גירוי וניתוח נוירוגנזה למבוגרים במוח המרכזי של דרוזופילה
Summary
מאמר זה מספק פרוטוקולים מפורטים לגרימת פגיעה מוחית טראומטית חודרת (PTBI) לדרוסופילים למבוגרים ובחינת הנוירוגנזה המתקבלת.
Abstract
המנגנונים המולקולריים והתאים שבבסיס נוירוגנזה בתגובה למחלה או לפציעה אינם מובנים היטב. עם זאת, הבנת מנגנונים אלה חיונית לפיתוח טיפולים רגנרטיביים עצביים. Drosophila melanogaster הוא מודל מוביל למחקרים של התפתחות עצבית אבל מבחינה היסטורית לא נוצל כדי לחקור התחדשות המוח למבוגרים. הסיבה העיקרית לכך היא שהמוח הבוגר מציג פעילות מיטוטית נמוכה מאוד. עם זאת, חדירה לפגיעה מוחית טראומטית (PTBI) למוח המרכזי של דרוזופילה הבוגרת מפעילה את הדור של נוירונים חדשים וגליה חדשה. הכלים הגנטיים העוצמתיים הזמינים בדרוסופילה בשילוב עם פרוטוקול הפציעה הפשוט אך הקפדני המתואר כאן הופכים כעת את מוח הדרוזופילה למבוגרים למודל חזק למחקר התחדשות עצבית. להלן הוראות מפורטות ל(1) פגיעות חודרות למוח המרכזי הבוגר ו-(2) ניתוח, אימונוהיסטוכימיה והדמיה לאחר פציעה. פרוטוקולים אלה מניבים תוצאות רב-כיווניות ויקלו על מחקרים נוספים לנתח מנגנונים שבביסת התחדשות עצבית.
Introduction
נזק למוח ולמערכת העצבים הוא גורם עיקרי למוות ונכות ברחבי העולם. כ -1.5 מיליון אמריקאים סובלים מפגיעות מוחיות טראומטיות (TBI) מדי שנה1, בעוד שכ -6 מיליון אנשים בארצות הברית לבדה סובלים ממחלות ניווניות, כגון פרקינסון ומחלת אלצהיימר2. הן מחלה והן פגיעה במוח עלולות לגרום לניוון עצבי, מה שמוביל לפגמים חושיים, קוגניטיביים ומוטוריים3. פיתוח אסטרטגיות טיפוליות לתיקון המוח האנושי היה קשה בשל הפיזיולוגיה המורכבת של המוח. מודל אורגניזמים כגון Drosophila melanogaster לספק מערכת פשוטה לזיהוי המנגנונים הבסיסיים הבסיסיים ניוון עצבי ויעדים טיפוליים פוטנציאליים4.
זבוב הפירות Drosophila melanogaster היה אורגניזם מודל רב עוצמה במשך יותר ממאה שנה, קידום תחומי הגנטיקה, הביולוגיה ההתפתחותית, ומדעי המוח5,6. המוח Drosophila מורכב רק ~ 90,000 נוירונים7, פי מיליון פחות מאשר המוח האנושי הממוצע8, עדיין יש להם קווי דמיון רבים. הן המוח האנושי והן המוח הזבוב לנצל את הנוירוטרנסמיטרים גאבא, גלוטמט, אצטילכולין, ואת אמינים ביוגני דופמין וסרוטונין9. Drosophila נוירונים אנושיים גם לתפקד באופן דומה, עם ארכיטקטורה סינפטית משותפת וסוגי תאים עצביים אנלוגיים10. גודל המוח הקטן יותר של Drosophila ואת הזמינות של טכניקות גנטיקה מתקדמות, בשילוב עם שימור מנגנונים מולקולריים, תאיים ופיזיולוגיים בין Drosophila ויונקים, מאפשר לחוקרי Drosophila לשאול שאלות שאינן מעשיות או קשה לענות במודלים יונקים.
ההבנה הנוכחית שלנו של נוירוגנזה למבוגרים בדרוסופילה, הן במהלך הומאוסטזיס והן בעקבות פציעה, נותרה מוגבלת. עוד ידוע על נוירוגנזה במהלך התפתחות נורמלית. לדוגמה, נוירונים וגליה נוצרים במהלך התפתחות מתאי מבשר, הנקראים neuroblasts10,11. לפחות שלושה סוגים שונים של נוירובלסטים נבדלו במוח המרכזי. הן סוג I והן סוג II neuroblasts שושלת לצאת מחזור התא ~ 20-30 שעות לאחר היווצרות puparium12. לעומת זאת, נוירובלסטים גוף פטריות הם האחרונים לסיים את חלוקת התא ולעשות זאת באמצעות אפופטוזיס תלוי ריפר ~ 85-90 שעות לאחר היווצרות puparium13. לאחר אקסלוסיה, המוח Drosophila הבוגר יש מעט תאים מתחלקים (~ 1 תא / מוח), בעיקר glia14. האונות האופטיות הבוגרות מחזיקות באיטיות ברכיבה על אופניים נוירובלסטים המסוגלים לנוירגנזה15, בעוד שלמוח המרכזי למבוגרים אין נוירובלסטים ידועים. המחסור של אבות עצביים והתפשטות תאים מוגבלת דומה מאוד למצב במוח היונקים הבוגרים, ומדגיש את הרלוונטיות הפוטנציאלית של המנגנונים של נוירוגנזה בוגרת בדרוסופילה לבני אדם.
גילוי רמות נמוכות של נוירוגנזה למבוגרים באונות האופטיות של Drosophila למבוגרים לאחר פציעה15 הוביל להשערה כי המוח המרכזי של Drosophila הבוגרת עשוי גם להיות מסוגל נוירוגנזה למבוגרים16. פרוטוקול זה מתאר יצירת מודל קפדני, לשחזור של פגיעה מוחית מרכזית Drosophila למבוגרים שניתן להשתמש בו כדי לחקור neurogenesis במוח המרכזי למבוגרים. בהתחשב בדמיון בין ארכיטקטורת המוח האנושית לבין תפקוד המוח Drosophila , תגליות אלה עלולות להוביל לזיהוי מטרות קריטיות לנורוגנזה טיפולית במוחות אנושיים פצועים וחולים.
Protocol
פרוטוקול זה פועל על פי הנחיות הטיפול בבעלי חיים של UW-מדיסון.
1. יצירת Drosophila למבוגרים עבור PTBI
- עבור הצלב הסטנדרטי, מקם 20 בתולה y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL417 נקבות בוגרות ו-10 y[1] w[1]17 גברים בוגרים טסים יחד בבקבוקונים (ראו טבלת חומרים) המכילים מזון. כדי שיהיו מספר גדול של צאצאים סינכרוניים, הגדר 10-20 צלבים בו זמנית. הצלב הסטנדרטי מעורר צאצאי F1 של הגנוטיפ: y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; אוקיי107-GAL4/+.
- מניחים את הבקבוקונים ב 25 °C (75 °F) להזדווגות והטלת ביצים. כדי למקסם את האבן, להעביר את ההורים בקבוקונים חדשים כל 2-4 ימים, שמירה על הבקבוקונים המוקדמים ב 25 °C (70 °F). יש להשליך כל מקטורן 18 יום לאחר שההורים הונחו בו לראשונה כדי להבטיח שאין צאצאי F2.
הערה: ניתן להפיק 3 קבוצות של צאצאים (“מהורהרים”) מכל קבוצה של הורים. - בדוק לאחר ~ 10 ימים, כאשר הצאצאים F1 יתחילו להתפרק.
- מניחים את הבקבוקונים ב 25 °C (75 °F) להזדווגות והטלת ביצים. כדי למקסם את האבן, להעביר את ההורים בקבוקונים חדשים כל 2-4 ימים, שמירה על הבקבוקונים המוקדמים ב 25 °C (70 °F). יש להשליך כל מקטורן 18 יום לאחר שההורים הונחו בו לראשונה כדי להבטיח שאין צאצאי F2.
- למחקרי שושלת היוחן, השתמש F1 זכרים תאומים פרמה15 של גנוטיפ: w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-מיר/FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-מיר; אמבטיה-GAL80ts / מעשה GAL4 UAS-flp. עבור עקביות, לעשות את הצלב הזה באותו כיוון בכל פעם.
- כדי ליצור זכרים תאומים פרמה, מקום 20 בתולה w; FRT40A, UAS-CD2-RFP, UAS-GFP-מיר; נקבות אמבטיה-GAL80ts/TM6B ו-10 w; FRT40A, UAS-CD8-GFP, UAS-CD2-מיר; act-GAL4 UAS-flp/TM6B15 זכרים בוגרים יחד בבקבוקונים המכילים מזון.
- מניחים את הבקבוקונים ב 17 °C (7 °F) להזדווגות והטלת ביצים. העבר הורים לבקבוקונים של מזון חדש כל 7 ימים, שמירה על כל הבקבוקונים ב 17 °C (7 °F). להשליך כל מקטורן 35 ימים לאחר ההורים הונחו בו לראשונה כדי להבטיח כי אין צאצאי F2.
- בדוק לאחר ~ 21 ימים, כאשר הצאצאים F1 יתחילו להתפרק.
2. פגיעה מוחית טראומטית חודרת (PTBI; איור 1)
- מיין זבובי F1 חדשים. בחר זכרים צעירים בתוך 6 שעות לאחר אקסלוסיה. מניחים את הזכרים האלה בבקבוקונים נקיים המכילים מזון, עם 40 זבובים או פחות לכל בקבוקון.
הערה: זה מושג בקלות רבה ביותר באמצע הבוקר על ידי עשיית זבובים על כרית CO2 וזיהוי זכרים בוגרים שעדיין יש להם meconium (גלוי כנקודה ירקרקה כהה דרך דופן הבטן) במעיים שלהם. - קדם-הזנה עם 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) (ראה טבלת חומרים) עבור 6 שעות לפני הפציעה אם מתכננים לסמן חלוקת תאים עם EdU. ראה שלב 3 לקבלת פרטים.
- לחטא סיכות Minutien (ראה שולחן חומרים) במשך 5 דקות לפחות על ידי הצבת ~ 100 סיכות בצינור microcentrifuge 1.5 מ”ל מלא 70% אתנול.
- יש לחטא את משטח הפחמן הדו-חמצני ואת המכחול על ידי ריסוס 70% אתנול ונגב יבש עם רקמה נקייה ללא מוך. לאחר שהכלים נקיים ויבשים, העבירו 40 זכרי F1 ממוינים או פחות בחזרה למשטח הנקי.
- הפרד את זכרי F1 לשתי קבוצות על משטח הזבוב. קבוצה אחת תשמש כשליטה, זבובים ללא פגע. קבוצת הניסוי השנייה תהיה כפופה ל-PTBI.
- באמצעות מלקחיים, למשוך 4-5 סיכות Minutien חדש מתוך צינור microcentrifuge ומניחים אותם ליד הקצה של כרית CO2 . תחת טווח הניתוח, בחר סיכת Minutien ישרה עם נקודה חדה.
הערה: שימוש בסיכת Minutien אחת לניסוי יפחית את השונות. לעשות שימוש חוזר בפינים חדים. מניחים סיכות פגומות או קהות בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מ”ל המכיל 70% אתנול לסילוק בטוח. - אם אתם עובדים עם זבובים מהצלב הסטנדרטי, הדליקו את מנורת הדיודה פולטת האור (LED) של מיקרוסקופ סטריאו המצוידת במסנני העירור והפליטה המתאימים לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). זה מאפשר עירור ב 440-460 ננומטרי ומאפשר הדמיה של 500-560 ננומטר.
הערה: עם המנורה ומסנן זה, גופי התא של גוף הפטריות יהיה פלואורסצ’ה ירוק דרך חתך הראש (איור 1C). עבור זבובים או זבובים של גנוטיפים אחרים, ניתן להשתמש במאיר אור לבן סטנדרטי למיקרוסקופ הסטריאו כדי לדמיין ציוני דרך על גוון הראש למיקוד הפגיעה בגוף הפטריות (איור 1C). - השתמש במלקחיים כדי להרים ולהחזיק את סיכת Minutien שנבחרה ביד אחת (עבור אנשים ימניים, זה בדרך כלל יד ימין) ואת מברשת צבע ביד השנייה (בדרך כלל שמאל). בחר זבוב מקבוצת הניסוי ומיקם את הזבוב כך שיש לך מבט על גופרית של קפסולת הראש עם ראש הזבוב ימינה. מניחים את המברשת על החלק המקדים של בית החזה של גבי ולדחוף למטה בעדינות כדי לייצב את הזבוב.
- כוונו את קצה סיכת Minutien לגופי התא של גוף הפטרייה בצד ימין של הראש וחדרו את כמוסת הראש. אם אתם משתמשים בציוני דרך, כוונו לחתך הראש הגבי בין האוקלי לשפת הגב של העין (איור 1).
- לאחר השלמת הפציעה, השתמש במכחול כדי לדחוף את הראש בעדינות את סיכת Minutien.
- אם אתם משתמשים במוח עבור RNA-Seq או qRT-PCR, הפוך לפציעה שנייה בצד שמאל של הראש.
- חזור על שלבים 2.8-2.10 כדי לפגוע בכל הזבובים בקבוצת הניסוי.
- לאחר שכל הזבובים נפצעו, הניחו את השליטה ופגעו בזבובים לתוך בקבוקונים נפרדים ומסומנים המכילים מזון. הנח את הבקבוקונים אופקית (כלומר, בצדדים שלהם) בעוד הזבובים להתאושש מן ההרדמה ובמהלך ההזדקנות לאחר מכן כדי למנוע זבובים להיתפס במזון.
- צלב רגיל טס במהירות של 25 °C (70 °F), וטיסות פרמה-טווין ב 30 °C (50 °F) עד גיל.
- עבור זבובים בגילאי יותר מ 24 שעות, מניחים אותם על מזון נקי כל 1-2 ימים.
3. תיוג EdU
- הכן מלאי של 10 mM 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO). זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C (50 °F) עד 12 חודשים.
- הכן 200 μL של 50 מיקרומטר EdU ב 10% סוכרוז. קדם-הזנה טסה עם EdU במשך 6 שעות לפני PTBI.
- מקם 200 μL של 50 μM EdU ב 10% סוכרוז על נייר מסנן כיתה 3 עגול 23 מ”מ (ראה שולחן חומרים) בחקירה ריקה אחרת.
- מניחים את הזבובים בוויון. ואז לאטום את המשחקון עם תקע כותנה.
- מניחים את הנקיל אופקית באינקובטור לח ב 25 °C (6 °F) במשך 6 שעות.
- בצע PTBI כמתואר בשלבים 2.3-2.10.
- מחזירים את הזבובים לפוען המכיל את EdU. אוטמים את הוויאל עם תקע כותנה.
- מניחים את הקרבון אופקית באינקובטור לח ב 25 °C (75 °F) עד 24 שעות. בצע את אחד השלבים המתוארים להלן (שלב 3.8.1-3.8.3).
- לנתח ולתקן את המוחות כמתואר בשלב 4 באמצעות חיץ קיבוע, לשטוף ולחסום ללא אזיד ועם תגובת הזיהוי של EdU שבוצעה לפני כתמי נוגדנים.
- העבר את הזבובים לנקניקיה נקייה המכילה נייר מסנן חדש ו 200 μL של 50 μM EdU ב 10% סוכרוז. מניחים את הקרבון אופקית באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס. חזור על הפעולה כל 24 שעות במהלך תיוג. לאחר מכן, לנתח ולתקן את המוח כפי שמתואר בשלב 4 באמצעות חוצצים ללא אזיד עם תגובת זיהוי EdU שבוצעה לפני כתמי נוגדנים.
- כדי לתווית מרדף דופק עם EdU, להאכיל את EdU לתקופת הדופק, להעביר את הזבובים כל 24 שעות לפקעת נקייה המכילה נייר מסנן חדש ו 200 μL של 50 מיקרומטר ב 10% סוכרוז. לאחר תקופת הדופק (למשל, 4 ימים), מעבירים את הזבובים למוסך המכיל מזון דרוסופיל סטנדרטי. מניחים את הנקריאל על צידו בחממה של 25 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים נוספים. לאחר מכן, לנתח ולתקן את המוח כפי שמתואר בשלב 4 באמצעות חוצצים ללא אזיד עם תגובת זיהוי EdU שבוצעה לפני כתמי נוגדנים.
4. דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה, והרכבה
- הכן צינורות microcentrifuge 1.5 מ”ל עם 100 μL של קבוע: 4% פורמלדהיד ב- PEM (100 mM piperazine-N,N’bis (חומצה 2-אתנסולפונית) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0) (ראה שולחן חומרים) ומניחים על קרח.
הערה: עד 20 מוחות של גנוטיפ אחד ומצב ניתן לעבד בצינור אחד. - הכן צלחת ביתור עם בריכה קטנה אחת (~ 100 μL) של 70% אתנול ושלוש בריכות קטנות של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS; 100 מ”ר של K2HPO4, 140 מ”ר של NaCl, pH 7.0).
- אני מרדים ~ 10 שליטה או זבובים ניסיוניים על כרית CO2 שחוטאה עם 70% אתנול.
- להפריד את הראש מתא המטען של כל זבוב באמצעות אזמל.
- אוספים את הראשים עם מברשת צבע רטובה ב-70% אתנול ומניחים את הראשים במשך 2-5 דקות בבריכת האתנול על צלחת הניתוח.
הערה: זה מעט מייבש את המוחות ועושה אותם קל יותר לנתח מן חתך הראש. - העבר את הראשים למאגר ~ 100 μL של PBS ולנתח את המוח, העברת כל מוח למאגר נקי ~ 100 μL של PBS. בצע זאת באמצעות שני זוגות של מלקחיים שענים כדי לפתוח את החלק האחורי של חתך הראש ולהחזיק את החתך עם זוג אחד של מלקחיים תוך חטטנות עדינה את המוח מתוך החתך באמצעות הקצה הסגור של זוג המלקחיים השני.
- העבר את המוחות נותחו לצינור microcentrifuge המכיל 100 μL של פתרון התיקון באמצעות pipettor P200 מצויד קצה פלסטיק כי כבר חתוך משופע כדי לאפשר כניסה של המוח.
- לתקן במשך 20-25 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את התיקון עם P200 או פיפטה זכוכית.
- לשטוף את המוח הקבוע ארבע פעמים עם 1 מ”ל של ‘PT’ (PBS בתוספת 0.1% Triton X-100), ומאפשר למוח להסתפק במשך מספר דקות בין כל לשטוף.
הערה: אם המוחות אינם מתיישבים במהירות בין הכביסות, סביר להניח שיש להם עדיין גוף שומן ו /או קנה הנשימה מחובר. - דגימות בלוק ב 1 מ”ל של PBS בתוספת 0.1% Triton X-100 ו 2% אלבומין סרום בקר (PBT) עבור ~ 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- הסר את פתרון חסימה ודגימות דגירה עם 100 μL של פתרון נוגדנים ראשוני לילה ב 4 °C ב PBT. הנוגדנים העיקריים המשמשים במחקר זה הם ארנב אנטי PH3 (1:500) ועכבר אנטי פאסיקלין II (1:20) (ראה טבלה של חומרים).
- לשטוף דגימות חמש פעמים עם 1 מ”ל של PT, המאפשר למוח להסתפק במשך כמה דקות בין כל לשטוף.
- הסר את הכביסה הסופית ודגרה ב 100 μL של פתרון נוגדן משני לילה ב 4 °C (70 °F). הנוגדנים המשניים המשמשים כאן הם אנטי ארנב 568 (1:400) ו- Cy5 נגד העכבר (1:100) (ראה טבלת חומרים).
- לשטוף דגימות חמש פעמים עם 1 מ”ל של PT, המאפשר למוח להסתפק במשך כמה דקות בין כל לשטוף. במהלך הכביסה הסופית, להוסיף 4′,6-Diamidino-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI; 1:100 של פתרון 10 מיקרומטר) במשך 10 דקות כדי להכתים את הגרעינים. הסר את הכביסה, משאיר 50-100 μL בכל צינור.
- הכן שקופיות מיקרוסקופ על-ידי הצבת תווית חיזוק יחידה עם דבק עצמי באמצע כל שקופית ולט טיפה של 50 μL של מדיה נגד עמעום במרכז כל תווית (ראה טבלת חומרים). תווית החיזוק מחזיקה את כיסוי הכיסוי מעט מעל המגלשות ומונעת מהמוחות המותקנים להיות שטוחים יתר על המידה.
- העבירו בזהירות את המוח מכל צינור מיקרוצנטריפוגה לשקופית מוכנה עם כמה שפחות חוצץ כביסה באמצעות P200 המצויד בקצה פלסטיק חתוך ומפופע. עד 10 מוחות יכולים להיות מותקנים בשקופית אחת.
- השתמש במלקחיים כדי למקם מחדש בעדינות את המוח לפני הנחת כיסוי על כל שקופית ואיטום המגלשה עם לק. כוון את המוח עם הצד האחורי למעלה או הצד הקדמי למעלה, אך לא צריך לגעת זה בזה.
הערה: מכיוון שקשה להשיג תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה דרך מוח שלם, יש להרכיב מוחות מסוימים בכל כיוון. - יש לאחסן שקופיות מוכנות שטוחות ובחשיכה ב-4 מעלות צלזיוס עד להדמיה. לאחסון לטווח ארוך יותר (עד שנה אחת), ניתן לאחסן שקופיות ב- -20 °C (70 °F).
5. הדמיה קונפוקלית
הערה: מוחות תמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם לייזרים עירור וקוביות מסנן פליטה המתאימות DAPI ואת הנוגדנים המשניים פלואורסצנטי (כלומר, 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 568 ננומטר, 633 ננומטר, בהתאמה).
- הפעל את העוצמה של המיקרוסקופ, הלייזרים, הבקר והמחשב.
- פתח את תוכנת הרכישה.
- במצב רכישה, בחר עד ארבעה ערוצים והגדר את הפרמטר לסריקה רציפה של הערוצים הרצויים. הגדל את כוח הלייזר עבור כל ערוץ ל-5-10%.
- מקם שקופית על המיקרוסקופ.
- בחר מוח להיקרא באמצעות קובץ מצורף epifluorescence (ראה טבלה של חומרים).
- במצב רכישה, בחר 1024 x 1024 פיקסלים כממד המסגרת.
- במצב רכישה, בחר באפשרות Z-stack, ציין שיש לקחת מחסנית Z במקטעים של 2 מיקרומטר, ולהתמקד במדגם, תוך בחירת המישורים המוקדיים העליונים והתחתונים שיש לדמיין.
- לאסוף Z-מחסנית תמונות של מוחות שלמים באמצעות מטרה 20x ואזורי מוח ספציפיים כגון גוף הפטריות באמצעות מטרה 60x.
6. ניתוח נתונים
- לכמת את התאים המתרבים ואת המספרים של שיבוטים תאומים פרמה באופן ידני ו / או באמצעות תוכנת ניתוח התמונה (ראה טבלה של חומרים). בעת שימוש בתוכנה, בחר אזורי עניין (ROIs) עם אזורים של לפחות 10 מיקרומטר.
Representative Results
Discussion
למרות שפציעות חודרות למוח הדרוזופילה הבוגר תוארו בעבר 15,17,18, פציעות אלה התמקדו באונות האופטיות ולא במוח המרכזי. יתר על כן, עד כה חסרות הוראות מפורטות כיצד לבצע את הפציעות. פרוטוקול זה מתאר מודל לחדירה לפגיעה במוח המרכזי של דרוזופילה הבוגרת, המהווה ראיות מובהקות סטטיסטית לנוירוגנזה בוגרת לאחר PTBI.
הרבייה של פרוטוקול PTBI זה נובעת, בחלקה, לגוף הפטריות כאזור יעד הפציעה. גוף הפטריות גדול, המורכב ~ 2200 נוירונים עם דנדריט מורכב ארבורים אקסון במערכים גדולים מאוד סטריאוטיפי18. גופי התאים של תאי העצב של גוף הפטריות נמצאים ליד פני השטח של המוח וניתן לדמייןם דרך חתך הראש באמצעות ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (איור 1C). מבשרי גוף פטריות הם תאי הגזע העצביים האחרונים שעברו אפופטוזיס במהלך הפיתוח13,12,19. לכן, נוירונים רבים בגוף פטריות הם די צעירים בזמן העיקול. זה הוביל להשערה כי גוף הפטריות עשוי להיות בעל פוטנציאל מיטוטי יותר מאשר אזורי מוח אחרים16. בנוסף, גוף הפטריות הוא קריטי ללמידה וזיכרון18. זה מאפשר לשאול אם נוירוגנזה מופעלת PTBI מובילה להתאוששות תפקודית.
גורמים אחרים התורמים לשחזור התוצאות כוללים שימוש בזבובים מנוטרלים של גנוטיפים עקביים, ביצוע צלבים באותו כיוון בכל פעם, שליטה מדויקת בטמפרטורות ההגידול וההזדקנות וניתוח זכרים ונקבות בנפרד. שימוש בזבובי F1 ממחשוף מפחית את ההסתברות לנתח הומוזיגוס במוח עבור מוטציות ספונטניות. הצלב הסטנדרטי של y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 נקבות בוגרות ל y[1] w[1] זבובים זכר בוגרים תוצאות F1 צאצאים של הגנוטיפ y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; אוקיי107-GAL4/+. OK107-GAL4 מתבטא בכל הנוירונים המהותיים של גוף הפטריות ומניע ביטוי של הכתב הקשור לממברנה UAS-mCD8-GFP המאפשר הדמיה של גופי פטריות והתחזיות שלהם. עבור הצלבים התאומים, הצלבים חייבים להישאר ב 17 °C (7 °F) בכל עת כדי לשמור על מערכת מעקב שושלת כבויה. זה מבטיח כי אין תאים מתחלקים מסומנים במהלך הפיתוח וכי רק נוירונים ילידי מבוגר גליה מסומנים. עד לכאן, ניתן לשמור גם על חדר הזבובים ב-17 מעלות צלזיוס. למרות התיאור הראשוני של מערכת פרמה-טווין15 מומלץ גידול טס ב 18 °C (50 °F), זה יכול להוביל תיוג רקע משמעותי.
עבור עקביות, מומלץ גם לשמור על זבובי שליטה ללא פגע על משטח CO2 כמו אחד מבצע את PTBI. זה מבטיח כי שני סטים של זבובים יש חשיפה הרדמה זהה. בנוסף, רצוי להתרבות לחדור לחלוטין את הראש. עם זאת, יש להקפיד שלא לכופף את קצה הסיכה כנגד הפנקס, מה שהופך אותו לבלתי שמיש לפציעות עתידיות. עבור מתרגלים מיומנים, יש מעט נזק לא מכוון זבובי PTBI. עם זאת, לחיצה קשה מדי על בית החזה כדי לייצב את הזבוב במהלך פציעה יכולה להיות קטלנית. אחת הדרך להעריך את היקף הפגיעה הלא מכוונת היא לכמת את התמותה של זבובי PTBI 24 שעות לאחר פציעה. עבור זבובים פצועים באופן חד צדדי, זה יכול להיות 50% ומעלה למתחילים. לכן, כדי להבטיח כי התוצאות שנצפו נובעות PTBI ולא פציעה לא מכוונת, מומלץ כי מתחילים בפועל ניהול PTBI על ~ 20 זבובים מדי יום על פני מספר שבועות ולא לנתח את המוחות המתקבלים עד התמותה 24 שעות הוא בעקביות <10%.
כדי לכמת את כמות ההתפשטות מגורה על ידי המוח המרכזי PTBI, הן נגד phosphohistone H3 (PH3) חיסונית 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) התאגדות ניתן להשתמש. אנטי-PH3 מתייג תאים לפני ולאורך מטפאזה, ומגביל את הזיהוי רק לחלק קטן מהתאים המפרידים באופן פעיל. לכן, כתמים נגד PH3 מספק רק הצצה חלקית של התפשטות. EdU הוא אנלוגי תימידין שניתן לשלב בדנ”א מסונתז חדש. על ידי האכלת זבובים EdU לפני ואחרי פציעה, ניתן לקבל תמונה מלאה יותר של התאים כי הם גם מתחלקים או מחולקים בעקבות הפציעה. העובדה כי כל התאים המתחלקים מסומנים לצמיתות מועילה הן לזיהוי של תאים רכיבה איטית ו- assay את הישרדות התאים לאחר התפשטות ראשונית. מסיבות לא ברורות, אבל אולי בשל חדור מוגבל של מחסום הדם – מוח, תיוג EdU אינו יעיל ולא מדווח התפשטות תאים במוח הבוגר. עדות לכך היא המספרים הדומים של תאי PH3+ ו- EdU+ הן במוחות שליטה והן במוח ניסיוני במהירות של 24 שעות לאחר PTBI ועל ידי התבוננות שרק תת-קבוצה של תאים חדשים בשיבוטים תאומים קיימים משלבים את EdU16. עבור תיוג מקסימלי, זה חיוני כדי להאכיל מראש את הזבובים עם EdU כי זבובים פצועים לא לחדש להאכיל במשך כמה שעות לאחר PTBI. האכלה הוערכה על ידי הוספת צבע מזון לפתרון EdU וניטור כמות הצבע במעיים דרך בטן 16.
יש לציין כי בעוד שסיפקנו פרוטוקול ניתוח המוח בשלב 4, ניתן להשתמש בטכניקות חלופיות. כמה מהם זמינים בפרוטוקולים שפורסמו בעבר20,21,22. Drosophila melanogaster מציעה מודל בעלות נמוכה עם כלים גנטיים ומולקולריים רבי עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התחדשות של רקמות מרובות, כולל המעיים והרכיבים של מערכת העצבים. מודל פציעה חדשני וניתן לשחזור שניתן להשתמש בו כדי לחקור את התגובה לפגיעה מוחית מתואר כאן. נתונים המתקבלים באמצעות פרוטוקולים אלה תומכים ברעיון שהמוח המרכזי של דרוזופילה הבוגר שומר על יכולת ההתרבות, ויוצר נוירונים חדשים בתגובה לפציעה. תצפיות אלה מצדיקות חקירה נוספת הן של היקף הנוירוגנזה הבוגרת והן של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים שלה. ברגע שהרכיבים המעורבים בהתחדשות עצבית מזוהים במערכת זו, אנו יכולים להמיר את הידע שלנו על נוירוגנזה דראוזופילה למבוגרים לבני אדם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| #11 disposable scalpels | Santa Cruz Biotechnology | sc-395923 | used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection |
| 150 mm diameter black Sylgard dishes | Dow | 1696157 | made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection |
| 18 mm coverslips | any | for mounting brains on microscope slides | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | for immunohistochemistry |
| 70% Ethanol | made from 95% ethanol sourced variously | ||
| anti-mouse Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | for immunohistochemistry |
| anti-rabbit 568 | ThermoFisher | A11036 | for immunohistochemistry |
| bovine serum albumin (BSA) | SIgma Aldrich | A7030 | for immunohistochemisty |
| Clear nail polish | any | for sealing coverslips | |
| Click-It EdU labeling kit | InVitrogen | C10640 | to detect newly synthesized DNA |
| CO<sub>2</sub> bubbler | Genesee Scientific | 59-181 | for anesthesia |
| CO<sub>2</sub> pad | Genesee Scientific | 59-114 | for anesthesia |
| CO<sub>2</sub> regulator and supply | any | for anesthesia | |
| Confocal microscope | any | for imaging fixed, stained and mounted brains | |
| cotton plugs | Genesee Scientific | 51-101 | for EdU labeling |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-109 | for EdU labeling |
| Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM) | components sourced from various companies | for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549 | for fixing adult brains, added to PEM |
| Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round | Tisch Scientific | 1003-323 | for EdU labeling |
| Microfuge tubes | any | for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins | |
| Microscope slides | any | for mounting brains | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | for brain injury; 12.5 μm diameter tip and 100 μm diameter rod |
| mouse anti-Fasiclin II | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4-s | for immunohistochemistry |
| NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor | Electron Microscopy Sciences | SFA-GR | fluorescence setup for dissecting microscope |
| P20, P200 and P1000 pipettors and tips | any | for measuring solutions | |
| phosphate buffered saliine (PBS) | components sourced from various companies | for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0 | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT) | components sourced from various companies | for washing dissected brains | |
| phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT) | components sourced from various companies | blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies | |
| rabbit anti-PH3 | Santa Cruz Biotechnology, Inc | sc-8656-R | for immunohistochemistry |
| Reinforcement labels | Avery | 5721 | to maintain space between the microscope slide and the coverslip |
| Size 0 paintbrushes | any | to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | |
| Two pair of #5 watchmakers forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | used to hold the Minutien pins and for brain dissections |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | mounting medium for microscope slides |
References
- . Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States Available from: https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html (1999)
- . NIEHS Available from: https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm (2021)
- Morton, N. V., Wehman, P. Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations. Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).
- Bonini, N. M., Berger, S. L. The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics. Genetics. 205, 1-4 (2017).
- Brace, E. J., DiAntonio, A. Models of axon regeneration in Drosophila. Experimental Neurology. 287, 310-317 (2017).
- Hao, Y., Collins, C. Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila. Current Opinion in Genetics & Development. 44, 84-91 (2017).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Meinertzhagen, I. A. The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits. Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).
- Ito, K., Hotta, Y. Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).
- Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila. Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).
- von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling. Neural Development. 4, 9 (2009).
- Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E. Adult neurogenesis in Drosophila. Cell Reports. 3 (6), 1857-1865 (2013).
- Crocker, K. L., et al. Neurogenesis in the adult Drosophila brain. Genetics. , (2021).
- Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).
- Aso, Y. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization. Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).
