי, שיבוט 5C3BioLegend334304מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי CD40, שיבוט G28.5BioLegendמתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי CD45, שיבוט HI30BioLegend304056 ו-368516Alexa Fluor 647 ו-APC/Cy7 מצומד
CD47 אנטי אנושי, שיבוט CC2C6BioLegend323118מצומד
Alexa Fluor 647CD54 אנטי אנושי (ICAM-1), שיבוט HCD54BioLegend322702מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי CD63 (LAMP-3), שיבוט H5C6BioLegend353020 ו-353015PerCP/Cyanine5.5 ו-Alexa Fluor 647 מצומדים, בהתאמה
CD73 אנטי אנושי, שיבוט AD2BioLegend344002מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
CD80 אנטי אנושי, שיבוט 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 מצומד
אנטי-אנושי CD81, שיבוט 5A6BioLegend349512 ו-349502PE/Cy7 מצומד ומסומן בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), בהתאמה.
CD82 אנטי אנושי, שיבוט ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 מצומד
אנטי אנושי CD86, שיבוט IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 מצומד
אנטי אנושי CD8a, שיבוט HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 מצומד
אנטי אנושי CD8a, שיבוט SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 מצומד
HLA-A אנטי אנושי/ B/C/E, שיבוט w6/32BioLegend311414 ו-311402Alexa Fluor 647 מצומד ומסומן בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי-אנושי HLA-DR, שיבוט L243BioLegend307656 ו-307622Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה.
ICAM-1 אנטי אנושי, שיבוט HCD54BioLegend322702מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
ICOS אנטי אנושי, שיבוט C398.4ABioLegend313516אוגר ארמני IgG
ICOSL אנטי אנושי, שיבוט MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647 מצומד
ICOSL אנטי אנושי, שיבוט MIH12eBioscience16-5889-82מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי LFA-1, שיבוט TS1/22BioLegendמיוצר בביתמתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי OX40, שיבוט Ber-ACT35 (ACT35)BioLegend350018Alexa Fluor 647 מצומד
אנטי אנושי PD-1 , שיבוט EH12.2H7BioLegend135230 ו-329902Alexa Fluor 647 מצומד ומסומן בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
PD-L1 אנטי אנושי, שיבוט 29E.2A3BioLegend329702מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי PD-L2, שיבוט 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 מצומד
PD-L2 אנטי אנושי, שיבוט MIH18BioLegend345502מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
אנטי אנושי TCRab, שיבוט IP26BioLegend306712 ו-306714Alexa Fluor 488 ו-Alexa Fluor 647, בהתאמה.
CD156c (ADAM10), שיבוט SHM14BioLegend352702
אנטי-אנושי CD317 (BST2, Tetherin), שיבוט RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 אוגר ארמני מצומד
IgG Alexa Fluor 647 בקרת איזוטייפ, שיבוט HTK888BioLegend400902מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer הגדרה וחרוזי מעקבבקטון דיקינסון & חברה (BD)641319מסלול ביצועים של מכשירים לפני FCM כמותי
BD FACSDivaBecton Dickinson & חברה (BD)23-14523-00תוכנת רכישה
Seum AlbuminMerck, Sigma-AldrichA3294
CaCl2, סידן כלוריMerck, Sigma-AldrichC5670נטול מים, BioReagent, מתאים לתרבית תאי חרקים, מתאים לתרבית תאי צמחים, ≥ 96.0%
קזאין מחלב בקר, מתאים למצע לחלבון קינאז (לאחר דה-פוספורילציה), אבקה מטוהרתMerck, Sigma-AldrichC5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28ThermoFisher Scientific, Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific, Invitrogen ™12321Dלהסרת Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 בנפחים של פחות מ-2 מ"ל
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301Dלהסרת Dynabeads ומסחר; T-Activator אנושי CD3/CD28 בנפחים של פחות מ-15 מ"ל
סרום בקר עוברי מוסמך, זריקה אחתThermoFisher Scientific, GibcoA3160801זקוק להשבתת חום למשך 30 דקות ב-56 oC
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02תמיסה סטרילית של פוליסכריד ונתרן דיאטריזואט לבידוד לימפוציטים
כדאיות לתיקון eFluor 780eBiosciences65-0865-14להרחקת תאים מתים במהלך ניתוחים
FlowJoBecton Dickinson & חברה (BD)גרסה 10.7.1תוכנת ניתוח
Grant Bio MPS-1 Multi Plate ShakerKeison מוצריםMPS-1לערבוב של תאים במהלך צביעה או BSLBs במהלך סטנינג או העמסת חלבון (כחלופה לתסיסה מסלולית)
תמיסת חיץ HEPES (1 מ')ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES, N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N&פריים;-(2-חומצה אתנסולפונית), 4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית.Merck, Sigma-AldrichH4034להכנת מאגר HBS/HAS או HBS/BSA. מוסמך BioPerformance, ≥ 99.5% (טיטרציה), מתאים לתרבית תאים
HERACell 150i CO2 אינקובטור, 150 ליטר, נירוסטה מלוטשתThermoFisher Scientific51026282לתרבות והרחבה של תאי CD4+ ו-CD8+ T מטוהרים.
מערבל הולה מיקסר לדוגמאThermoFisher Scientific, Life Technologies15920Dמערבל מעבדה אנכי בזווית משתנה המשמש לערבוב של BSLBs ותערובת מאסטר שומנים, תמיסות חסימה, תערובת מאסטר חלבון וכתמי נוגדנים בקנה מידה קטן.
אלבומין בסרום אנושי, תמיסה מימית 30%Merck, Sigma-Aldrich12667-M
Human TruStain FcX Fc פתרון חסימת קולטןBioLegend422302Fc לחסימת קולטני Fc מדגימות רלוונטיות ביולוגית
Innovatis CASY מונה תאים ומנתח TTBiovendis Products GmbHלספירת תאים וקביעת גודל ונפח התא על סמך אי הכללת זרם חשמלי.
KCl, אשלגן כלוריMerck, אבקת Sigma-AldrichP5405, BioReagent, מתאים לתרבית תאים
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)ThermoFisher Scientific, Gibco25030-024
MgCl2, Magessium chlorideMerck, Sigma-AldrichM2393BioReagent, מתאים לתרבית תאים, מתאים לתרבית תאי חרקים
Microtube Insert עבור 24 x 1.5/2.0 מ"ל צינורותKeison ProductsP-2-24הכנסת מיקרו-צינור עבור Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini IncubatorLabnet International I5110A-230Vלדגירה (תרבית משותפת) של BSLB ותאים בהיעדר CO2
Minimum Essential Medium חומצות אמינו לא חיוניותThermoFisher Scientific, Gibco11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody controlMerck, Sigma-AldrichPP54משמש כבקרה חיובית למדידת נוגדנים הקשורים לתקני
חרוזי לכידת IgG של עכברעכבר IgG1, k Isotype, שיבוט MOPC-21BioLegend400129, 400112, 400130, 400144, 400128 ו-400170Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 ו-Brilliant Violet 785  מצומדים, בהתאמה.
עכבר IgG1, k איזוטיפ, שיבוט X40Becton Dickinson & פלוגה (BD), אופק562438מצומד סגול מבריק 421.
עכבר IgG1, κ בקרת איזוטיפ, שיבוט P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
עכבר IgG2a, k Isotype, שיבוט MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 מצומד
עכבר IgG2b, k איזוטייפ, שיבוט MPC-11BioLegend400330 ו-400355Alexa Fluor 647 ו-Brilliant Violet 785, בהתאמה
תרבית רקמות Multiwell 6 באר שטופלה בפלזמה גז ואקוםFalcon353046לתרבית והרחבה של תאי CD4+ ו-CD8+ T מטוהרים.
Na2HPO4, דיסודיום פוספטMerck, Sigma-AldrichS7907
NaCl, נתרן כלוריMerck, Sigma-AldrichS5886BioReagent, מתאים לתרבית תאים, מתאים לתרבית תאי חרקים, מתאים לתרבית תאי צמחים, ≥ 99%
NiSO4, ניקל(II) סולפטMerck, Sigma-Aldrich656895לרוויה של אתרי NTA; נוסף בתהליך החסימה
פניצילין סטרפטומיצין [+]10,000 יחידות פניצילין; [+] 10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיציןThermoFisher Scientific, Gibco15140-122
פוספט בופר מי מלח pH 7.4, סטריליThermoFisher Scientific, Gibco10010ללא Ca2+ או Mg2+ הוסיף
יחידת מסנן פוליאתרסולפון (PES)Thermo Scientific Nalgene  UY-06730-43קרום PES הידרופילי עם קשירת חלבון נמוכה מקל על סינון תמיסות בעלות תכולת חלבון גבוהה
ארגון PURESHIELD ISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-Yלהגנה על מלאי השומנים המאוחסנים ב-+4 ºC.
סטרפטווידין מטוהרBioLegend280302
קוונטום Alexa Fluor 488 חרוזי MESFBangs Laboratories Inc.488חרוזי בנצ'מרק לאינטרפולציה של מולקולות Alexa Fluor 488 הקשורות לתאים ו/או BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF חרוזיםBangs Laboratories Inc.647חרוזי בנצ'מרק לאינטרפולציה של מולקולות Alexa Fluor 647 הקשורות לתאים ו/או BSLB
חולדה נגד עכבר IgG Kappa Light Chain, שיבוט OX-20ThermoFisher Scientific, invitrogenSA1-25258מתויג בבית עם Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
רקומביננטי אנושי IL-2Peprotech200-02-1MG
RMPI בינוני 1640 (1x); [-] L-גלוטמיןThermoFisher Scientific, Gibco31870-025
Rosette קוקטייל העשרת תאי B אנושייםSTEMCELL Technologies15064בידוד של תאי B למדידת צפיפות חלבונים באוכלוסיות תאים מטוהרות
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment CocktailSTEMCELLTechnologies 15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell העשרת קוקטיילSTEMCELL טכנולוגיות15361העשרה מוקדמת של תאי T CD4+ CD127Low לבידוד במורד הזרם של Tregs על ידי FACS.
רוזטה אנושית CD8+ קוקטייל העשרת תאי TSTEMCELL Technologies15063
RPMI בינוני 1640 (1x); [-] פנול אדוםThermoFisher Scientific, Gibco11835-063לדגירה (תרבית משותפת) של BSLB ותאים בהיעדר CO2. מדיה נטולת אדום פנול מפחיתה את האוטופלואורסצנטיות של תאים במדידות מבוססות זרימה, ציטומטריה ומיקרוסקופיה.
נתרן פירובט (100 מ"מ)ThermoFisher Scientific, Gibco11360-070
מיני צנטריפוגה נבטיםFisherScientific, Heathrow Scientific LLC120301מיקרוצנטריפוגה ספסלית המשמשת לשטיפת חרוזי סיליקה ו-BSLB בצינורות אפנדורף של 1.5 מ"ל.
צינורות פוליסטירן עגולים עם מכסה סטרילי 5 מ"ל Falcon352058
UltraComp eAds פיצוי חרוזיםThermoFisher Scientific, invitrogen01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCOThermo Fisher Scientific, Invitrogen ™ברקוד 89882
352052SS05003 FCM בקר צבע

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528(2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TICAM 1

מאמרים קשורים