מאמר שיטה

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/63136

⸱

11 באפריל 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוכיחו את עצמם כמערכת מודל רבת ערך לחקר תהליכים התפתחותיים וביולוגיים של תאים. הבנת תהליכים ביולוגיים אלה דורשת לעתים קרובות הדמיה ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותה חיה. לזמני התאוששות ארוכים הקשורים לשיטות אימוביליזציה קונבנציונליות המבוצעות על רפידות אגר יש השפעות מזיקות על בריאות בעלי החיים, ולכן אין זה ראוי לדמות שוב ושוב את אותה חיה לאורך תקופות זמן ארוכות. מאמר זה מתאר תכנון שבב מיקרופלואידי, שיטת ייצור, פרוטוקול גידול C. elegans על השבב, ושלוש דוגמאות להדמיה ארוכת טווח לחקר תהליכים התפתחותיים בחיות בודדות. השבב, המיוצר עם פולידימתילסילוקסן ומלוכד על זכוכית כיסוי, משתק בעלי חיים על מצע זכוכית באמצעות קרום אלסטומרי המוסט באמצעות גז חנקן. אימוביליזציה מלאה של C. elegans מאפשרת הדמיה חזקה בהילוך מהיר של אירועים תאיים ותת-תאיים באופן נטול הרדמה. גיאומטריית תעלה עם חתך רוחב גדול מאפשרת לבעל החיים לנוע בחופשיות בתוך שני ממברנות בידוד אטומות חלקית המאפשרות צמיחה בתעלה עם אספקת מזון רציפה. באמצעות שבב פשוט זה, ניתן לבצע הדמיה של תופעות התפתחותיות כגון גדילת תהליכים עצביים, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירונים החושיים PVD, כאשר החיה גדלה בתוך התעלה. שבב הגידול וההדמיה לטווח ארוך פועל עם קו לחץ יחיד, ללא שסתומים חיצוניים, חומרים מתכלים נוזליים זולים, ומשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בתולעים הניתנים להתאמה בקלות על ידי מעבדות אחרות באמצעות C. elegans.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans הוכיח את עצמו כאורגניזם מודל רב עוצמה לחקר ביולוגיה של התא, הזדקנות, ביולוגיה התפתחותית ונוירוביולוגיה. יתרונות כגון גופו השקוף, מחזור חיים קצר, תחזוקה קלה, מספר מוגדר של תאים, הומולוגיה עם מספר גנים אנושיים וגנטיקה שנחקרה היטב הובילו לכך ש- C. elegans הפך למודל פופולרי הן לתגליות ביולוגיות בסיסיות והן למחקר יישומי 1,2. הבנת התהליכים הביולוגיים וההתפתחותיים של התא מתצפיות ארוכות טווח חוזרות ונשנות על בעלי חיים בודדים יכולה להתברר כמועילה. באופן קונבנציונלי, C. elegans מורדם על רפידות אגר ומצולם תחת מיקרוסקופ. השפעות שליליות של חומרי הרדמה על בריאותם של בעלי חיים מגבילות את השימוש בבעלי חיים מורדמים להדמיה לסירוגין ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותו בעל חיים 3,4. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיות והתאמתן ללכידה ללא הרדמה של C. elegans עם סכנות בריאותיות זניחות מאפשרות הדמיה ברזולוציה גבוהה של אותו בעל חיים לאורך זמן קצר וארוך.

שבבים מיקרופלואידיים תוכננו עבור C. elegans'5 סינון תפוקה גבוהה 6,7,8, לכידה וחלוקה9, בדיקת סמים 10,11, גירוי נוירונים עם הדמיה ברזולוציה גבוהה 12, והדמיה ברזולוציה גבוהה שלהחיה 12,13,14. יריעות מיקרופלואידיות דקות במיוחד לאימוביליזציה בשקופיות פותחו גםהן 15. מחקרים ארוכי טווח של C. elegans בוצעו באמצעות תמונות ברזולוציה נמוכה של בעלי חיים הגדלים בתרבית נוזלית כדי לבחון גדילה, דינמיקה של סידן, השפעות סמים על התנהגותם16,17,18,19, אריכות ימיהם והזדקנותם20. מחקרים ארוכי טווח המשתמשים במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה בוצעו כדי להעריך את ההתפתחות הסינפטית21, התחדשות עצבית22 ותוספת מיטוכונדריאלית23. הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה ומעקב אחר גורל התא והתמיינותו נעשו במכשירים רב-ערוציים24,25. מספר אירועים תאיים ותת-תאיים מתרחשים על פני סקאלות זמן של מספר שעות ודורשים לכידה של אותו אדם בנקודות זמן שונות במהלך התפתחותם כדי לאפיין את כל שלבי הביניים בתהליך כדי להבין את הדינמיקה התאית in vivo. כדי לדמות תהליכים ביולוגיים כמו אורגנוגנזה, התפתחות עצבית ונדידת תאים, החיה צריכה להיות משותקת באותו כיוון בכמה נקודות זמן. פרסמנו בעבר פרוטוקול להדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans במשך יותר מ-36 שעות כדי לקבוע היכן מוסיפים מיטוכונדריה לאורך תאי העצב של קולטני המגע (TRNs)23.

מאמר זה מספק פרוטוקול לביסוס מתודולוגיה מבוססת מיקרופלואידיקה להדמיה חוזרת ונשנית ברזולוציה גבוהה. מכשיר זה, עם ערוץ זרימה יחיד, מתאים ביותר להדמיה חוזרת ונשנית של חיה בודדת לכל מכשיר. כדי לשפר את התפוקה ולצלם בעלי חיים רבים בו-זמנית, ניתן לחבר התקנים מרובים לאותו קו לחץ, אך עם מחברים תלת-כיווניים נפרדים השולטים על חיה אחת בכל מכשיר. העיצוב שימושי למחקרים הדורשים תמונות ברזולוציה גבוהה של קיטועי זמן כגון תהליכים התפתחותיים פוסט-עובריים, נדידת תאים, הובלת אברונים, מחקרי ביטוי גנים ועוד. הטכנולוגיה עשויה להיות מגבילה עבור יישומים מסוימים כגון מחקרי תוחלת חיים והזדקנות הדורשים גדילה והדמיה מקבילים של בעלי חיים רבים בשלב מאוחר. אלסטומר פולידימתילסילוקסן (PDMS) שימש לייצור מכשיר זה בשל יציבותו הביולוגית26, תאימות ביולוגית 27,28, חדירות גז 29,30, ומודולוס אלסטי הניתן לכוונון 31. התקן דו-שכבתי זה מאפשר צמיחה של בעלי חיים עם אספקת מזון רציפה בתעלה מיקרופלואידית ולכידה של C. elegans בודדים באמצעות דחיסת ממברנת PDMS באמצעות גז חנקן. מכשיר זה הוא הרחבה של המכשיר שפורסם בעבר עם היתרון של גידול והדמיה של אותה חיה במיקרו-ערוץ תחת אספקת מזון רציפה3. רשת ממברנות הבידוד הנוספת וממברנת לכידה ברוחב 2 מ"מ מאפשרות אימוביליזציה יעילה של בעלי חיים מתפתחים. המכשיר שימש לצפייה בהתפתחות עצבית, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירוני PVD חושיים. בעלי החיים גדלים ללא השפעות בריאותיות שליליות במכשיר וניתן לשתק אותם שוב ושוב כדי להקל על הדמיית אירועים תת-תאיים באותה חיה במהלך התפתחותה.

הפרוטוקול כולו מחולק לחמישה חלקים. חלק 1 מתאר ייצור מכשירים עבור שבב הגידול וההדמיה. חלק 2 מתאר כיצד להקים מערכת לחץ עבור סטיית ממברנת PDMS כדי לשתק ולבודד C. elegans בודדים. חלק 3 מתאר כיצד לסנכרן C. elegans על צלחת מדיום גידול נמטודה (NGM) להדמיית מכשירים. חלק 4 מתאר כיצד לטעון חיה בודדת במכשיר ולגדל את החיה בתוך המכשיר המיקרופלואידי במשך מספר ימים. חלק 5 מתאר כיצד לשתק חיה בודדת בנקודות זמן מרובות, לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות שונות ולנתח את התמונות באמצעות פיג'י.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור של מכשיר גידול והדמיה

  1. ייצור עובש SU8
    1. עצבו תבניות 1 (שכבת זרימה) ו-2 (שכבת בקרה) באמצעות צורות מלבניות בתוכנת עיבוד תמלילים (או בתוכנת CAD לתכנון בעזרת מחשב) והדפיסו את מסכות הצילום בעזרת מתווה לייזר עם גודל תכונה מינימלי של 8 מיקרומטר על סרט מבוסס פוליאסטר (איור 1).
    2. חותכים פרוסות סיליקון לחתיכות של 2.5 ס"מ × 2.5 ס"מ ומנקים אותן עם 20% KOH למשך דקה אחת. שטפו את הוופלים במים שעברו דה-יוניזציה (DI). השתמש בפרוסה אחת כל אחת עבור הזרימה ושכבת הבקרה.
      אזהרה: KOH הוא קורוזיבי ויש לטפל בו בזהירות.
    3. יבשו את החלקים עם גז חנקן דחוס 14 psi ואחריו התייבשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לפני שממשיכים לשלב הבא, מצננים את שתי החלקים לטמפרטורת החדר.
    4. קח את אחת מחתיכות הסיליקון ושים אותה על צ'אק של מעיל ספין והפעל את הוואקום כדי להחזיק את הוופל במקום. על חתיכת הסיליקון, שים ~ 20 μL של הקסמתיל-דיסילן (HMDS) וצפה אותו באמצעות מעיל הסיבוב ב 500 סיבוב לדקה (סל"ד) במשך 5 שניות ואחריו 3,000 סל"ד במשך 30 שניות.
      התראה: שלב זה צריך להתבצע באור צהוב. אין להשתמש באור לבן בחדר.
    5. כדי לקבל עובי פוטורסיסט אחיד של ~ 40 מיקרומטר (ספציפי לשכבת הזרימה; מתאים להדמיה מוקדמת של זחלים שלב 1 עד שלב 3 (L1 - L3) בעלי חיים), מצפים את פרוסת הסיליקון עם ~ 1.5 מ"ל של פוטורסיסט-1 שלילי באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד במשך 5 שניות ואחריו 2,000 סל"ד במשך 30 שניות.
    6. חזור על שלבים 1.1.4 ו- 1.1.5 עם הוופל השני כדי לקבל עובי פוטורסיסט אחיד של ~ 40 מיקרומטר ספציפי לשכבת הבקרה.
    7. לחלופין, כדי להגדיל את עובי שכבת הזרימה ל~80 מיקרומטר עבור בעלי חיים מבוגרים יותר, מצפים פרוסות סיליקון עם ~1.5 מ"ל של פוטורסיסט-2 שלילי באמצעות מעיל הסיבוב ב-500 סל"ד למשך 5 שניות ואחריו 2,000 סל"ד למשך 30 שניות. עובי זה מתאים לשלב L3 לבעלי חיים בוגרים.
      אזהרה: החזיקו את פרוסות הסיליקון בצדדים כדי למנוע נזק לשכבות המצופות בספין. השאר את האורות הלבנים כבויים במהלך שלב זה.
    8. אופים את חתיכות הסיליקון המצופות בפוטורסיסט (לשכבות זרימה ובקרה) על פלטה חמה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ואחריה 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מצננים את החתיכות האפויות לטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן לאחסן את חתיכות הסיליקון האפויות למשך יום אחד לפני שממשיכים לשלב הבא. יש לאחסן בחושך ולא לחשוף לאור לבן.
    9. הניחו חתיכות סיליקון רכות על במת החשיפה של תאורת ה- UV כאשר המשטח המצופה בפוטורסיסטים פונה למנורת ה- UV. חשוף את שני החלקים בנפרד ל- UV למשך 15 שניות, באמצעות מנורה של 200 וואט, באמצעות מסיכת צילום עם תבניות 1 ו- 2 כדי לקבל שכבות זרימה ובקרה, בהתאמה.
      אזהרה: יש להרכיב משקפי מגן ולהימנע מחשיפה ישירה לאור UV. אין להדליק אור לבן בחדר בשלב זה.
    10. אופים את שני חלקי הסיליקון החשופים עם שכבה מצופה הפונה כלפי מעלה, בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס ואחריה 95 מעלות צלזיוס למשך דקה ו-10 דקות בהתאמה. מצננים את החלקים לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים לשלב הבא.
    11. פתח את התבניות על ידי השריית חתיכות הסיליקון בתמיסת מפתח הפוטורסיסט (דילול 1:3 של המפתח באיזופרופנול) למשך 20 דקות. ברגע שהתבנית נראית לעין, יש לשטוף את החלקים באלכוהול איזו-פרופיל טהור (IPA) ולייבש בעדינות באמצעות גז חנקן (14 psi).
      התראה: השתמש בסביבה מאווררת היטב לטיפול כימי זה כדי למנוע חשיפה לבני אדם. השתמש באור לבן רק לאחר פיתוח התכונות ושטיפתן באמצעות IPA.
    12. יש לשמור את חתיכות הסיליקון במייבש כאשר המשטח המצופה פונה כלפי מעלה. חשוף את החלקים לאדי סילאן על ידי מזיגת 50 μL של טריכלורו טהור (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן על פלסטיק קטנה או מגלשת זכוכית. מניחים את הגביע/מחליק בתוך חומר ייבוש ודוגרים במשך שעתיים.
      אזהרה: יש להימנע מחשיפה ישירה לאדי סילאן. יש להשתמש תמיד בתא אטום לטיפול באדי סילאן.
      הערה: במידת הצורך, ניתן לאחסן את חתיכות הסיליקון שפותחו למשך 1-2 ימים לפני שתמשיך לשלב הבא.
  2. ייצור שבבי PDMS
    1. הכינו PDMS בכוס פלסטיק על ידי ערבוב בסיס האלסטומר עם חומר הריפוי ביחס של 10:1. מערבבים היטב את התוכן על ידי ערבוב מתמיד במשך 3 דקות. הערבוב ייצור הרבה בועות אוויר בתערובת PDMS.
    2. דגה את תערובת PDMS במייבש למשך 30 דקות כדי להסיר את כל בועות האוויר.
      התראה: ודא כי בועות אוויר מוסרות מתערובת PDMS לפני ששפכו אותן על התכונות, שכן בועות עלולות לגרום להתקנים פגומים ולא פונקציונליים.
    3. מניחים את פרוסות הסיליקון עם שכבת הבקרה (דוגמה 2) בצלחת פטרי. יש לשפוך בעדינות שכבת תערובת PDMS בעובי 5 מ"מ על חתיכת הסיליקון ולהימנע מהיווצרות בועות.
    4. דגה את תערובת PDMS במייבש כדי להסיר בועות נוספות הנוצרות במהלך תהליך המזיגה של PDMS.
    5. הניחו את פרוסת הסיליקון עם שכבת זרימה (תבנית 1) על צ'אק המסתובב תוך הפעלת לחץ ואקום של 200-500 mTorr כדי להחזיק את הוופל. יוצקים ~ 1 מ"ל של PDMS על פרוסת הסיליקון ומצפים אותה באמצעות מעיל ספין ב 500 סל"ד במשך 5 שניות ואחריו 1,000 סל"ד במשך 30 שניות כדי לקבל שכבה בעובי ~ 80 מיקרומטר.
    6. אופים את שני פרוסות הסיליקון בעזרת PDMS מצופה ספין ושופכים שכבות PDMS בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס בתנור הסעה באוויר חם למשך 6 שעות. לאחר האפייה, המתינו עד שהחתיכות יתקררו בטמפרטורת החדר.
    7. חותכים את שכבת ה-PDMS בעובי 5 מ"מ מחתיכת הסיליקון סביב שכבת הבקרה (תבנית 2) באמצעות להב חד ומקלפים אותה ממצע הסיליקון.
    8. נקב שני חורים בקוטר ~ 1 מ"מ באמצעות מנקב האריס במאגר של בלוק PDMS כדי לחבר את ערוץ האימוביליזציה וכניסות תעלת הבידוד לקווי הגז עבור סטיות ממברנת PDMS.
    9. הנח את חתיכת הסיליקון עם שכבת PDMS מצופה ספין על תבנית 1 (שכבת זרימה), כאשר המשטח המצופה PDMS פונה כלפי מעלה, על מגש פלסטיק. שמור את בלוק ה-PDMS המנוקב עם תבנית 2 (שכבת בקרה) על המגש כשהצד המעוצב פונה כלפי מעלה.
    10. שמרו את מגש הפלסטיק בתוך חומר ניקוי פלזמה וחשפו את שני משטחי ה-PDMS לפלזמה אווירית של 18 וואט למשך 2 דקות תחת ואקום נמוך (200-600 mTorr). יש למרוח את הוואקום עד שהתא הופך לסגול בהיר. בצע שלב זה תחת תאורה חלשה כדי לראות את צבע הפלזמה משתנה.
    11. הוציאו את שני הבלוקים שטופלו בפלזמה וקשרו בעדינות את הבלוקים על ידי לחיצה על המשטחים המטופלים בפלזמה של תבניות 1 ו-2 יחד. אופים את התבניות המלוכדות בחום של 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים בתנור הסעה עם אוויר חם.
    12. הוציאו את המכשיר הדחוס מהתנור. חותכים את המכשיר המחובר מתוך פרוסת סיליקון עם תבנית 1 ותבנית 2, ומנקבים חורים במאגרי הכניסה והיציאה של שכבת הזרימה באמצעות מנקב האריס.
    13. הניחו את בלוק ה-PDMS המחובר כששכבת הזרימה פונה כלפי מעלה על מגש פלסטיק. שמרו על זכוכית כיסוי נקייה (#1.5) על אותו מגש. חשוף את הבלוקים ואת זכוכית הכיסוי לפלזמה אוויר של 18 W למשך 2 דקות. התאם את לחץ הוואקום כדי לראות תא סגול.
      הערה: שלב זה צריך להיעשות בתאורה חלשה כדי לראות את שינוי צבע הפלזמה. כדי לנקות את זכוכית הכיסוי, יש לשטוף אותה עם IPA ולייבש באמצעות גז חנקן ב-14 psi.
    14. מניחים את גוש ה-PDMS החשוף בפלזמה על גבי זכוכית הכיסוי ואופים את המבנה המלוכד בתנור בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. אחסן את ההתקן בתא נקי לכל ניסוי עתידי.

2. פרימה של ממברנת PDMS

  1. קח את המכשיר ושים אותו על סטריאומיקרוסקופ וחבר את הצינורות. חבר צינור מיקרו פלקס (קוטר פנימי ~ 5 מ"מ, קוטר חיצוני ~ 8 מ"מ) לקו גז חנקן דחוס בקצה אחד. חבר מחבר תלת-כיווני בקצה השני. צינורות 1 ו -2 של המחברים התלת-כיווניים יחוברו לממברנות המלכודת והבידוד, בהתאמה.
  2. חבר שני צינורות מיקרו פלקס (קוטר פנימי ~ 1.6 מ"מ, קוטר חיצוני ~ 5 מ"מ) לשתי יציאות היציאה של הפקק התלת-כיווני. חבר את הקצה השני של שני הצינורות למחט באורך 8 מ"מ 18 גרם.
  3. מלא את שכבת הזרימה במאגר M9 באמצעות מיקרופיפטה דרך פתח הכניסה. ממלאים את שני הצינורות במי DI דרך הקצה המחובר למחט. הכנס את שתי המחטים לתוך החורים המנוקבים, המחברים את קרום הבידוד והלכידה, בהתאמה.
  4. פתח את וסת גז החנקן ב 14 psi וסובב את השסתום התלת-כיווני מצינור 1 כדי לדחוף את המים לתוך המכשיר דרך התעלות המיקרופלואידיות בשכבות הבקרה כלומר, קרום המלכודת והבידוד.
  5. המתן עד שהמים ימלאו את הערוץ ללא נוכחות של טיפות אוויר בשני הערוצים. ברגע שהתעלות מתמלאות לחלוטין במים, התעלות נחשבות לפרימיות.
  6. שחררו את הלחץ באמצעות ה-stopcock התלת-כיווני ברגע שהתעלות מתמלאות במים ומוכנות מראש. פרימינג יכול להוביל לבועות בשכבת הזרימה, להסיר את הבועות על ידי הזרמת מדיה נוספת דרך ערוץ הזרימה.

3. ג. אלגנס תחזוקה וסנכרון

הערה: C. elegans זנים: המחקר השתמש בעקבות טרנסגנים PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]) לפיתוח הפות 32, jsIs609 (mec7p::MLS (אות לוקליזציה של מטריצה מיטוכונדריאלית)::GFP)33 לפיתוח נוירון קולטן מגע (TRN) והדמיית הובלת מיטוכונדריה, ו-wdIs51(F49H12.4::GFP + unc-119(+)) כדי לעקוב אחר פיתוח PVD34. תקן C. elegans תרבות ופרוטוקול תחזוקה היה אחריו35.

  1. לגדל C. elegans על מדיום צמיחת נמטודה (NGM) צלחות פטרי עם E. coli OP50 כמקור מזון ב 22 מעלות צלזיוס. שמרו על זני C. elegans על ידי העברה חוזרת ונשנית של כמה הרמפרודיטים או חיתוך כמות קטנה של אגר עם כמה בעלי חיים לצלחת NGM חדשה עם מדשאה OP50.
  2. לאחר 3-5 ימים, בדוק את צלחת NGM לצמיחת בעלי חיים וביצי C. elegans. לאסוף ולהעביר כ-30 ביצים מצלחת לצלחת NGM טרייה עם מדשאה OP50.
  3. כדי לסנכרן בעלי חיים להדמיה, העבירו את כל הביצים שלא נקטפו מהצלחת כל שעתיים לצלחת טרייה ושמרו עליהן בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. כ-15-20 ביצים יבקעו בכל צלחת.
  4. בחרו את בעלי החיים בין 14-16 שעות ל-28-30 שעות לאחר הבקיעה לשלבי זחל 2 (L2) וזחל 3 (L3), בהתאמה. העבירו את בעלי החיים למכשיר המיקרופלואידי להדמיה. הוסף אספקת מזון כמתואר בסעיף הבא כדי לשמור על החיה בתוך המכשיר לניסויי גדילה והדמיה ארוכי טווח.

4. C . elegans צמיחה בתוך מכשיר הגידול וההדמיה המיקרופלואידי

  1. הרכיבו מכשיר מיקרופלואידי לגידול והדמיה על מיקרוסקופ הפוך וצפו בתבנית 2, לאחר חיבור קרומי הבידוד וקרום האימוביליזציה, בהגדלה נמוכה (4x או 10x). ודאו שהתעלות מלאות במים מזוקקים ונקיים.
  2. הכן תמיסה טרייה של 1 ליטר של מדיום S באמצעות 10 מ"ל של 1 M אשלגן ציטראט pH 6.0, 10 מ"ל של תמיסת מתכות קורט, 3 מ"ל של 1 M CaCl2, 3 מ"ל של 1 M MgSO4. הכן את הפתרון בתנאים סטריליים. אין לבצע אוטוקלב של מדיום ה-S.
  3. מלא את ערוץ הזרימה במדיית גדילה (S בינונית) 10 דקות לפני הניסוי. הימנע מבועות אוויר בערוץ הזרימה. זרימה מדיום נוסף במידת הצורך כדי להסיר בועות אוויר.
  4. בחר חיה בודדת משלב ההתפתחות הנדרש מצלחת NGM במדיום S של 10 μL באמצעות מיקרופיפטה ודחף את החיה לתעלת הזרימה דרך חור הכניסה.
  5. עקוב אחר מיקום בעלי החיים בערוץ הזרימה באמצעות מטרת הגדלה נמוכה. הזרימו מדיום נוסף דרך הכניסה או היציאה כדי לדחוף את החיה ולמקם אותה בתוך תעלת הזרימה המוגבלת בין שני קרומי הבידוד.
  6. פתח את הסטופק התלת-כיווני כדי להפעיל לחץ של 14 psi בתעלות הבידוד ולדחוף את הממברנות למטה לתוך תעלת הזרימה.
    הערה: הממברנה אוטמת חלקית את תעלת הזרימה ומגבילה את תנועת בעלי החיים לאזור שבין שני ממברנות הבידוד.
  7. השתמש במושבה אחת של E. coli OP50 מצלחת פסים כדי לחסן 250 מ"ל של מרק L (2.5 גרם באקטו-טריפטון, 1.25 גרם לקטו-שמרים, 1.25 גרם NaCl ב- H2O). לגדל את התרבות מחוסנת בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  8. Aliquot 500 μL של תרבית OP50 לתוך צינורות צנטריפוגה סטריליים 1.5 מ"ל ולאחסן את המלאי ואת aliquot במשך 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס.
  9. גלולה למטה תרבות OP50 על ידי צנטריפוגה ב 1.3 x גרם במשך 5 דקות. ממיסים את הכדור ב-1 מ"ל של S בינוני טרי (דילול פי 0.5) ומאחסנים אותו בטמפרטורת החדר למשך 3-4 ימים. השתמש ב- OP50 המדולל הזה כדי להזין C. elegans בתוך התקנים מיקרופלואידיים.
  10. השאירו טיפה של מדיום S על גבי מאגרי הכניסה והיציאה כדי להפחית את האידוי של מדיום S בערוץ הזרימה.
  11. קח תמיסת OP50 מדוללת במיקרופיפטה של 10 μL. הסר את קצה המיקרו המלא בתמיסת OP50 מהפיפטה והכנס את הקצה למאגר הכניסה. לאחר מכן מניחים עוד קצה micropipette עם 10 μL של תמיסת מזון ולהכניס אותו לתוך מאגר מוצא.
  12. אטמו את ראש הקצה והפעילו לחץ באמצעות אצבע כדי להבטיח המשכיות של תמיסות מזון ללא מרווח אוויר. החלף את קצה המיקרופיפטה בתמיסת OP50 בכל יום שאינו עולה על 3-4 ימים.
  13. מלאו 20-30 מיקרוליטר נוספים של תמיסת מזון בשני הקצוות. הוסף או הסר תמיסת מזון אל קצה המיקרופיפטה וממנו כדי להתאים את השיפוע לדחוף את החיה בתעלת הזרימה ולהתאים את מיקום החיה מתחת לקרום הלכידה לצורך הדמיה.
  14. נטר את זרימת החיידקים כדי לוודא שהיא רציפה דרך קרומי הבידוד הסגורים חלקית בתעלת הזרימה באמצעות תמונות שדה בהיר.
    הערה: בהיעדר זרימת חיידקים, בעלי חיים עשויים לאכול את החיידקים הזמינים בתעלת הזרימה שבין שני ממברנות הבידוד. במקרה שאין חיידקים או אין זרימה בתעלה, החליפו את שני קצוות המיקרופיפטה בכניסה ובשקע בקצות פיפטה חדשים מלאים באספקת מזון טרי.

5. C. elegans אימוביליזציה והדמיה

  1. C. אימוביליזציה של elegans מתחת לקרום הלכידה
    1. אתרו בעל חיים בודד בערוץ הגדילה בהגדלה נמוכה. התאם את גובה תמיסת המזון בשני קצוות המיקרופיפטה המחוברים למאגרי הכניסה והיציאה. דחפו את החיה בכיוון הנדרש באמצעות הפרשי הלחץ ההידרוסטטיים בתעלת הזרימה.
    2. מקמו את בעל החיים במרכז קרום הלכידה ועקבו אחר התנהגות השחייה שלו באמצעות מטרת הגדלה נמוכה (4x).
    3. סובב את הפקק התלת-כיווני כדי להגביר את הלחץ בתעלת המלכודת באיטיות. לשתק את החיה מתחת לקרום המלכודת בתנוחה ישרה לאורך קיר גבול תעלת הצמיחה.
      התראה: הימנע מלכידה של החיה על פני ערוץ הזרימה במצב כיפוף Z או U. זה גורם לגוף החיה להידחק בלחץ גדול יותר וגורם נזק בלתי הפיך לבריאותו.
  2. C. elegans הדמיה ושחרור מהממברנה
    1. לשאת ולהעמיס את המכשיר על במת מיקרוסקופ. הגדר מיקרוסקופ הפוך בהגדרות ההדמיה הרצויות עם כל הרכיבים האופטיים הדרושים (מטרה, מקור אור, מסנני פלואורסצנציה וגלאי) לשדה בהיר ברזולוציה גבוהה, ניגודיות הדמיה דיפרנציאלית (DIC) או הדמיה פלואורסצנטית (איור משלים 1).
    2. רכשו תמונה פלואורסצנטית בודדת או מספר תמונות של קיטועי זמן כדי ללכוד אירועים תאיים ותת-תאיים.
    3. קבל תמונות פלואורסצנטיות של נוירונים C. elegans כפונקציה של התפתחותם באמצעות מטרה של צמצם מספרי (NA) של 60x, 1.4, לייזר באורך גל של 488 ננומטר עם כוח לייזר של 7%-10%, מצלמת CCD, על מיקרוסקופ דיסק מסתובב. בצע הדמיה בהילוך מהיר באמצעות התוכנה המסופקת עם המיקרוסקופ וקבל תמונות במהירות של 4 פריימים לשנייה (איור משלים 1).
    4. לאחר רכישת תמונות, לשחרר את לחץ ההשמנה ולפקח על התנועה של החיה בהגדלה נמוכה - 4x ו 10x. יש להגביל את בעל החיים בתוך האזור המוגדר על ידי ממברנות מבודדות (המוחזקות מתחת ל-14 psi לאורך כל הניסוי).
    5. התאם את נפח תמיסת המזון בשני קצוות המיקרופיפטה כדי להמשיך זרימת מזון איטית המונעת על ידי כוח הכבידה בערוץ הצמיחה. זרימת מזון זו מתקבלת על ידי התאמת רמות תמיסות המזון במיקרופיפטים בכניסה ובשקע (בדרך כלל הפרש גובה של 1-5 מ"מ).
    6. דמיינו את הזרימה תחת שדה בהיר מתבנית הזרימה של החיידקים בתעלת הגדילה.
      הערה: בהיעדר זרימה, החיה אוכלת את חיידקי OP50 הזמינים, התעלה נראית צלולה, והחיה גוועת ברעב במשך כמה שעות. בעל חיים מורעב מפתח בדרך כלל אוטופלואורסצנטיות גבוהה, הניתנת לצפייה בקלות בעת רכישת תמונות פלואורסצנטיות בהילוך מהיר. לאירועים כאלה יש השפעות מזיקות על הפיזיולוגיה של בעלי חיים והם נמנעו בניסויים.
    7. חזור על שלבים 5.2.1-5.2.3 לאחר מרווח זמן מוגדר מראש כדי להשיג תמונות פלואורסצנציה/ DIC/שדה בהיר של אותו אדם בנקודות זמן מרובות.
    8. לאחר שהתמונות נרכשות במספר נקודות זמן רצויות מאותה חיה בודדת, שחררו את לחץ הבידוד והלכידה. שטפו את התעלה עם חיץ M9 ודחפו את החיה דרך מאגר הכניסה. החזירו את החיה מהמאגר והניחו את החיה על צלחת NGM טרייה לניטור בריאותי נוסף.
    9. שטפו את התעלה עם מאגר M9 כמה פעמים כדי להסיר חיידקים. שוטפים את תעלת הזרימה ב-70% אלכוהול אתילי (מדולל במים מזוקקים). ייבשו את התעלות על ידי דחיפת אוויר באמצעות מזרק. יש לאחסן את המכשיר במקום יבש ללא אבק לשימוש חוזר בעתיד.
  3. ניתוח תמונות וסטטיסטיקה
    1. השתמש בתוכנת FIJI ImageJ לניתוח תמונות tiff. תמונות טיף פתוחות של תמונות קיטועי זמן PVD מחיות wdIs51 בפיג'י ImageJ. חלץ את המישורים הטובים ביותר מאוסף מישורי z המציגים את התהליכים העיקריים על-ידי בחירה בכרטיסייה Image > פרוייקט 'אוספים' >- Z.
    2. סנן את כל סדרת התמונות ומצא מסגרות תמונה ספציפיות המכסות בהצלחה את כל התהליכים העצביים באמצעות חלקים חופפים של מסגרות התמונה של בעלי החיים. בחר תוסף > נתח מונה תאים > מסרגל הכלים של FIJI. פעולה זו תפתח חלון למספור ענפים שונים ולשמירה על ספירה של כל נוירון שנבחר.
    3. בחר אתחל מונים > > Type1 ולאחר מכן סמן את הענפים המשניים. לאחר מכן בחר סוג 2 וסמן רבעוני, לחץ על חלון תוצאות המציג ספירות של כל הענפים (איור משלים 2). שיטה זו תציג את הענפים שכבר נספרו.
    4. פתחו את התמונה החופפת הבאה וספרו את הענפים הנותרים. תהליך זה ימנע ספירה כפולה ויבטיח שכל תהליך ייספר. זהה וספור את המספר הכולל של ענפים ראשוניים הנמצאים בשלבי הזחל המוקדמים של C. elegans. בצע ניתוח דומה עבור התמונות עבור תהליכים משניים ורבעוניים בבעלי חיים מבוגרים יותר.
      הערה: מבוגרים מראים תהליכים רבים שמתעבעים בשרירי דופן הגוף ויכולים להיות קשים לספירה. ודא שכל תהליך נספר פעם אחת בלבד.
    5. חשב את המרחק בין גופי תאי ה-PVD בחיות wdIs51 על-ידי שרטוט קו מקוטע מגוף תא ה-PVD (CB) ל-PVC CB. עבור חיות שלב זחל 4 (L4), גופי התאים רחוקים זה מזה ואינם נמצאים באותה מסגרת כאשר הם מצולמים עם מטרה של פי 60.
    6. בחרו תמונות חופפות מהאוסף כדי לכסות את כל אורך החיה מראש ועד הזנב באמצעות הכרטיסייה 'תמונה' > הפרויקט 'אוספים' >-Z מ-ImageJ. ציירו קווים מקוטעים לאורך התהליך העצבי בין ה-PVD ל-PVC CBs.
    7. מדוד את האורכים של כל הקווים המפולחים באמצעות ImageJ > נתח > מדידה. הוסף את האורכים עבור כל המקטעים כדי לחשב את המרחק הכולל בין CBs PVD ו- PVC עבור כל נקודת זמן.
    8. עבור אורך תאי עצב של TRNs בחיות jsIs609 , טען את התמונות בפיג'י. ציירו קו מקוטע לאורך המיקרוטובולים הלטרליים האחוריים (PLMs; נראים עם GFP מסיס) מגוף התא ועד למרכז המיטוכונדריה הראשון. חישוב אורך הקו עבור ערך המרחק הראשון.
    9. ציירו קו מקוטע ממרכז המיטוכונדריה הראשונה לשנייה. חזור על תהליך זה עבור כל זוג מיטוכונדריה עד סוף אורך התהליך העצבי. הוסף את כל האורכים כדי לחשב את אורך התהליך העצבי הכולל.
    10. לצורך ניתוח שושלת התאים, טען את כל תמונות הפות בפיג'י וחלץ את תמונת המיקוד הטובה ביותר של התאים מתמונות קיטועי הזמן של מישורי z מרובים.
    11. הצג את הנתונים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). חשב מובהקות סטטיסטית באמצעות ANOVA חד-כיווני עבור יותר משתי דגימות או מבחן t של שתי דגימות עבור זוג דגימות. ציין משמעות לפי ערך p < 0.05 (*), ערך p < 0.005 (**) וערך p > 0.05 (ns, לא משמעותי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מכשיר: מכשיר הגדילה וההדמיה מורכב משתי שכבות PDMS המחוברות זו לזו (איור 1) באמצעות מליטה פלזמה בלתי הפיכה. שכבת הזרימה (תבנית 1) שאורכה 10 מ"מ וגובהה 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר מאפשרת לנו לגדל את החיה בתרבית נוזלית (איור 1A). לשכבת הלכידה (תבנית 2) יש קרום ברוחב 2 מ"מ (איור 1B) לשיתוק החיה לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה. המסכה של שכבת הלכידה יוצרת גם זוג קרומי בידוד להגבלת תנועת בעלי חיים בתוך מקטע של תעלת הזרימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה תואר פרוטוקול לייצור ושימוש בהתקן מיקרופלואידי פשוט לגידול C. elegans עם אספקת מזון קבועה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חיה בודדת במהלך התפתחותה. תהליך ייצור זה הוא פשוט וניתן לעשות זאת בסביבה לא סטרילית. סביבה נטולת אבק היא קריטית במהלך שלבי הייצור. נוכחותם של חלקיקי אבק תוביל למגע לא תקין בין שני משטחי ההדבקה, וכתוצאה מכך להדבקה ודליפה לקויה של המכשיר במהלך יישום בלחץ גבוה בעוד C. elegans משותקים. מתוך כל המכשירים המיוצרים, 95% מהמכשירים מתאימים לניסויים. מספר קטן של מכשירים נכשלים (5%) עקב הדבקה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. ו- S.P.K. הם מחברים של פטנט ממתין על מכשיר הגידול וההדמיה המיקרופלואידי (בקשת פטנט מספר 640/CHE/2011).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתקן ההדמיה CIFF, NCBS על השימוש במיקרוסקופים הקונפוקליים הנתמכים על ידי שעון הקיץ - המרכז לננוטכנולוגיה (לא. SR/55/NM-36-2005). אנו מודים למימון מחקר מ- DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), דיסק מסתובב הנתמך על ידי DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK וגאוטם מנון), ומענק HHMI-IECS מספר 55007425 (SPK). זנים HB101, PS3239 ו-wdIs51 סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). S.P.K. ייצרה את jsIs609 במעבדה של מייק נונט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
18 מחטי Gסיגמא-אולדריץ', בנגלור, הודומד 18
עצירה תלת כיווניתCole-ParmerWW-30600-02Masterflex הולם עם מצלמת CCD מנעול לואר
וטכנולוגיה Andor TechnologyEMCCD C9100-13no
סרט לוח מעגליםהדמיית קו עדין, קולורדו, ארה"בהעיצובים מודפסים עם 65,024 נקודות לאינץ' (DPI)
תנור הסעהMeta-Lab Scientific Industries, הודוMSI-5
Coverslipsכחול סטטיסטיקה מיקרוסקופית כיסוי זכוכית22 מ"מ x 10Gms
אתנולHi media
Harris אגרוף חד ליבתי 1 מ"מQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich, בנגלור, הודו440191
פלטהחמה  IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
סריקת לייזר מיקרוסקופZEISSLSM 5 LIVE
MicropipetteTips Tarsons0.5-10 & micro; קצות מיקרופיפטה L משמשים לאספקת מזון
שלילי Photoresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
שלילי Photoresist-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
גז חנקןספק מקומיחנקן מסחרינפח צילינדר של 7 מטר מעוקב
PDMS (תמיסת ריפוי)תאגיד דאו קורנינג, מישיגן, ארה"ב&nbsp; תמיסת ריפוי סילגארדחומר ריפוי
צלחות פטריPraveen Scientific Corporation
מנקה פלזמההאריק פלזמה, ניו יורק, ארה"ב  PDC-32G
סכין גילוח ולהביםליסטר להב
סיליקון אלסטומר (בסיס)Dow Corning Corporation, MI, ארה"בSylgard 184 בסיסאלסטומר
בסיס צינורות סיליקוןפישר סיינטיפיקצינורות פלסטיק בקוטר הפנימי 1.59 מ"מ והקוטר החיצוני 3.18 מ"מ
פרוסת סיליקוןפרוסת אוניברסיטת פרוסה, MA, ארה"ב[100] אוריינטציה, 4 אינץ' קוטרחתיכות קטנות (2 מ"מ ופעמים; 2 מ"מ) נחתכו מפרוסת קוטר 100 מ"מ
Spin CoaterSPS-Europe BV, הולנדSPIN 150
מיקרוסקופ דיסק מסתובבPerkin Elmer מערכת VOX אולטרה-תצוגהCSU-X1-A3 Nהמערכת צוידה בארבעה לייזרים (405/488/561/640 ננומטר) ונשלטה בחבילת התוכנה Volocity.
מפתח SU8Microchem, MA, ארה"בSU8
טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאןסיגמא-אולדריץ', בנגלור, הודו448931טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי סילאן הם
מנורת UVOriel Instruments, בנגלור, הודו200 וואט ומקור אור UV קולימציה
תוכנת Volocityפרקין-אלמר ניתוח
גז כירורגי מפתח רעילה תמונה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037(2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023(2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192(2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500(2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499(2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Long Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

מאמרים קשורים