Method Article

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/63136

⸱

April 11th, 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוכיחו את עצמם כמערכת מודל רבת ערך לחקר תהליכים התפתחותיים וביולוגיים של תאים. הבנת תהליכים ביולוגיים אלה דורשת לעתים קרובות הדמיה ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותה חיה. לזמני התאוששות ארוכים הקשורים לשיטות אימוביליזציה קונבנציונליות המבוצעות על רפידות אגר יש השפעות מזיקות על בריאות בעלי החיים, ולכן אין זה ראוי לדמות שוב ושוב את אותה חיה לאורך תקופות זמן ארוכות. מאמר זה מתאר תכנון שבב מיקרופלואידי, שיטת ייצור, פרוטוקול גידול C. elegans על השבב, ושלוש דוגמאות להדמיה ארוכת טווח לחקר תהליכים התפתחותיים בחיות בודדות. השבב, המיוצר עם פולידימתילסילוקסן ומלוכד על זכוכית כיסוי, משתק בעלי חיים על מצע זכוכית באמצעות קרום אלסטומרי המוסט באמצעות גז חנקן. אימוביליזציה מלאה של C. elegans מאפשרת הדמיה חזקה בהילוך מהיר של אירועים תאיים ותת-תאיים באופן נטול הרדמה. גיאומטריית תעלה עם חתך רוחב גדול מאפשרת לבעל החיים לנוע בחופשיות בתוך שני ממברנות בידוד אטומות חלקית המאפשרות צמיחה בתעלה עם אספקת מזון רציפה. באמצעות שבב פשוט זה, ניתן לבצע הדמיה של תופעות התפתחותיות כגון גדילת תהליכים עצביים, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירונים החושיים PVD, כאשר החיה גדלה בתוך התעלה. שבב הגידול וההדמיה לטווח ארוך פועל עם קו לחץ יחיד, ללא שסתומים חיצוניים, חומרים מתכלים נוזליים זולים, ומשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בתולעים הניתנים להתאמה בקלות על ידי מעבדות אחרות באמצעות C. elegans.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans הוכיח את עצמו כאורגניזם מודל רב עוצמה לחקר ביולוגיה של התא, הזדקנות, ביולוגיה התפתחותית ונוירוביולוגיה. יתרונות כגון גופו השקוף, מחזור חיים קצר, תחזוקה קלה, מספר מוגדר של תאים, הומולוגיה עם מספר גנים אנושיים וגנטיקה שנחקרה היטב הובילו לכך ש- C. elegans הפך למודל פופולרי הן לתגליות ביולוגיות בסיסיות והן למחקר יישומי 1,2. הבנת התהליכים הביולוגיים וההתפתחותיים של התא מתצפיות ארוכות טווח חוזרות ונשנות על בעלי חיים בודדים יכולה להתברר כמועילה. באופן קונבנציונלי, C. elegans מורדם על רפידות אגר ומצולם תחת מיקרוסקופ. השפעות שליליות של חומרי הרדמה על בריאותם של בעלי חיי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור של מכשיר גידול והדמיה

  1. ייצור עובש SU8
    1. עצבו תבניות 1 (שכבת זרימה) ו-2 (שכבת בקרה) באמצעות צורות מלבניות בתוכנת עיבוד תמלילים (או בתוכנת CAD לתכנון בעזרת מחשב) והדפיסו את מסכות הצילום בעזרת מתווה לייזר עם גודל תכונה מינימלי של 8 מיקרומטר על סרט מבוסס פוליאסטר (איור 1).
    2. חותכים פרוסות סיליקון לחתיכות של 2.5 ס"מ × 2.5 ס"מ ומנקים אותן עם 20% KOH למשך דקה אחת. שטפו את הוופלים במים שעברו דה-יוניזציה (DI). השתמש בפרוסה אחת כל אחת עבור הזרימה ושכבת הבקרה.
      אזהרה: KOH הוא קורוזיבי ויש לטפל בו בזהירות.
    3. יבשו את החלקים עם גז חנקן דחוס 14 psi ואחריו התייבשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 120 מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיון מכשיר: מכשיר הגדילה וההדמיה מורכב משתי שכבות PDMS המחוברות זו לזו (איור 1) באמצעות מליטה פלזמה בלתי הפיכה. שכבת הזרימה (תבנית 1) שאורכה 10 מ"מ וגובהה 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר מאפשרת לנו לגדל את החיה בתרבית נוזלית (איור 1A). לשכבת הלכידה (תבנית 2) יש קרום ברוחב 2 מ"מ (איור 1B) לשיתוק החיה לצורך הדמיה ברזולוציה גבוהה. המסכה של שכבת הלכידה יוצרת גם זוג קרומי בידוד להגבלת תנועת בעלי חיים בתוך מקטע של תעלת הזרימ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה תואר פרוטוקול לייצור ושימוש בהתקן מיקרופלואידי פשוט לגידול C. elegans עם אספקת מזון קבועה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חיה בודדת במהלך התפתחותה. תהליך ייצור זה הוא פשוט וניתן לעשות זאת בסביבה לא סטרילית. סביבה נטולת אבק היא קריטית במהלך שלבי הייצור. נוכחותם של חלקיקי אבק תוביל למגע לא תקין בין שני משטחי ההדבקה, וכתוצאה מכך להדבקה ודליפה לקויה של המכשיר במהלך יישום בלחץ גבוה בעוד C. elegans משותקים. מתוך כל המכשירים המיוצרים, 95% מהמכשירים מתאימים לניסויים. מספר קטן של מכשירים נכשלים (5%) עקב הדבקה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. ו- S.P.K. הם מחברים של פטנט ממתין על מכשיר הגידול וההדמיה המיקרופלואידי (בקשת פטנט מספר 640/CHE/2011).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למתקן ההדמיה CIFF, NCBS על השימוש במיקרוסקופים הקונפוקליים הנתמכים על ידי שעון הקיץ - המרכז לננוטכנולוגיה (לא. SR/55/NM-36-2005). אנו מודים למימון מחקר מ- DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), דיסק מסתובב הנתמך על ידי DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK וגאוטם מנון), ומענק HHMI-IECS מספר 55007425 (SPK). זנים HB101, PS3239 ו-wdIs51 סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). S.P.K. ייצרה את jsIs609 במעבדה של מייק נונט.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
18 מחטי Gסיגמא-אולדריץ', בנגלור, הודומד 18
עצירה תלת כיווניתCole-ParmerWW-30600-02Masterflex הולם עם מצלמת CCD מנעול לואר
וטכנולוגיה Andor TechnologyEMCCD C9100-13no
סרט לוח מעגליםהדמיית קו עדין, קולורדו, ארה"בהעיצובים מודפסים עם 65,024 נקודות לאינץ' (DPI)
תנור הסעהMeta-Lab Scientific Industries, הודוMSI-5
Coverslipsכחול סטטיסטיקה מיקרוסקופית כיסוי זכוכית22 מ"מ x 10Gms
אתנולHi media
Harris אגרוף חד ליבתי 1 מ"מQiagenZ708801
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich, בנגלור, הודו440191
פלטהחמה  IKARCT B S 22
IsopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
סריקת לייזר מיקרוסקופZEISSLSM 5 LIVE
MicropipetteTips Tarsons0.5-10 & micro; קצות מיקרופיפטה L משמשים לאספקת מזון
שלילי Photoresist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
שלילי Photoresist-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
גז חנקןספק מקומיחנקן מסחרינפח צילינדר של 7 מטר מעוקב
PDMS (תמיסת ריפוי)תאגיד דאו קורנינג, מישיגן, ארה"ב  תמיסת ריפוי סילגארדחומר ריפוי
צלחות פטריPraveen Scientific Corporation
מנקה פלזמההאריק פלזמה, ניו יורק, ארה"ב  PDC-32G
סכין גילוח ולהביםליסטר להב
סיליקון אלסטומר (בסיס)Dow Corning Corporation, MI, ארה"בSylgard 184 בסיסאלסטומר
בסיס צינורות סיליקוןפישר סיינטיפיקצינורות פלסטיק בקוטר הפנימי 1.59 מ"מ והקוטר החיצוני 3.18 מ"מ
פרוסת סיליקוןפרוסת אוניברסיטת פרוסה, MA, ארה"ב[100] אוריינטציה, 4 אינץ' קוטרחתיכות קטנות (2 מ"מ ופעמים; 2 מ"מ) נחתכו מפרוסת קוטר 100 מ"מ
Spin CoaterSPS-Europe BV, הולנדSPIN 150
מיקרוסקופ דיסק מסתובבPerkin Elmer מערכת VOX אולטרה-תצוגהCSU-X1-A3 Nהמערכת צוידה בארבעה לייזרים (405/488/561/640 ננומטר) ונשלטה בחבילת התוכנה Volocity.
מפתח SU8Microchem, MA, ארה"בSU8
טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) סילאןסיגמא-אולדריץ', בנגלור, הודו448931טריכלורו (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) אדי סילאן הם
מנורת UVOriel Instruments, בנגלור, הודו200 וואט ומקור אור UV קולימציה
תוכנת Volocityפרקין-אלמר ניתוח
גז כירורגי מפתח רעילה תמונה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nema....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

Related Articles