מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעוד שלדגי זברה יש יכולת מעולה לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS), למדאקה יש יכולת התחדשות CNS נמוכה יותר. מודל של פגיעה מוחית פותח בטקטום האופטי הבוגר של דגי זברה ומדאקה ובוצעו ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים השוואתיים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה של רקמה זו על פני מיני דגים אלה. כאן מוצג מודל פגיעה בפצע דקירה עבור טקטום אופטי בוגר באמצעות מחט וניתוחים היסטולוגיים להתרבות והתמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs). מחט הוחדרה ידנית לאזור המרכזי של הטקטום האופטי, ואז הדגים היו מחוררים תוך לב, ומוחם נותח. רקמות אלה הוקפאו והוערכו באמצעות אימונוסטיין כנגד סמני ההתפשטות וההתמיינות המתאימים של NSC. מודל פגיעות טקטום זה מספק תוצאות חזקות וניתנות לשחזור הן בדגי זברה והן במדאקה, ומאפשר להשוות את תגובות המל"ל לאחר פציעה. שיטה זו זמינה לטלאוסטים קטנים, כולל דגי זברה, מדאקה וקיליפיש אפריקאי, ומאפשרת לנו להשוות את יכולת ההתחדשות שלהם ולחקור מנגנונים מולקולריים ייחודיים.
מבוא
לדגי זברה (Danio rerio) יש יכולת מוגברת לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) בהשוואה ליונקים אחרים 1,2,3. לאחרונה, כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס יכולת התחדשות מוגברת זו, בוצעו ניתוחים השוואתיים של התחדשות רקמות באמצעות טכנולוגיית ריצוף הדור הבא 4,5,6. מבני המוח בדגי זברה וטטרפודים שונים למדי 7,8,9. משמעות הדבר היא שמספר מודלים של פגיעות מוחיות המשתמשים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכון הלאומי למדע וטכנולוגיה תעשייתיים מתקדמים. דגי זברה ומדאקה נשמרו על פי נהלים סטנדרטיים28.
1. פצע דקירה בטקטום האופטי למבוגרים
- הכינו תמיסת מלאי טריקאין של 0.4% (w/v) להרדמה. לקבלת תמיסת מלאי של 100 מ"ל, יש להמיס 400 מ"ג טריקאין מתאן-סולפונט (ראו טבלת חומרים) ב-90 מ"ל מים מזוקקים ולהתאים את רמת החומציות ל-7.0 באמצעות חיץ Tris HCl של 1 M (pH 9.0). לאחר התאמת ה- pH, הוסף מים עד 100 מ"ל, ולאחר מכן בצע aliquots המתאימים ולאחסן אותם ב -20 °C.
- כדי להרדים את דגי הזברה הבוגרים או המדאקה, הכינו תמי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות החדרת מחט להמיספרה הימנית (איור 1, איור 4A ואיור 5A) גורמת לתגובות תאיות שונות, כולל התפשטות תאי גליה רדיאליים (RGC) ויצירת תאי עצב שזה עתה נולדו. באופן דומה, אוכלוסיות מבוגרות של דגי זברה ומדאקה שימשו כדי לנטרל השפעות הזדקנות כלשהן בתגובה הרגנרטיבית. לאחר מכן בוצעה הצבעה חיסונית פלואורסצנטית במקטעים הקפואים, והתפשטות והתמיינות RGC נותחו לאחר פגיעת הטקטום בדגי הזברה ובמדאקה (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן מתוארת קבוצה של שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לגרום לפציעות פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט כדי להקל על הערכת התפשטות RGC והתמיינות לאחר פגיעה מוחית. פצעי דקירה בתיווך מחט הם שיטה פשוטה ויעילה המיושמת שניתן ליישם על דגימות ניסיוניות רבות באמצעות סט כלים סטנדרטי. מודלים של פגיעה בפצעי דקירה עבור מספר אזורים במוח דגי הזברה פותחו 3,19,29. הטקטום האופטי הוא אחד האזורים הגדולים ביותר במוח וקל לתמרן אותו. יתר על כן, רוב RGCs בטקט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI מענק מספר 18K14824 ו 21K15195 ומענק פנימי של AIST, יפן.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק 10 מ"ל | TERUMO | SS-10ESZ | |
| 1M Tris-HCl (pH 9.0) | NIPPON GENE | 314-90381 | |
| 30 G מחט | Dentronics | HS-2739A | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 | |
| בלוק | 115 x 80 x 37 מ"מ (W x D x H) הוא בגודל מספיק כדי להקפיא 6 תבניות קריומול | ||
| Anti-BLBP | Millipore | ABN14 | 1:500 |
| Anti-BrdU | Abcam | ab1893 | 1:500 |
| Anti-HuC | Invitrogen | A21271 | 1:100 |
| Anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology | SC-56 | 1:200 |
| Brmodeoxyuridine | Wako | 023-15563 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי C1 פלוס | ניקון | ||
| Cryomold | Sakura Finetek Japan | 4565 | 10 x 10 x 5 מ"מ (רוחב x עומק x גובה) |
| Cryostat | Leica | CM1960 | |
| Danio rerio זני WT | |||
| TERUMO | SF-ET3520 | ||
| Fluoromount (TM) מדיום הרכבה מימי, לשימוש עם רקמות מוכתמות בצבע פלואורסצנטי | SIGMA-ALDRICH | F4680-25ML | |
| מלקחיים | DUMONT | 11252-20 | |
| עיזים נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | |
| עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | |
| Hoechst 33342 תמיסת | Dojindo | 23491-52-3 | |
| חומצה הידרוכלורית | Wako | 080-01066 | |
| תא דגירה ל-10 שקופיות כתום כהה | COSMO BIO CO., LTD. | 10DO | |
| MAS מעיל הזזה | זכוכית מטסונאמי | זכוכית MAS-01 | |
| מיקרו כיסוי זכוכית | מטסונאמי | זכוכית C024451 | |
| מיקרוסקופיה | ניקון | SMZ745T | |
| תמיסת חסימת סרום סוס רגיל | VECTOR LABRATORIES | S-2000-20 | |
| O.C.T COMPOUND | Sakura Finetek יפן | 83-1824 | |
| Oryzias latipes זני WT תא נהג | |||
| PAP עט חוסם נוזלי במיוחד | DAIDO SANGYO | PAP-S | |
| טבליות מי מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4 | מגש | ||
| 100 x 100 x 10 מ"מ (רוחב x עומק x גובה) יריעת קלקר זמינה כמגש | |||
| טריקאין (MS-222) | 14805-24 | ||
| טריסודיום ציטראט דיהידראט | וואקו | 191-01785 | |
| טריטון X-100 | וואקו | 04605-250 |
מקורות
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
