Method Article

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

DOI:

10.3791/63137

⸱

February 10th, 2022

 ,  , 
1Research Group Pharmaceutical Biotechnology, TH Köln - University of Applied Sciences, 2Institute of Technical Chemistry, Leibniz University Hannover

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החלקיקים דמויי הנגיף (VLP) לוכדים את ההסתייגות היא שיטת אימונופרציפיטציה, הידועה בכינויה "ניסיון משיכה למטה" המשמש לטיהור ובידוד VLPs המציגים אנטיגן. נוגדנים ספציפיים לאנטיגן משטח מצמידים, ובכך משותקים במטריצה מוצקה ובלתי מסיסה כגון חרוזים. בשל הזיקה הגבוהה שלהם אנטיגן היעד, נוגדנים אלה יכולים ללכוד VLPs מעוטר עם אנטיגן קוגנייט מעוגן במעטפת הממברנה של VLPs. פרוטוקול זה מתאר את קשירת נוגדנים ספציפיים לאנטיגן לחלבון A או חרוזים מגנטיים מצומדים ב- G. במחקר שלנו, וירוס חיסוני אנושי (HIV) נגזר VLPs שנוצרו על ידי קבוצה ספציפי אנטיגן (Gag) חלבון מבשר p55 Gag ולהציג את הגליקופרוטאין המעטפה (Env) של HIV נבדקים. ה-VLPs נלכדים תוך שימוש בנוגדנים מנטרלים באופן נרחב (bNAbs) המכוונים נגד אפיטופים רגישים לנטרול ב- Env. בדיקת לכידת VLP המתוארת כאן מייצגת שיטה רגישה וקלה לביצוע כדי להדגים כי (i) ה- VLPs מעוטרים באנטיגן היעד המתאים, (ii) האנטיגן המשטחי שמר על שלמותו המבנית כפי שהוכח על ידי הכריכה הספציפית לאפיטופה של bNAbs המשמשת בבדיקה ו- (iii) השלמות המבנית של ה- VLPs שנחשפו על ידי זיהוי חלבוני Gag בניתוח כתמים מערבי לאחר מכן. כתוצאה מכך, ניצול bNAbs עבור immunoprecipitation מקל על חיזוי אם חיסוני VLP יוכלו לעורר תגובת תא B מנטרלת בבני אדם מחוסנים. אנו צופים כי פרוטוקול זה יספק לחוקרים אחרים גישה ניסיונית בעלת ערך ופשוט לבחינת חיסונים פוטנציאליים מבוססי VLP.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) דומים למבנה חלקיקי הנגיף המקומיים בעודם חסרים את הגנום הנגיפי, ובכך מספקים פרופיל בטיחות גבוה1,2. VLPs מייצגים סוג בודד של חיסונים שפותחו יותר ויותר בשל האימונוגניות הגבוהה שלהם3,4,5,6,7. זה במיוחד המקרה עבור VLPs מעטפת קרום, המאפשר תצוגה של לא רק אנטיגנים משטח נגיפי הומולוגי, אלא גם אנטיגנים הטרולוגיים כגון אנטיגנים גידול8,9,10. איור 1 מספק סקירה למופת של המבנה של VLP מעוטר באנטיגן. במהלך תהליך הפיתוח של חיסונים מבוססי VLP, הבדיקות חיוניות המאפשרות ניתוח של אנטיגן היעד המתאים המוצג על פני השטח של VLP. ציות כאלה צריכות להיות אינסטרומנטליות כדי לפרט את הרכב החיסון החלקיקים: (i) האם ה- VLPs מעוטרים באנטיגן פני השטח המתאים? (ii) האם האנטיגן על פני השטח שמר על המבנה המקורי שלו כפי שהוכח על ידי זיהוי אפיטופ של נוגדנים מנטרלים (bNAbs) ו -(iii) האם ניתן לאשר את השלמות המבנית של ה- VLPs עקב זיהוי היווצרות החלבון הנגיפי המתווך VLP?

figure-introduction-1
איור 1: איור סכמטי של VLP עטוף ממברנה. VLPs נוצרים על ידי חלבוני ליבה מבשרים לא בוגרים של Gag ומוקפים בקרום שומנים הנגזר מהתא המארח. האנטיגנים, למשל, גליקופרוטאין מעטפה, משולבים בקרום השומנים ומוצגים על פני השטח של VLP (מימין). נוגדנים ספציפיים לאנטיגן מזהים את האנטיגן. בצד שמאל, VLP קירח ללא קישוט אנטיגן מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

במיוחד VLPs שנוצרו על ידי קבוצה ויראלית ספציפי אנטיגן (Gag) חלבון מבשר הליבה p55 של וירוס חיסוני אנושי סוג 1 (HIV-1) הם פיגומים מועדפים עבור תצוגת אנטיגן בפיתוח חיסון כמו נוגדנים רבים, וערכות ELISA זמינים, המאפשרים את הכימות של VLPs אלה11,12. גליקופרוטאין מעטפת HIV-1 (Env), כלומר, חלבון transmembrane gp41 (gp41-TM) ויחידת פני השטח המסיסה gp120 (gp120-SU) היוצרים הטרודימרים, משולבים במעטפת הממברנה של חלקיקים והם אנטיגנים מטרה חיוניים לפיתוח חיסונים נגד זיהום HIV13,14,15 . הצגת אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים ממוקדים אלה היא תנאי מוקדם לתגובת נוגדנים מנטרלת באופן נרחב בחיסונים. מלבד תגובת תאי T המופנית נגד חלבוני Gag, זה נחשב מתאם חשוב של הגנה מפני הידבקות ב- HIV16. כתוצאה מכך, ועם תכנון וייצור של VLPs מעוטרים במועמדים אנטיגן היעד, הניתוח הבא של איכות האנטיגנים המוצגים מייצג צעד קריטי בתהליך פיתוח החיסון.

אימונופרציפיטציה (IP) היא טכניקה נפוצה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון וטיהור מתחמי חלבון בקנה מידה קטן17. בארט ואח. דווח לראשונה על פיתוח IP בשנת 1960, ובכל זאת, שיטה זו שופרה כל הזמן עוד יותר. IP מאפשר לכידה ובידוד של אנטיגן יעד (טרף) מפתרון על ידי שימוש בנוגדן ספציפי אנטיגן (פיתיון) משותק על ידי צימוד חרוזים18,19. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים וריאציה של יישום ה- IP הקלאסי באמצעות VLPs בצורת p55 Gag בצורת קרום כטרף ו- bNAbs המזהים אפיטופים רגישים לנטרול בחלבוני המעטפה המוצגים על פני השטח של ה- VLPs כחלבוני פיתיון. היישום המוצלח של בדיקת לכידת VLP זו מקל על החיזוי אם VLPs אנטיגן חיובי נבדק יוכלו לעורר תגובת תא B מנטרל אצל אנשים מחוסנים. תכונות אימונוגניות כאלה של מועמדים לחיסון מבוסס VLP מודגמות לעתים קרובות במודלים קטנים של בעלי חיים20,21,22.

על מנת להעריך את האיכות של המועמד החדש לחיסון VLP שפותח, בדיקות לכידת VLP נוצלו בהצלחה5,23,24. עם זאת, מספר השיטות שפורסמו מוגבל. ה- VLP לוכד את ההסרה המוצגת כאן מתחיל עם השתקת bNAbs ספציפיים Env על חרוזים מצומדים G חלבון, אשר נקשרים לאזור Fc של נוגדנים שמקורם ביונקים. מטריצות אופייניות לפירוק הנוגדן המועדף הן אגרוז או חרוזים מגנטיים. עם זאת, חרוזים מגנטיים נוחים עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה25. בשלב הבא, VLPs המציגים את האנטיגן היעד נלכדים על ידי חרוזים מצופים bNAb. מתחמי החיסון שנוצרו המורכבים מ- VLPs חיובי Env ו- bNAbs משותקים מועשרים בקלות באמצעות מגנט. מתחמי החיסון המבודדים נזכרים בשלב האחרון. לאחר מכן, VLPs יכול להיות מאופיין ביוכימי. כאן, ביצענו ניתוח כתמים מערבי תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לחלבון ליבה נגיפיים p55 Gag כדי להוכיח שהמטרה המואצת אנטיגנים Env לא רק מסתירים את האפיטופים הרגישים לנטרול אלא גם הוצגו על VLPs שנוצרו על ידי Gag. יתר על כן, זיהוי הליבה הנגיפית חלבונים Gag מגביר את הרגישות של בדיקת לכידה מאז חלבוני Gag הם שופעים יותר מאשר Env ב VLP. ב- HIV-1, חלבוני Env נמצאים רק במספר חד-ספרתי26, בעוד שיותר מ -3,500 מולקולות Gag מהוות את הליבה של חלקיק27.

בהשוואה לטכניקות אחרות לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון28,29, בדיקת לכידת VLP מספקת שיטה חלופית למעבדות מחקר שאין להן גישה למכשירים אנליטיים יקרים. לדוגמה, ניתוח מיקרוסקופי אלקטרוני שידור (TEM), ספקטרוסקופיית תהודה פלסמון פני השטח (SPR) וניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) יכולים להיות עתירי עלות. בדיקת הלכידה המוצגת כאן מאפשרת גם כניעה מאוחרת יותר של דגימות VLP אנטיגן חיוביות שנתפסו לאפיון חלבון נוסף, למשל, שימוש באלקטרופורזה של ג'ל, אימונובלוטינג, מיקרוסקופיית אלקטרונים וספקטרומטריית מסה (MS), בהתאמה. בהתחשב בכך המבנה המקורי של אנטיגן היעד נשמר במהלך בדיקת לכידת VLP, גם את הביצועים של דף מקורי וטכניקות חיסוניות הבאות ניתן להשתמש.

בדיקת לכידת VLP מייצגת שיטה קלה לשימוש ורגישה לבחינת הקישוט של VLPs עם אנטיגנים ממוקדים החושפים אפיטופים רגישים לנטרול, ובכך התועלת שלהם כמועמדים עתידיים לחיסון.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדגם

  1. זרע את קווי תאי ההשעיה של מפיק VLP הנגזרים מתאי 293-F המבטאים גנים מבניים HIV לבד או בתיאום עם env 30 בצפיפות תאים נמוכה של 0.5 x 106 תאים למ"ל במדיום הביטוי 293-F.
  2. תן להם להתרחב במשך 3-4 ימים ב 37 °C ו 8% CO2 בסיבוב אינקובטור שייקר עם מסלול של 5 ס"מ ו 135 סיבובים לדקה (סל"ד).
  3. פלט את תאי היצרן על ידי צנטריפוגה ב 100 x g במשך 5 דקות. לסנן את supernatant המובהר כדי להסיר תאים שיורית ופסולת תאים באמצעות 0.45 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) מסנני מזרק ממברנה כדי להשיג תא ללא תאים תרבות supernatant (CFSN).
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן את CFSN למשך הלילה ב-4 °C (70 °F).
  4. או להשתמש ב- CFSN ישירות לניסוי או ב- VLPs גלולה מ- 35 מ"ל של CFSN המשתמשים בצנטריפוגה אולטרה-מרכזית (112,700 x גרם, 4 °C (4 °F), 1.5 שעות).
  5. לאחר ultracentrifugation, להשליך את supernatant ולהשעות את כדורי VLP ב 200 μL של 15% (w / v) פתרון טרהלוז אחוז צינור צנטריפוגה.
    הערה: גלולה VLP הוא לעתים קרובות לא גלוי לעין בלתי. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. VLPs ניתן לאחסן ב -80 °C (70 °F).
  6. לפני בדיקת לכידת VLP, לקבוע את ריכוזי חלבון הליבה הנגיפי ב- VLP המכיל דגימות באמצעות ELISA. שלב זה חשוב כדי לתקנן את קלט הלכידה.

2. VLP ללכוד אסייד

הערה: מבט כולל על זרימת העבודה מתואר באיור 2.

  1. השהו את החרוזים המגנטיים על ידי צנרת למעלה ולמטה או ערבוב על סיבוב ב 50 סל"ד לפחות 5 דקות.
  2. בינתיים, להכין את פתרון הנוגדנים המכיל bNAbs. השתמש ב-10 מיקרוגרם של כל bNAb ב-200 מיקרו-אל של כריכת נוגדנים ומאגר כביסה (ראה טבלת חומרים) לכל תגובה.
    הערה: כמויות נוגדנים עשויות להשתנות בהתאם לזיקה של bNAb וצפיפות קישוט אנטיגן על VLPs בשימוש.
  3. השתמש 50 μL של פתרון חרוז מגנטי (ראה טבלה של חומרים) לכל תגובה ולהעביר את החרוזים לתוך צינור תגובה 1.5 מ"ל. הנח את הצינורות על מדף ההפרדה המגנטית.
    הערה: לחלופין, מגנט יחיד חזק יכול לשמש עבור כל צינור כדי להפריד את החרוזים מן supernatant.
  4. המתן מספר דקות עד שהחרוזים יתאספו בקיר הצינור כדי להבטיח שכל החרוזים יאספו. הסר את סופר-טבעי.
  5. הסר את המגנט להשעות את החרוזים ב 200 μL של פתרון bNAb מוכן בשלב 2.2. דגירה במשך 30 דקות עד 3 שעות ערבוב על סיבוב ב 50 סל"ד בטמפרטורת החדר.
  6. מניחים שוב את צינורות התגובה בארון ההפרדה המגנטי, ממתינים ומסירים את הסופר-טבעי.
  7. הסר את הצינורות מן המגנט לשטוף את החרוזים על ידי resuspending ב 200 μL של כריכת נוגדנים חוצץ כביסה.
  8. חזור על שלב 2.4. הסר מאגר כביסה רב ככל האפשר.
  9. הוסף את הדגימות ל- bNAbs הקשורים חרוזים.
    הערה: קלט VLP לבדיקת לכידה באמצעות חלקיקים שמקורם ב- HIV צריך להיות לפחות 15 ננוגרם של חלבון ליבה ויראלי לכל תגובה. כמויות VLP עשויות להשתנות בהתאם לזיקה של bNAb, ואת צפיפות קישוט אנטיגן על VLPs בשימוש.
  10. אם אמצעי האחסון לדוגמה שנוספ בשלב 2.9 נמצא מתחת ל- 1 מ"ל, הוסף PBS כדי לכוונן את עוצמת הדגימה ל- 1 מ"ל. משעים את החרוזים בעדינות על ידי צנרת.
  11. לדגור על הדגימות והחרוזים במשך 2.5 שעות על סיבוב בטמפרטורת החדר. ודא כי החרוזים להישאר השעיה ואת הפתרון מעורב ביסודיות במהלך הדגירה.
  12. מניחים את הצינורות על המגנט ומסירים את סופר-טבעי.
  13. לשטוף את החרוזים המגנטיים על ידי השעייתם ב 200 μL של חוצץ כביסה (ראה שולחן של חומרים). חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
  14. להשעות את החרוזים ב 100 μL של חוצץ כביסה ולהעביר את המתלה צינור תגובה נקי (עמיד בחום).
  15. הנח את הצינור על מתלה ההפרדה המגנטית (ראה שולחן חומרים) והסר את supernatant לחלוטין.
  16. הכן דגימות SDS-PAGE דנות לאחר שלבים 2.16.1-2.16.2 או דגימות שאינן denatured על ידי הרחקת VLPs מן החרוזים המגנטיים בעקבות שלבים 2.16.3-2.16.5.
    1. כדי להכין דגימות SDS-PAGE denatured, להשעות את החרוזים ב 20-80 μL של מאגר Laemmli (0.8 μL של חוצץ Laemmli לכל 1 ננוגרם של p55 Gag assay קלט) ודגרה ב 95 °C (5 דקות.
    2. המשך ישירות עם SDS-PAGE או אחסן את הדגימות ב- -20 °C (70 °F).
      זהירות: מאגר לאמלי מכיל 2-מרקפטופנול ונתרן דודסיל סולפט. ללבוש כפפות מגן והגנה על העיניים. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים והבגדים. אין לשאוף אדים. לעבוד בחלל מאוורר היטב, למשל, ברדס אדים.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
    3. לחלופין, בצעו שלב אלוטציה שאינו דנטורי כדי להשיג VLPs עם מבנה חלבון מקומי שמור.
    4. מוסיפים 25 μL של חוצץ אלוטיון (מסופק לעתים קרובות עם החרוזים) לחרוזים המגנטיים ודגרה במשך 2-5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. מוציאים את החרוזים ומעבירים את האלואט לצינור נקי. השתמש eluate לבדיקות הבאות או לאחסן אותו ב 4 °C (70 °F).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. ניתוח של דגימות VLP שנתפסו

הערה: לניתוח של VLPs שנתפסו, לנהל SDS-PAGE ולאחר מכן ניתוח כתם מערבי31,32.

  1. מניחים את צינורות הדגימה על המדף המגנטי כדי להפריד את החרוזים מהפתרון.
  2. לטעון 10 μL של כל מדגם לתוך בארות בודדות של הג'ל.
    הערה: בפרוטוקול זה, חלבוני הליבה של p55 Gag ויראליים זוהו על ידי שימוש בנוגדנים ארנב פוליקלונלי מכוון נגד HIV Gag ועוף פוליקלונלי משני נגד ארנב IgG יחד עם נוגדני peroxidase חזרת (HRP). חלבוני ליבה נגיפיים דמיינו באמצעות זיהוי כימותרפיה.

figure-protocol-1
איור 2: איור סכמטי של שלבי המפתח של ה-VLP לוכדים באמצעות חומרי-על נטולי תאים. (1) בדיקת לכידת VLP מתחילה בכריכה של bNAbs HIV-1 לחלבון חרוזים מגנטיים מצמידי G. בינתיים, פתרון VLP עם ריכוז p55 מוגדר מוכן. ה-supernatant של התרבות נטולת התאים מורכב מתערובת של אח"מים p55 Gag, חלבוני תא מארח וחומצות גרעין. (2) החרוזים המגנטיים בשילוב bNAbs ופתרון VLP מועברים לצינור תגובה 1.5 מ"ל ואחריו דגירה תחת סיבוב. (3) VLPs המציגים אנטיגן נלכדים על-ידי החרוזים מצופים bNAbs. הפרדה של מתחמי חיסון אלה ממזהמים שמקורם בתאים מארחים מתבצעת בשדה מגנטי. (4) supernatant מוסר על ידי pipetting, ואת החרוזים נשטפים שלוש פעמים כדי להסיר VLPs מאוגד. (5) בשלב הבא, הפחתת מאגר טעינת חלבון מתווסף למתחמי החיסון המורכב חרוזים מגנטיים מצופים bNAbs ו VLPs שנתפסו. (6) רותחים את המדגם מנתק bNAbs ואנטיגן היעד מן החרוזים המגנטיים תמוגה VLPs. (7) חרוזים מגנטיים מופרדים מהפתרון בשדה מגנטי. (8) דגימות החלבון כפופות ל-SDS-PAGE. (9) ניתוח כתמים מערבי מבוצע על מנת לזהות חלבוני ליבה p55 Gag ויראלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 3 מציג תוצאה מייצגת של VLPs שנלכדו לראשונה מכדורי CFSN ו-VLP, בהתאמה, באמצעות bNAbs ולאחר מכן נתונים לניתוח כתמים מערביים כדי לזהות חלבוני ליבה ויראליים. החרוזים ששימשו לבדיקת הלכידה היו מצופים בשלושה bNAbs שונים המכוונים נגד אפיטופים רגישים לנטרול של הגליקופרוטאינים Env ונוגדני איזוטיפ המשמשים כפקדים שליליים, בהתאמה. באמצעות חרוזים מצופים נוגדנים איזוטיים, לא ניתן היה לזהות חלבוני Gag בדגימות המכילות Env-negative (VLPs קירח) או VLPs המציגים Env המשתמשים בניתוח כתמים מערבי. זה הוכיח כי הכריכה הלא מדעית של VLPs חרוזים מצופים נוגדנים אנושיים לא לתווך לכידת VLP. VLPs קירחים גם לא היו קשורים חרוזים מצופים bNAbs, וכתוצאה מכך, שוב, לא חלבונים Gag היו ניתנים לזיהוי. לעומת זאת, כל שלושת ה- bNAbs לכדו VLPs המציגים חלבוני Env (VLPs Env), ולכן, חלבוני Gag זוהו לאחר מכן בקלות. כפי שניתן לראות באיור 3, ניתן להשתמש בבחינת הלכידה כדי לנתח אנטיגן יעד המציג VLPs בדגימות VLP CFSN וכדורים, בהתאמה.

figure-results-1
איור 3: זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול בגליקופרוטאינים במעטפות HIV-1 המוצגים ב-VLPs שנוצרו על ידי Gag באמצעות נוגדנים מנטרלים באופן נרחב. תוצאות מייצגות של ניתוח כתמים מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים לחלבון ליבה של Gag הנגיפי לאחר ביצוע בדיקת לכידת VLP תוך שימוש בשלושה נוגדנים שונים המנטרלים באופן רחב (bNAb 1, bNAb 2 ו- bnAb 3) המתמקדים באפיטופים בתוך גליקופרוטאין מעטפת HIV-1 (Env). נוגדנים אנושיים איזוטיפ איחדו סרה אנושי שימשו כבקרות שליליות. תרבית תאים supernatants נקצרו מתרביות תאים השעיה לייצר VLPs עם חלבוני Env (VLPs Env) ו VLPs קירח (Env-שלילי), בהתאמה, כמו גם מתאים נאיביים לא מבטאים חלבונים ויראליים (מדומה). הן את supernatants מתרבות התאים של יצרנית VLP הקירחת, כמו גם מתרבות התאים המדומים שימשו כפקדים שליליים. Supernatants שוחררו תאים מזהמים באמצעות צנטריפוגה במהירות נמוכה סינון לאחר מכן כדי לקבל supernatants ללא תאים (CFSN) לניתוח. לאחר אימונופרציפטיה, ניתוח כתם מערבי בוצע באמצעות נוגדני ארנבת פוליקלונלית המכוונים נגד Gag והצמדות אנטי-ארנבות IgG-HRP משניות. המשקל המולקולרי לכאורה בקילודלטונים (kDa) כפי הנראה מסמן המשקל המולקולרי (MW) מתואר משמאל. החצים מצביעים על חלבון הקדמה שזוהה p55 Gag. (א) עבור כל מדגם, CFSN המכיל 100 ננוגרם של חלבון Gag הוחל על תפיסת ההסתה כדי לתקנן את כמות הקלט של VLPs. CFSN היה דגירה ישירה עם חרוזים מצופים נוגדנים. (B) כדורי VLP הושגו על ידי אולטרה צנטריפוגה של CFSN. כדורי המכילים 100 ננוגרם של חלבון Gag הוחלו על לכידת התבלינים באמצעות נוגדני איזוטיפ ו- bNAb 3. דגימות עבור bNAb 1 ו- bNAb 2 הכילו רק 25 ננוגרם של Gag. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפני VLP ללכוד בבדיקה, להעריך את היווצרות של VLPs ואת הביטוי של אנטיגן היעד בשורות תא היצרן VLP. שיטות אינסטרומנטליות הן ניתוח ציטומטרי זרימה של ביטוי פני התא של האנטיגן, כמו גם אנטיגן- וחלבון הליבה ויראלי ספציפי ELISA של CFSN ו- VLPs גלולה.

צעדים קריטיים של VLP ללכוד בדיקה הם ציפוי של החרוזים עם נוגדנים ללכוד - כאן bNAbs - ואת הלכידה הבאה של VLPs אנטיגן חיובי על ידי חרוזים מצופים נוגדנים. ציפוי מוצלח של החרוזים בנוגדנים תלוי בבחירת החלבון המקשר אימונוגלובולין (Ig) . המינים התורמים, כמו גם הכיתה Ig של הנוגדנים לקבוע אם חלבון G- או חלבון חרוזים מצומדים A עדיפים. עבור רוב המינים ושיעורי Ig, חלבון G הוא הליבנד של choice33. כחלופה לחרוזים מצומדים בחלבון A/G, ניתן למצוא חרוזי סטרפטאבידין לציפוי בנוגדנים ביוטיניליים. חרוזים יכולים גם להיות בשילוב קוולנטי עם נוגדנים.

לכידת ה- VLPs על ידי חרוזים מצופים בנוגדנים תלויה בערבוב יסודי, זמן דגירה מספיק, שפע אנטיגן וזיקה לנוגדן הלכידה. מניסיוננו, ערבוב יסודי של חרוזים מצופים נוגדנים עם דגימות VLP מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי ניצול של כרכים >500 μL ב 1.5 mL צינורות תחת סיבוב לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר או 4 °C (5 °F). משוכה פוטנציאלית נוספת היא הכמות הנמוכה מדי של VLPs במדגם. עבור נוגדנים הקושרים בחוזקה את האנטיגן היעד, תשומות VLP נמוכות ככל 15 ננוגרם של חלבון Gag בדרך כלל מאפשרות כמויות ניתנות לזיהוי בקלות של חלבוני הליבה הנגיפיים המשתמשים בניתוח כתמים מערבי. עם זאת, נוגדנים בעלי זיקה נמוכה דורשים כמויות קלט גבוהות יותר, למשל 100 ננוגרם של חלבון Gag, כדי להשיג תוצאות חד משמעיות (איור 3, bNAb 3).

כמה אנטיגנים פני השטח נוטים השפלת פרוטאז. כאן, אנו ממליצים על תוספת של מעכבי פרוטאז לדגימות VLP ודגורה ב 4 °C (70 °F). הדבקה לא ספציפית של חלבוני תאים מארחים ו- VLPs לנוגדנים הקשורים חרוזים נצפתה לעתים רחוקות ויש להחריג על ידי שימוש בבקרות שליליות מתאימות, כפי שהדגמנו כאן באמצעות דגימות VLP מדומה וקרחת ונוגדנים לבקרת איזוטיפ. אסטרטגיות להפחתת כריכה לא ספציפית כוללות שלבי כביסה מורחבים ותוספת קזאין במאגר הכביסה34. יתר על כן, ניתן לשפר את הלכידה של בדיקה גם על ידי קביעת היחס האופטימלי של נוגדן לכמות VLP מציג אנטיגן.

בשלב האחרון של VLP ללכוד assay, אנו מתארים את ההתחמקות של מתחמי החיסון מן החרוזים על ידי רותחים בהפחתת חוצץ Laemmli. במהלך שלב זה, ה- VLPs מפורק, ונוגדני הלכידה ואנטיגנים היעד מופרדים מהחרוזים. ראוי לציין, מינים התורמים של הנוגדן העיקרי המשמש בניתוח כתם מערבי לאחר מכן צריך להיות שונה מן התורם של נוגדן לכידה כדי למנוע זיהוי לא מכוון של נוגדן לכידה על ידי נוגדנים אנטי תורם המשני IgG HRP מצומד.

בדיקה לכידת VLP המוצג כאן מספקת שיטה קלה לשימוש ורגישה לזיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים יעד שלם מבני המוצגים על משטחי VLP. עם זאת, הלכידה אינה מאפשרת כימות אפיטופ ישיר. ELISA המבוצעת עם bNAbs הם אינסטרומנטליים למטרה זו ויש להתבצע במקביל, במיוחד אם VLPs שנבדקו נועדו לשמש במחקרים פרה קליניים המעסיקים מודלים בעלי חיים35. זה מרכזי, כמו כמות אנטיגן יכול לתאם ישירות עם הנפקה של תגובת נוגדנים מנטרלת בבעלי חיים מחוסנים, כפי שמוצג עבור חזיר circovirus סוג 2 (PCV2) חיסונים36.

חיסון אידיאלי צריך לגרום להוצאת bNAbs המתמקדים באפיטופים הרגישים לנטרול על פני השטח. ניתוח אפיטופים אלה במיוחד בהתייחסו לשלמות המבנית המלאה שלהם על פני החיסון החלקיקים חיוני לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לחיסון. זה לא רק המקרה עבור VLPs נגזר HIV, אלא גם עבור חיסוני VLP רבים אחרים בפיתוח37. חיסונים בולטים מבוססי VLP נגזרים, למשל, מווירוסים הוריים שאינם עטופים או קפסים כגון נגיף הפפילומה האנושי (HPV). שלא כמו חלקיקי HIV-1, אשר נוצרים על ידי חלבון ליבה מבני אחד בלבד, כלומר p55 Gag, ועוטפים את הממברנה שמקורה בתא היצרן VLP, חלקיקי HPV מורכבים רק חלבון ליבה מבני אחד או שני38,39. כמו כן וכפי שהוצג כאן עבור VLPs עטופים, VLP ללכוד assay עשוי להיות חל גם על זיהוי של epitopes רגיש לנטרול של VLPs שאינם עטופים.

כחלופה לבדיקת הלכידה, דגימות VLP יכולות להיות כפופות ישירות ל- PAGE מקורי ואחריו ניתוח כתמים מערבי באמצעות bNAbs ונוגדנים משניים מתאימים בשילוב ל- HRP40. עם זאת, עבור הניתוח של VLPs מעוטרים ב- HIV Env, הבדיקה הזו פחות רגישה מכיוון שניתן לצפות רק למספר נמוך של חלבוני אנטיגן לכל VLP. לעומת זאת, בדיקת לכידה מקלה על זיהוי חלבוני הליבה בשפע בכמויות גדולות לכל VLP, במקרה של VLPs שמקורם ב- HIV יותר מ -3,500 חלבוני Gag יוצרים VLP27. זה מאפשר זיהוי עקיף רגיש מאוד של epitopes ב Env מוצג גם בצפיפות נמוכה על VLPs.

מספר השיטות המבוססות היטב לבחינת אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים על פני השטח של VLPs מוגבל. תיוג האנטיגנים המוצגים על ה- VLPs אפשרי עם מצומדים נוגדנים ספציפיים לאפיטופה וזיהוי לאחר מכן על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA), המאפשר זיהוי וכימות של VLPs. שיטה זו פותחה בהצלחה ומותטבת עבור exosomes המציג סמני פני השטח של התא41. כמו כן, ספקטרוסקופיית תהודה פלסמון פני השטח (SPR) מאפשרת ניתוח של אינטראקציות בין נוגדנים מנטרלים ללא מעצורים ואפיטופים מודעים המוצגים על VLPs. למרות שאינו מתאים לניתוח תפוקה גבוהה יותר, VLPs יכול להיות מסומן גם עם bNAbs בשילוב חלקיקי זהב ומיקרוסקופ אלקטרוני שידור הבאים (TEM)-בדיקה42.

לסיכום, בדיקת לכידת VLP מספקת כמה יתרונות ניכרים: (1) הערכה של השלמות המבנית של אפיטופים רגישים לנטרול על פני השטח של VLPs, (ii) זיהוי רגיש ועקיף של אנטיגנים גם כאשר מוצג בצפיפות נמוכה על VLPs, ו -(iii) השיטה אינה דורשת ציוד אנליטי עתיר עלות.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני, תוכנית מימון Forschung a Fachhochschulen, מספרי חוזה 13FH767IA6 ו 13FH242PX6 ל- JS. איורים 1 ו-2 נוצרו עם BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינורות תגובה של 1.5 מ"לEppendorf
10x PBSgibco70011044
4%– 15% ג'ל חלבון ללא כתמים Mini-PROTEAN TGX4568085BioRad
(bnAbs)Polymun Scientic
Isotype ControlAntibody invitrogen (Thermo Fisher Scientific)02-7102
מערכת הדמיה Chemidoc XRS+BioRad1708265
עוף נגד ארנב IgG HRP-coupledLife טכנולוגיותA159871:5000 ב-TBS-T + 2% (w/v) אבקת חלב
Dynabeads חלבון G ערכת משקעים חיסוניתinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)10007Dכולל חוצצים ופתרונות כביסה
FreeStyle 293-F cellsinvitrogen (Thermo Fisher Scientific)R790-07
FreeStyle 293 Expression Mediuminvitrogen (Thermo Fisher Scientific)12338026
ניירות לספיגת ג'לWhatmanGB005
GlycineCarl Roth0079מאגר ספיגה
מתלה הפרדה מגנטיניו אינגלנד BiolabsS1509Sעבור 12 x 1.5 מ"ל או 6 x 1.5 מ"ל צינורות
מתנולקארל רוט4627מאגר ספיגה
Mini-PROTEAN Tetra Cell מערכת אלקטרופורזה של תאיםBioRad
Optima XE-90 אולטרה-צנטריפוגהBeckman Coulter
PageRuler סולם חלבון צבוע מראשThermo Scientific26616
מסנני מזרק פוליווינילידן פלואוריד (PVDF), 0.45 ומיקרו; mקארל רוטKC89.1
אבקת חלבקארל רוטT145חוסם מאגר
PVDF transfermembrane, 0.45 ומיקרו; mCarl RothT830.1
QuickTiter HIV p24 ELISACell BiolabsVPK-108-H
ארנב פוליקלונלי ל-HIV1 p55 + p24 + p17abcamab639171:2000 ב-TBS-T + 2% (w/v) אבקת חלב
מסובבHeidolphREAX2
ROTI Load 1 (laemmli buffer)Carl RothK929.14x מאגר טעינת ג'ל חלבון מרוכז
ROTIPHORESE 10x SDS-PAGEקארל רוט3060
נתרן כלוריקארל רוט3957TBS-T מאגר
SuperSignal West Pico PLUS מצע כימילומינסנטThermo Scientific34579
SW28 רוטורבקמן קולטר
ThermomixerCel MediaBasic
Trans-Blot TurboBioRad
Trehalose dihydrateCarl Roth8897.2
TRISCarl Roth5429blotting buffer
TRIS hydrochlorideCarl Roth9090TBS-T buffer
Tween-20Carl Roth9127TBS-T buffer
צנטריפוגה Ultra Clearבקמן קולטר344058
נוגדנים צינורות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M. Virus-like particles in vaccine development. Expert Review of Vaccines. 9 (10), 1149-1176 (2010).
  2. Noad, R., Roy, P. Virus-like particles as immunogens. Trends in Microbiology. 11 (9), 438-444 (2003).
  3. Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139(2020).
  4. Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
  5. Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017(2020).
  6. Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009(2019).
  7. Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78(2019).
  8. Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488(2020).
  9. Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41(2019).
  10. Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
  11. Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251(2021).
  12. Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
  13. Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
  14. Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
  15. Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
  16. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
  17. DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
  18. Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
  19. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
  20. Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865(2019).
  21. Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868(2018).
  22. Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
  23. Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
  24. Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
  25. Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877(2011).
  26. Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
  27. Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
  28. Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
  29. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
  30. Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
  31. JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  33. Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
  34. Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
  35. Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
  36. Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
  38. DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537(2017).
  39. Wang, J. W., Roden, R. B. S. L2, the minor capsid protein of papillomavirus. Virology. 445 (1-2), 175-186 (2013).
  40. Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
  41. Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295(2019).
  42. Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235(2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

VLP Capture AssayVirus Like ParticlesNeutralization EpitopesBroadly Neutralizing AntibodiesAntigen DisplayMagnetic BeadsEnvelope GlycoproteinsSDS PAGEWestern BlotImmunoprecipitation

Related Articles