הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans
במאמר זה
סיכום
תקציר
Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוכיחו את עצמם כמערכת מודל רבת ערך לחקר תהליכים התפתחותיים וביולוגיים של תאים. הבנת תהליכים ביולוגיים אלה דורשת לעתים קרובות הדמיה ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותה חיה. לזמני התאוששות ארוכים הקשורים לשיטות אימוביליזציה קונבנציונליות המבוצעות על רפידות אגר יש השפעות מזיקות על בריאות בעלי החיים, ולכן אין זה ראוי לדמות שוב ושוב את אותה חיה לאורך תקופות זמן ארוכות. מאמר זה מתאר תכנון שבב מיקרופלואידי, שיטת ייצור, פרוטוקול גידול C. elegans על השבב, ושלוש דוגמאות להדמיה ארוכת טווח לחקר תהליכים התפתחותיים בחיות בודדות. השבב, המיוצר עם פולידימתילסילוקסן ומלוכד על זכוכית כיסוי, משתק בעלי חיים על מצע זכוכית באמצעות קרום אלסטומרי המוסט באמצעות גז חנקן. אימוביליזציה מלאה של C. elegans מאפשרת הדמיה חזקה בהילוך מהיר של אירועים תאיים ותת-תאיים באופן נטול הרדמה. גיאומטריית תעלה עם חתך רוחב גדול מאפשרת לבעל החיים לנוע בחופשיות בתוך שני ממברנות בידוד אטומות חלקית המאפשרות צמיחה בתעלה עם אספקת מזון רציפה. באמצעות שבב פשוט זה, ניתן לבצע הדמיה של תופעות התפתחותיות כגון גדילת תהליכים עצביים, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירונים החושיים PVD, כאשר החיה גדלה בתוך התעלה. שבב הגידול וההדמיה לטווח ארוך פועל עם קו לחץ יחיד, ללא שסתומים חיצוניים, חומרים מתכלים נוזליים זולים, ומשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בתולעים הניתנים להתאמה בקלות על ידי מעבדות אחרות באמצעות C. elegans.
מבוא
Caenorhabditis elegans הוכיח את עצמו כאורגניזם מודל רב עוצמה לחקר ביולוגיה של התא, הזדקנות, ביולוגיה התפתחותית ונוירוביולוגיה. יתרונות כגון גופו השקוף, מחזור חיים קצר, תחזוקה קלה, מספר מוגדר של תאים, הומולוגיה עם מספר גנים אנושיים וגנטיקה שנחקרה היטב הובילו לכך ש- C. elegans הפך למודל פופולרי הן לתגליות ביולוגיות בסיסיות והן למחקר יישומי 1,2. הבנת התהליכים הביולוגיים וההתפתחותיים של התא מתצפיות ארוכות טווח חוזרות ונשנות על בעלי חיים בודדים יכולה להתברר כמועילה. באופן קונבנציונלי, C. elegans מורדם על רפידות אגר ומצולם תחת מיקרוסקופ. השפעות שליליות של חומרי הרדמה על בריאותם של בעלי חיי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור של מכשיר גידול והדמיה
- ייצור עובש SU8
- עצבו תבניות 1 (שכבת זרימה) ו-2 (שכבת בקרה) באמצעות צורות מלבניות בתוכנת עיבוד תמלילים (או בתוכנת CAD לתכנון בעזרת מחשב) והדפיסו את מסכות הצילום בעזרת מתווה לייזר עם גודל תכונה מינימלי של 8 מיקרומטר על סרט מבוסס פוליאסטר (איור 1).
- חותכים פרוסות סיליקון לחתיכות של 2.5 ס"מ × 2.5 ס"מ ומנקים אותן עם 20% KOH למשך דקה אחת. שטפו את הוופלים במים שעברו דה-יוניזציה (DI). השתמש בפרוסה אחת כל אחת עבור הזרימה ושכבת הבקרה.
אזהרה: KOH הוא קורוזיבי ויש לטפל בו בזהירות. - יבשו את החלקים עם גז חנקן דחוס 14 psi ואחריו התייבשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 120 מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אפיון מכשיר: מכשיר הגדילה וההדמיה מורכב משתי שכבות PDMS המחוברות זו לזו (איור 1) באמצעות מליטה פלזמה בלתי הפיכה. שכבת הזרימה (תבנית 1) שאורכה 10 מ"מ וגובהה 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר מאפשרת לנו לגדל את החיה בתרבית נוזלית (איור 1A). לשכבת הלכידה (תבנית 2) יש קרום ברוחב 2 מ"מ (איור 1B) לשיתוק החיה לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה. המסכה של שכבת הלכידה יוצרת גם זוג קרומי בידוד להגבלת תנועת בעלי חיים בתוך מקטע של תעלת הזרימ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במאמר זה תואר פרוטוקול לייצור ושימוש בהתקן מיקרופלואידי פשוט לגידול C. elegans עם אספקת מזון קבועה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חיה בודדת במהלך התפתחותה. תהליך ייצור זה הוא פשוט וניתן לעשות זאת בסביבה לא סטרילית. סביבה נטולת אבק היא קריטית במהלך שלבי הייצור. נוכחותם של חלקיקי אבק תוביל למגע לא תקין בין שני משטחי ההדבקה, וכתוצאה מכך להדבקה ודליפה לקויה של המכשיר במהלך יישום בלחץ גבוה בעוד C. elegans משותקים. מתוך כל המכשירים המיוצרים, 95% מהמכשירים מתאימים לניסויים. מספר קטן של מכשירים נכשלים (5%) עקב הדבקה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
S.M. ו- S.P.K. הם מחברים של פטנט ממתין על מכשיר הגידול וההדמיה המיקרופלואידי (בקשת פטנט מספר 640/CHE/2011).
תודות
אנו מודים למתקן ההדמיה CIFF, NCBS על השימוש במיקרוסקופים הקונפוקליים הנתמכים על ידי שעון הקיץ - המרכז לננוטכנולוגיה (לא. SR/55/NM-36-2005). אנו מודים למימון מחקר מ- DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), דיסק מסתובב הנתמך על ידי DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK וגאוטם מנון), ומענק HHMI-IECS מספר 55007425 (SPK). זנים HB101, PS3239 ו-wdIs51 סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). S.P.K. ייצרה את jsIs609 במעבדה של מייק נונט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 18 מחטי G | סיגמא-אולדריץ', בנגלור, הודו | מד 18 | |
| עצירה תלת כיוונית | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex הולם עם מצלמת CCD מנעול לואר |
| וטכנולוגיה Andor Technology | EMCCD C9100-13no | ||
| סרט לוח מעגלים | הדמיית קו עדין, קולורדו, ארה"ב | העיצובים מודפסים עם 65,024 נקודות לאינץ' (DPI) | |
| תנור הסעה | Meta-Lab Scientific Industries, הודו | MSI-5 | |
| Coverslips | כחול סטטיסטיקה מיקרוסקופית כיסוי זכוכית | 22 מ"מ x 10Gms | |
| אתנול | Hi media | ||
| Harris אגרוף חד ליבתי 1 מ"מ | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, בנגלור, הודו | 440191 | |
| פלטה | חמה IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| סריקת לייזר מיקרוסקופ | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette | Tips Tarsons | 0.5-10 & micro; קצות מיקרופיפטה L משמשים לאספקת מזון | |
| שלילי Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| שלילי Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| גז חנקן | ספק מקומי | חנקן מסחרי | נפח צילינדר של 7 מטר מעוקב |
| PDMS (תמיסת ריפוי) | תאגיד דאו קורנינג, מישיגן, ארה"ב& | nbsp; תמיסת ריפוי סילגארד | חומר ריפוי |
| צלחות פטרי | Praveen Scientific Corporation | ||
| מנקה פלזמה | האריק פלזמה, ניו יורק, ארה"ב | PDC-32G | |
| סכין גילוח ולהבים | ליסטר להב | ||
| סיליקון אלסטומר (בסיס) | Dow Corning Corporation, MI, ארה"ב | Sylgard 184 בסיס | אלסטומר |
| בסיס צינורות סיליקון | פישר סיינטיפיק | צינורות פלסטיק בקוטר הפנימי 1.59 מ"מ והקוטר החיצוני 3.18 מ"מ | |
| פרוסת סיליקון | פרוסת אוניברסיטת פרוסה, MA, ארה"ב | [100] אוריינטציה, 4 אינץ' קוטר | חתיכות קטנות (2 מ"מ ופעמים; 2 מ"מ) נחתכו מפרוסת קוטר 100 מ"מ |
| Spin Coater | SPS-Europe BV, הולנד | SPIN 150 | |
| מיקרוסקופ דיסק מסתובב | Perkin Elmer מערכת VOX אולטרה-תצוגה | CSU-X1-A3 N | המערכת צוידה בארבעה לייזרים (405/488/561/640 ננומטר) ונשלטה בחבילת התוכנה Volocity. |
| מפתח SU8 | Microchem, MA, ארה"ב | SU8 | |
| טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאן | סיגמא-אולדריץ', בנגלור, הודו | 448931 | טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי סילאן הם |
| מנורת UV | Oriel Instruments, בנגלור, הודו | 200 וואט ומקור אור UV קולימציה | |
| תוכנת Volocity | פרקין-אלמר | ניתוח |
מקורות
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nema....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
