פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
קספאזות דלקתיות כוללות קספאזה-1, -4, -5, -11 ו -12 ושייכות לתת-קבוצה של קספאזות יוזמות. Caspase-1 נדרש להבטיח ויסות נכון של איתות דלקתי ומופעל על ידי דימריזציה הנגרמת על ידי קרבה לאחר גיוס לדלקת. קספאז-1 מצוי בשפע בשושלת התאים המונוציטית וגורם להבשלה של הציטוקינים הפרו-דלקתיים אינטרלוקין (IL)-1β ו-IL-18 למולקולות מופרשות פעילות. הקספאזות הדלקתיות האחרות, קספאזה-4 ו--5 -(וההומלוגיה שלהן מורין קספאזה-11) מקדמות את שחרור IL-1β על ידי גרימת פירופטוזיס. השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית של קספאזה (BiFC) היא כלי המשמש למדידת קרבה הנגרמת על ידי קספאזה דלקתית כקריאה של הפעלת קספאזה. הקספאזה-1, -4 או -5 פרודומיין, המכילה את האזור הנקשר לדלקת, מתמזגת עם שברים לא פלואורסצנטיים של החלבון הפלואורסצנטי הצהוב נוגה (Venus-N [VN] או Venus-C [VC]) הקשורים לרפורמה בקומפלקס נוגה הפלואורסצנטי כאשר הקספאזות עוברות קרבה מושרית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכניס את הכתבים האלה למקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים (MDM) באמצעות נוקליאופקציה, לטפל בתאים כדי לגרום להפעלת קספאזה דלקתית ולמדוד את הפעלת הקספאזה באמצעות פלואורסצנציה ומיקרוסקופיה קונפוקלית. היתרון של גישה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לזהות את המרכיבים, הדרישות והלוקליזציה של קומפלקס הפעלת הקספאז הדלקתי בתאים חיים. עם זאת, יש לשקול בקרות זהירות כדי למנוע פגיעה בכדאיות ובהתנהגות של התאים. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לניתוח של אינטראקציות קספאז דינמיות ברמה הדלקתית, כמו גם לחקירת מפלי האיתות הדלקתיים ב- MDM חי ובמונוציטים שמקורם בדגימות דם אנושיות.
מבוא
הקספאזות הן משפחה של פרוטאזות ציסטאין אספרטט שניתן לקבץ לתוך קספאזות יוממות וקספאזות תליין. קספאזות תליין כוללות קספאזה-3, -6 ו -7. הם נמצאים באופן טבעי בתאים כדימרים ונבקעים על ידי הקספאזות היוזמות לביצוע אפופטוזיס1. קספאזות יוזמות כוללות קספאזה אנושית-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 ו -12. הם נמצאים כזימוגנים לא פעילים (פרו-קספאזות) המופעלים על ידי דימריזציה הנגרמת על ידי קרבה ומיוצבים על ידי ביקוע פרוטאוליטי אוטומטי 2,3. הקספאזות הדלקתיות הן תת-קבוצה של הקספאזות היוזם2 וכוללות את קספאזה-1, -4, -5 ו-12- בבני אדם, ואת קספאזה-1, -11 ו--12 בעכבר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה תואם את ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של מכללת ביילור לרפואה למניפולציה של דגימות אנושיות. דגימות הדם מטופלות בהתאם להנחיות הבטיחות המוסדיות לדגימות אנושיות. דגימות דם מתקבלות בבנק דם אזורי, שם הן נאספות עם תמיסת ציטראט פוספט דקסטרוז (CPD). עם זאת, דם שנאסף עם נוגדי קרישה אחרים כמו נתרן הפרין, ליתיום הפרין, או EDTA יכול לשמש גם עבור פרוטוקול זה28,29.
1. בידוד מונוציטים אנושיים והתמיינות למקרופאגים
- השג דם נוגד קרישה מאנשים בריאים שאינם מזוהים בבנק דם אזורי ובודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) כפי שמצוין להלן.
הערה: בצע את כל השלב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הסכימה המוצגת באיור 2 נותנת סקירה כללית של אופן ההשגה, ההחלפה והתמונה של MDM אנושי. לאחר הדגירה של המונוציטים שנבחרו ב-CD14+ עם GM-CSF למשך 7 ימים, המורפולוגיה של התא משתנה במהלך תקופת ההתמיינות (איור 3A), ועוברת מתאי השעיה כדוריים למצוברים בצורה קוצנית ומלאה (ימים 3 ו-4), ולבסוף לתאים מתפשטים יותר כאשר הם מתמיינים באופן מלא (יום 7). לאחר מכן, תאים מתמיינים לחלוטין מנותקים מהצלחת ומתבצעים טרנספקטציה עם זוגות ה-BiFC של הקספאזה (VC ו-VN
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים ממונוציטים שבודדו מדגימות דם אנושיות ושיטה להחדרה יעילה של כתבי ה-BiFC של הקספאזה הדלקתית לתוך MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים.
פרוטוקול זה מנצל את טכניקת BiFC35 כדי לתייג את הקספאזות הדלקתיות בתחום גיוס הקספאזות (CARD) בשברים שאינם פלואורסצנטיים של החלבון הפלואורסצנטי המפוצל נוגה. קספאזות דלקתיות מקודדות תחום קטליטי המורכב מתת-יחידה גדולה (עמ' 20) וקטנה (עמ' 10), ומוטיב אינטראקציה של חלבון-חלבון משומר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים לחברי המעבדה של LBH בעבר ובהווה שתרמו לפיתוח טכניקה זו. מעבדה זו נתמכת על ידי NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK12DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). איור 2 צויר באמצעות תוכנת Biorender.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 48 תרבית רקמות באר2:34 צלחות | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 ס"מ כלי תרבית רקמות | VWR | 25382-166 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000x | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 8 כיסויי תא היטב עם 1.5 HP כיסוי | זכוכית Cellvis | c8-1.5H-N | |
| עמודות AutoMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | להפרדה אוטומטית באמצעות מפריד AutoMACS Pro בלבד |
| מפריד AutoMACS Pro | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | להפרדה אוטומטית באמצעות מפריד AutoMACS Pro בלבד |
| פתרון כביסה AutoMACS Pro | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | להפרדה אוטומטית באמצעות מפריד AutoMACS Pro בלבד |
| פתרון שטיפה AutoMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | להפרדה אוטומטית באמצעות AutoMACS Pro Separator בלבד |
| , AutoMacs עם מאגר | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | להפרדה ידנית או אוטומטית באמצעות QuadroMACS או AutoMACS pro Separator |
| Axio Observer Z1 מיקרוסקופ הפוך ממונע המצויד ביחידת דיסק מסתובבת CSU-X1A 5000 | Zeiss | ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במודול לייזר המצויד בקווי לייזר של אורכי גל של 568 ננומטר (RFP) ו-488 או 512 ננומטר (GFP או YFP) ניתן להשתמש | |
| ב-AxioObserver A1, מיקרוסקופ הפוך בדרגת מחקר | Zeiss | ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מסנני פלואורסצנציה המסוגלים לאורכי גל מרגשים של 568 ננומטר (RFP) ו-488 או 512 ננומטר (GFP או YFP) ניתן להשתמש | |
| במיקרו-חרוזים CD14+ | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | להפרדה ידנית או אוטומטית באמצעות QuadroMACS או AutoMACS pro Separator |
| DPBS ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito פלסמיד | Clontech | 632421 | פלסמידים דומים שיכולים לשמש כמדווחים פלואורסצנטיים ניתן למצוא ב- Addgene |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| תוסף GlutaMAX (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| Hemin BioXtra, מחזיר, ≥ 96.0% (HPLC) | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| פלסמידים | זמין על פי בקשה ממעבדת LBH | ||
| LPS-EB Ultrapure | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS עמודות | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | להפרדה ידנית באמצעות מפריד QuadroMACS בלבד |
| מתלה צינורות MACS 15 מ"ל | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | להפרדה ידנית באמצעות מפריד QuadroMACS בלבד |
| MACS MultiStand | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | להפרדה ידנית באמצעות מפריד QuadroMACS בלבד |
| mCherry פלסמיד | Yungpeng Wang Lab | פלסמידים דומים שיכולים לשמש כמדווחים פלואורסצנטיים ניתן למצוא במערכת העברת | |
| ניאון Addgene | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | כולל מכשיר אלקטרופורציה ניאון, תחנת פיפטה ופיפטה |
| מערכת טרנספקציה ניאון 10 ומיקרו; L Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | כולל מאגר השעיה R, מאגר השעיה מחדש T, מאגר אלקטרוליטי E, 96 x 10 ומיקרו; L קצות ניאון וצינורות אלקטרופורציה ניאון |
| מלח נתרן ניגריצין, תמיסה מוכנה | סיגמא | SML1779-1 מ"ל | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| פולי-D-ליזין הידרוברומיד | סיגמא | P7280-5mg | |
| מפריד QuadroMACS | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | להפרדה ידנית באמצעות מפריד QuadroMACS בלבד |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), פנול אדום | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | תוכנת Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| Zeiss Zen 2.6 (מהדורה כחולה) | Zeiss | כל תוכנה המשמשת להפעלת המיקרוסקופ הקונפוקלי לבחירתך |
מקורות
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
