מאמר שיטה

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

DOI:

10.3791/63147

⸱

10 בפברואר 2022

 ,  , 
1Jawaharlal Nehru University New Delhi

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספקטרוסקופיה של דיכרויזם מעגלי (CD) היא שיטה פשוטה ונוחה לחקור את המבנה המשני ואת האינטראקציות של ביומולקולים. ההתקדמות האחרונה בספקטרוסקופיית תקליטורים אפשרה לחקור אינטראקציות בין חלבון DNA ודינמיקה קונפורמציה של DNA במיקרו-סביבה שונה בפירוט להבנה טובה יותר של ויסות התמלול ב- vivo. האזור סביב אזור תמלול פוטנציאלי צריך להיות לא אחיד כדי שתעתיק יתרחש. זהו תהליך מורכב הדורש תיאום של שינויים histone, כריכה של גורם שעתוק ל- DNA, ופעילויות אחרות שיפוץ כרומטין. באמצעות ספקטרוסקופיה CD, ניתן ללמוד שינויים קונפורמציה באזור המקדם הנגרמים על ידי חלבונים רגולטוריים, כגון שיפוץ כרומטין תלוי ATP, כדי לקדם שעתוק. ניתן לעקוב אחר השינויים הקונפורמציה המתרחשים בחלבון. בנוסף, ניתן לטפל בשאילתות לגבי הזיקה של החלבון לדנ"א היעד שלו ולייחודיות הרצף שלו על ידי שילוב מוטציות בדנ"א היעד. בקיצור, ההבנה הייחודית של שיטה רגישה וזולה זו יכולה לחזות שינויים בדינמיקה הכרומטית, ובכך לשפר את ההבנה של רגולציה תמלול.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיכרויזם מעגלי (CD) היא טכניקה ספקטרוסקופית הנשענת על כיראליות אינהרנטית של מקרומולקולים ביולוגיים המובילה לספיגה דיפרנציאלית של אור מקוטב ימני ושמאלי. ספיגה דיפרנציאלית זו ידועה כדיכרואיזם מעגלי. הטכניקה, אם כן, יכולה לשמש כדי לתאר את הקונפורמציה של מקרומולקולים ביולוגיים, כגון חלבונים ו- DNA, שניהם מכילים מרכזי כיראליים1,2.

גלים אלקטרומגנטיים מכילים רכיבים חשמליים ומגנטיים כאחד. הן השדות החשמליים והן השדות המגנטיים מתנדנדים בניצב לכיוון התפשטות הגלים. במקרה של אור לא קוטבי, שדות אלה מתנדנדים בכיוונים רבים. כאשר האור מקוטב מעגלית, שני שדות אלקטרומגנטיים מתקבלים בהפרש פאזה של 90° זה....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ריכוז עבודה של רכיבי התגובה

  1. הכן את ריכוזי העבודה של מאגרים עבור תקליטור ורכיבי תגובה אחרים טריים (ראה טבלה 1) ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F) לפני הגדרת התגובות.
    הערה: עבור תגובות התקליטור המתוארות במאמר זה, ריכוזי העבודה של רכיבים הם כדלקמן: מאגר נתרן פוספט (pH 7.0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 ננומטר, חלבון 1 מיקרומטר, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.

2. פעילות ATPase

  1. לפני ספקטרוסקופיית התקליטור, בססו את פעילות ה-ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות ה- DNA כדי להבטיח שהחלבון המשמש בספקטרוסקופיית התקליטור פעיל ולזהות את מולקולות ה- DNA היעילות באופן אופט....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ADAAD מייצב מבנה דמוי לולאת גזע על מקדם MYC
ראיות ניסיוניות קודמות הראו כי SMARCAL1 הוא רגולטור שלילי של MYC29. ניתוח של אזור המקדם הארוך של 159 bp של הגן MYC על ידי ממפה QGRS הראה כי לגדיל הקדמי יש פוטנציאל ליצור G-quadruplex (טבלה 2). ספל הראה כי שני גדילי ה- DNA MYC יכולים ליצור מבנה דמוי לולאת גזע (טבלה 2). רצף דנ"א באורך 34 bp המכיל את ה-G-quadruplex (GECE) ה.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מאמר זה היא להציג את טכניקת ספקטרוסקופיית התקליטורים כגישה לחקור את השינויים הקונפורמציה המתרחשים ב- DNA בנוכחות חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP ולקשר את השינויים הקונפורמיים האלה לביטוי גנים. ספקטרוסקופיה של תקליטור מספקת שיטה מהירה ונגישה לחקר השינויים הקונפורמציה בדנ"א.

נקודה קריטית שיש לקחת בחשבון עבור טכניקה זו היא טוהר ה- DNA והחלבון. מומלץ להבטיח כי הן DNA וחלבון הם >95% טהור. יש להשתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים ב-PAGE, ועדיף לטהר את החלבון כדי >95% טוהר. הפרמטר הקריטי השני.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות למתקן מחקר מכשור מתקדם, JNU, על ספקטרופוטומטר התקליטורים. V.J. ו- A.D. נתמכו על ידי מלגה מ CSIR.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולפישר מדעיO3446I-100
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט דיסודיום מלח הידרטSigmaaldrichA2383
CD קוורץ קובטSTARNA21-Q-1
Chirascan V100 CD ספקטרומטריישומי פוטופיזיקהלא זמין
EDTA דיסודיום מלח דיהידראטSRL43272
גלוטתיון ספרוז 4BGE Healthcare17-0756-01כרומטוגרפיה של זיקה לגלוטתיון
Hellmanex III תמיסת ניקוי Hellma9-307-011-4-507
L-Lactic DehydrogenaseSigmaaldrich  L2625
מגנזיום אצטט טטרהידרטפישר מדעיBP215-500
מגנזיום כלוריד הקסהידרטפישר מדעיM33-500
NADH מלח דיסודיוםסיגמאלדריץ'10107735001
פוספואנולפירובט מלח מונוציקלוהקסילאמוניוםSRL40083
אשלגן אצטטפישר מדעיP178-3
Pyruvate KinaseSigmaaldrichP1506
נתרן פוספט דו-בסיסינטול מים Fisher מדעיS374-500
נתרן פוספט מונו-בייסי מונוהידראטפישר מדעיS369-500
סינרגיה HT קורא מיקרו-צלחתBioTekלא זמין
TrisBase Fisher מדעיBP152-500

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Woody, R. W. Circular dichroism. Methods in Enzymology. 246, 34-71 (1995).
  2. Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
  3. Rodg....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD SpectroscopyDNA Protein InteractionsCircular DichroismChromatin RemodelingTranscription RegulationATPase ActivityG Quadruplex DNAPromoter RegionSecondary StructureOligonucleotide Structure

מאמרים קשורים