גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים

סיכום

גפיים רקומביננטיות הן מודל ניסיוני רב עוצמה המאפשר לחקור את תהליך התמיינות התאים ויצירת דפוסים בהשפעת אותות עובריים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת גפיים רקומביננטיות עם תאי עוף גפיים-מזודרמליים, הניתנים להתאמה לסוגי תאים אחרים המתקבלים מאורגניזמים שונים.

תקציר

התמיינות תאים היא תהליך מכוונן היטב של מחויבות תאים המוביל להיווצרותם של סוגי תאים מיוחדים שונים במהלך הקמת רקמות ואיברים מתפתחים. תהליך זה נשמר באופן פעיל בבגרותו. התמיינות תאים היא תהליך מתמשך במהלך ההתפתחות וההומאוסטזיס של איברים. הבנת השלבים המוקדמים של התמיינות תאים חיונית כדי לדעת תהליכים מורכבים אחרים כגון מורפוגנזה. לפיכך, גפי עוף רקומביננטיות הן מודל ניסיוני המאפשר לחקור התמיינות תאים ויצירת תבניות תחת אותות דפוס עובריים. מודל ניסיוני זה מחקה סביבת in vivo ; הוא מרכיב תאים צבורים מחדש לתוך כיסוי אקטודרמלי המתקבל מניצן גפיים מוקדם. מאוחר יותר, אקטודרמים מועברים ומושתלים בקולטן עובר אפרוח כדי לאפשר את התפתחותו. בדיקה זו שימשה בעיקר להערכת תאי ניצן גפיים מזודרמליים; עם זאת, ניתן ליישם אותו על תאי גזע או אב אחרים מאורגניזמים אחרים.

מבוא

איבר בעלי החוליות הוא מודל אימתני לחקר התמיינות תאים, התפשטות תאים, מוות של תאים, היווצרות תבניות ומורפוגנזה ^1,2. במהלך ההתפתחות, הגפיים מגיחות כבליטות מהתאים שמקורם במזודרם צלחת צידית¹. ניצני הגפיים מורכבים מליבה מרכזית של תאים מזודרמליים המכוסים על ידי אקטודרם. מהמבנה המוקדם הזה מגיח איבר שלם ומעוצב היטב. לאחר הופעת ניצן הגפיים, מזהים שלושה צירים: (1) הציר הפרוקסימו-דיסטלי ([PD] כתף לאצבעות), (2) ציר הגב-גחון ([DV] מגב היד לכף היד), ו-(3) האגודל הקדמי-אחורי ([AP] אגודל לאצבע). הציר הפרוקסימלי-דיסטלי תלוי ברכס האקטודרמלי האפי (AER), אקטודרם מיוחד הממוקם בקצה הדיסטלי של ניצן הגפיים. ה-AER נדרש לצמיחה החוצה, לתחזוקת הישרדות, להתרבות ולמצב הלא מובחן של תאים הקולטים אותות ^2,3. מצד שני, אזור הפעילות המקטבת (ZPA) שולט בתבנית האנטרופוסטריורית⁴, בעוד שהגב והאקטודרם שולטים בתבנית הגבית והאקטודרמית ^7,8. אינטגרציה של דפוסים תלת-ממדיים מרמזת על הצלבה מורכבת בין שלושת הצירים הללו⁵. למרות הבנת המסלול המולקולרי במהלך התפתחות הגפיים, שאלות פתוחות על המנגנונים השולטים בדפוסים ובצמיחה נכונה ליצירת גפה שלמה נותרות ללא מענה.

אדגר צווילינג פיתח את מערכת הגפיים הרקומביננטיות (RL) בשנת 1964 כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים מזנכימליים של הגפיים לבין האקטודרם בפיתוח גפיים⁶. מערכת ה-RL מרכיבה את מזודרם ניצני הגפיים המנותק לתוך האקטודרם העוברי של הגפיים כדי להשתיל אותו בחלק הגבי של עובר האפרוח התורם. האותות המסופקים על ידי האקטודרם משרים ביטוי של גנים של התמיינות וגנים דפוסים באופן מרחבי-טמפורלי, ובכך גורמים להיווצרות מבנה דמוי גפיים שיכול לשחזר את תוכניות התאים המתרחשות במהלך התפתחות הגפיים ^7,8,9.

מודל RL הוא בעל ערך להבנת התכונות של רכיבי הגפיים והאינטראקציה בין תאים מזודרמליים ואקטודרמליים⁶. ניתן להגדיר RL כמבנה דמוי גפיים שנוצר על ידי התאים המזודרמליים של ניצני הגפיים המורכבים או רקומבינציה בתוך כיסוי אקטודרמלי⁶. המורפוגנזה של ה-RL תלויה במאפיינים של התאים המזודרמליים (או סוגים אחרים) שיגיבו לאותות התבנית האקטודרמלית. אחד היתרונות של מערכת ניסיונית זו הוא הרבגוניות שלה. מאפיין זה מאפשר יצירת שילובים מרובים על ידי שינוי המקור של תאים מזודרמליים, כגון תאים משלבי התפתחות שונים, ממיקומים שונים לאורך הגפה, או תאים שלמים (לא מובחנים) או מצטברים מחדש ^7,8,9,10. דוגמה נוספת היא היכולת להשיג את האקטודרם העוברי ממינים שאינם עוף, למשל, צב¹¹, שליו או עכבר¹².

במובן זה, טכניקת RL מסייעת לחקור את התפתחות הגפיים ואת האינטראקציות בין תאים מזנכימליים ואקטודרמליים של הגפיים מנקודת מבט אבולוציונית. לטכניקה זו יש גם פוטנציאל גדול לניתוח היכולת של מקורות שונים של תאי אב להתמיין למבנה דמוי גפיים על ידי ניצול האותות המסופקים על ידי האקטודרם העוברי 12,13,14. בניגוד לתרביות במבחנה, ה-RL מאפשר להעריך את ההתמיינות והפוטנציאל המורפוגנטי של אוכלוסיית התאים על ידי פירוש אותות עובריים מאיבר^{מתפתח 9,15}.

בפרוטוקול זה, מדריך שלב אחר שלב לביצוע RL מוצלח עם תאי ניצן גפיים מזודרמליים מצטברים מחדש מסופק, ובכך פותח את האפשרות של התאמת פרוטוקול זה עם מקורות שונים של תאים מצטברים מחדש או אפילו מקורות אקטודרם שונים.

פרוטוקול

מחקר זה נסקר ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון לביומדיקה של המכון לביומדיקה של Investigaciones, אוניברסיטת נסיונל אוטונומה דה מקסיקו (UNAM, מקסיקו סיטי, מקסיקו). תרשים זרימה סכמטי של השלבים הכלליים של פרוטוקול זה מוצג באיור 1A.

1. דגירה עוברית וקביעת כדאיות

1. דגירה של ביצי עוף מופרות בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של כ-60% במשך כשלושה וחצי ימים עד שהגיעו לשלב 22 HH (על פי המילטון והמבורגר, 1951)¹⁶.
   הערה: ניתן לאחסן ביצי עוף מופרות טריות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
   1. כדי לדגום את הביציות המופריות, מניחים את הביצים בצורה אנכית עם הצד המחודד למטה לתוך האינקובטור הלח. סובבו את הביציות במהלך הדגירה כפי שנדרש כדי למנוע מהעובר המתפתח להיצמד לקרום הקליפה.
      הערה: ניתן להשיג ביצי תרנגולות מופרות מחוות מקומיות. ביצי תרנגולת מופרות של הלגהורן הלבן משמשות בדרך כלל למניעת פיגמנטציה של הנוצות בעוברים מאוחרים. שקול לדוגר מספיק ביציות בנפרד כדי לקבל שלושה מבנים: (1) תאים מזודרמליים של הגפיים, (2) אקטודרמים של הגפיים, ו-(3) עוברים תורמים כדי להשתיל את ה-RL.
2. לאחר שלושה וחצי ימים של דגירה, מוציאים את הביצים מהאינקובטור, מבשלים עם 70% אתנול, ומאפשרים ייבוש באוויר.
3. זהה עוברים מתפתחים המנקים את הביצית כדי לתצפת על כלי הדם ולאתר את העובר. השליכו ביציות שאין להן עובר.
   הערה: בשלב זה, להפיץ את הביצים כדי להשיג תאים מזודרמליים, אקטודרמים, ואת המארחים עבור RL.

2. השגת תאים מזודרמליים של הגפיים למילוי אקטודרמים

הערה: לפני תחילת המניפולציות, מומלץ מאוד לחטא את אזור העבודה, את המיקרוסקופים, ואת כל האינסטרופלקסים על ידי סחיטת תמיסת אתנול 70%.

1. הקש על הקצה הקהה של קליפת הביצה עם קצה מלקחיים קהים כדי לפתוח חלון ולהסיר כ -1 ס"מ על 1 ס"מ של הקליפה באמצעות המלקחיים.
2. העבירו ביצים למחזיק פלסטיק או קרטון והניחו אותן בזו אחר זו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. זהה את קרום האוויר ולאחר מכן הסר אותו על ידי בחירת חור קטן שבו לא נמצאים כלי דם. משוך אזור זה בעזרת מלקחיים כירורגיים עדינים.
   הערה: ניתן לזהות את קרום האוויר כממברנה הלבנה והאטומה שנצפתה מיד לאחר חלון הביצה.
   1. יש להסיר כל חתיכה קטנה של קליפת ביצה שעלולה לבוא במגע עם העובר.
      הערה: ודא שהעוברים נמצאים בשלב של 22 HH לפני תחילת הפרוטוקול. ניתן להחזיר עוברים בשלבים מוקדמים יותר לחממה לאחר איטום חלון קליפת הביצה בנייר דבק.
3. פתחו את שק מי השפיר לחלוטין על ידי קריעת השפיר באמצעות מלקחיים כירורגיים עדינים (ראו טבלת חומרים).
   הערה: ניתן לזהות את אמניון כממברנה שקופה המכסה מקרוב את העובר ומלאה במי שפיר.
4. מוציאים בזהירות את העובר מהביצית באמצעות זוג מלקחיים קהים ולאחר מכן מעבירים לתוך צלחת פטרי סטרילית המכילה תמיסת מלח דחוסה בפוספט קר כקרח (1x PBS). חזור על שלב זה עבור הביצים הנותרות. קחו בחשבון שרק כ-8-10 עוברים מספיקים כדי להשיג את התאים המזודרמליים.
5. שטפו את העוברים פעם אחת ב-1x PBS קר כקרח, ובעזרת סטריאומיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים), משכו את כל הממברנות הנותרות. אתרו את הניצנים האחוריים.
   הערה: ניצני גפיים הם מבנים מעוגלים הממוקמים לאורך הציר הקדמי-אחורי של העובר כבליטות מהאגף. האחוריים ממוקמים באופן אחורי יותר מאשר הקדמיים.
6. שמרו על העוברים ב-PBS נקי 1x, ובאמצעות זוג מלקחיים כירורגיים עדינים, צלפו כל ניצן אחורי לאורך. חותכים את הניצן קרוב מאוד לאגף העובר כדי לנתח את כל הניצנים האחוריים. חזור על שלב זה עם העוברים הנותרים.
7. השתמש בפיפטת העברת פלסטיק כדי להעביר את ניצני הגפיים לצינור מיקרוצנטריפוג' ריק של 1.5 מ"ל.
8. השתמש בקצה פיפטה כדי להסיר כל עודף של 1x PBS ולהחליף PBS ב- 500 μL של תמיסת טריפסין של 0.5% (ראה טבלת חומרים). דגירה של ניצני גפיים בחסימה תרמית למשך 7 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
9. הסר את תמיסת הטריפסין והחלף אותה ב- 500 μL של קולגן מסוג IV ב- 2 מ"ג / מ"ל בתמיסת מלח מאוזנת של Hanks (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן דגירה אותו במחסום תרמי בטמפרטורה של 37 °C (37 °C ) למשך 8 דקות.
   הערה: הדגירה של טריפסין מנתקת מעט את האקטודרמים, בעוד שקולגן מפרק תאים מזודרמליים.
10. לאחר הדגירה, יש להסיר כמה שיותר קולגן ולהחליף אותו ב-1 מ"ל של מדיום הגלוקוז הבינוני-גבוה (DMEM-HG) של Dulbecco עם תוספת של 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי להשבית את האנזימים. פיפטה את התערובת בעדינות ~ 10 פעמים.
11. סנן את ההשעיה המכילה את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להשאיר מאחור את האקטודרמים.
    הערה: סינון יסיר גם את כל ניצני הגפיים הלא מעוכלים, וישאיר אחריהם השעיה של תאים בודדים.
12. לאחר הסינון, פיפט את המתלים שוב 5-10 פעמים וצנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשליך את supernatant.
13. השתמשו ב-1 מ"ל של DMEM-HG בתוספת 10% FBS כדי לשטוף את עודפי הקולגן. צנטריפוגה את המתלים ב 200 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
14. יש להשליך את המדיום בזהירות על ידי צנרת ולאחר מכן להחליף אותו ב-1 מ"ל של DMEM-HG טרי בתוספת 10% FBS מבלי להפריע לתאים בתחתית הצינור.
15. אפשר לתאים ליצור גלולה קומפקטית (regregate) לאחר דגירה שלהם במשך 1-1.5 שעות ב 37 °C במחסום thermoblock.
    הערה: בעוד שתאים מזודרמליים יוצרים את הכדור, נוח להשיג את האקטודרמים של הגפיים.

3. קבלת האקטודרמים של הגפיים

1. חזור על שלבים 1-6 מסעיף 2 בנפרד עם 22 העוברים האחרים של עוף HH שנבחרו כדי לקבל את האקטודרמים.
   הערה: מספר העוברים למטרה זו פרופורציונלי למספר הסופי של ה- RL הרצוי. יחס של 2:1 אקטודרמס-RL מתאים.
2. לאחר השגת ניצני הניצנים האחוריים, השתמש בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר אותם לצינור מיקרו-סנטריפוג' ריק. הסר כל עודף 1x PBS והחלף אותו ב- 500 μL של 0.5% טריפסין ב- PBS סטרילי 1x. דגירה של התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במחסום תרמי.
3. לאחר העיכול האנזימטי, מעבירים את תמיסת הטריפסין המכילה את ניצני הגפיים לצלחת פטרי סטרילית.
4. הסר את הטריפסין העודף ככל האפשר באמצעות מיקרופיפט; להציף את צלחת פטרי עם 1x PBS קר כקרח בתוספת 10% של FBS עד שכל ניצני הגפיים מכוסים.
   הערה: ניתן להחליף את FBS בסרום לסוסים.
5. זהה את ניצני הגפיים מתחת לסטריאומיקרוסקופ; לזהות את האקטודרם כממברנה שקופה מנותקת מעט מהתאים המזודרמליים של הגפיים (איור 1B).
6. יש להחזיק את הקצה הפרוקסימלי ביותר של ניצן הגפיים בעזרת מלקחיים כירורגיים עדינים תוך ניתוק והפרדה זהירים של שכבת האקטודרם באמצעות המלקחיים האחרים.
   הערה: השגת האקטודרמים עלולה להיות קשה עקב התגוששות של תאים מזודרמליים והצמדתם לאקטודרמים, ובכך לגרום להם להפוך לדביקים. מומלץ להשליך כל הזמן את התאים המזודרמליים כדי לשמור רק על האקטודרמים בצלחת פטרי.
7. שמור על האקטודרמים בתמיסת 1x PBS-10% FBS קר כקרח.
   הערה: ניתן לאחסן אקטודרמים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרה שהמזודרם הצבור מחדש אינו מוכן. עם זאת, עדיף לתאם את זמן הדגירה של הכדור עם קבלת ectodermal.

4. הרכבת תאים מזודרמליים בתוך הכיסוי האקטודרמלי

הערה: לשם כך, יש צורך באקטודרמים ריקים בצלחת פטרי עם תמיסת PBS-10% FBS סטרילית המכילה כדור שנוצר של תאים מזודרמליים.

1. לאחר יצירת הכדור (ראה סעיף 2), יש להשליך ~600 μL של המדיום מהצינור על ידי צנרת.
2. נתקו בזהירות את הכדור מלמטה באמצעות קצה פיפטה ומבלי לרסק או להרוס אותו.
3. כאשר הכדור מנותק לחלוטין מתחתית הצינור, סובבו את הצינור הפוך כדי להעביר את הכדור לתוך צלחת הפטרי המכילה את האקטודרמים הריקים (איור 1C).
4. חותכים חתיכה קטנה מהכדור בעזרת זוג מלקחיים כירורגיים עדינים ומניחים אותה קרוב ככל האפשר לאקטודרם.
5. כאילו מדובר בשקית, פתחו את האקטודרם עם המלקחיים הכירורגיים, והניחו את פיסת הכדור בצורה הדוקה ככל האפשר לתוך הכיסוי האקטודרמלי. חזור על שלב זה לקבלת RLs רבים ככל הרצוי (איור 1D).
   הערה: חתכו את החלקים של הכדור אחד אחד, ומלאו את האקטודרמים כדי לשמור על ניקיון תמיסת 1x PBS-10% FBS. גודל הכדור צריך להתאים לכל אקטודרם.
6. אפשרו לאקטודרם ולמזודרם להחלים יחד למשך כ-30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להשתיל אותם בעובר המארח. השליכו את האקטודרם והמזודרם שאינם בשימוש.

5. השתלת האקטודרם הממולא לעובר מארח
 

הערה: לפני השתלת האקטודרמים, ארגנו שני סטריאומיקרוסקופים זה ליד זה על ספסל, אחד למניפולציה של עוברים והשתלת RL. השני הוא לשמירה על האקטודרמים המלאים מוכנים להעברה לעובר.

1. בחר את מספר הביצים הרצויות כדי להשתיל את האקטודרמים המלאים.
2. באמצעות קצה של מלקחיים קהים, הקש על קליפת הביצה של 22 העוברים המארחים HH כדי לפתוח חלון. זהה את קרום האוויר, באמצעות זוג מלקחיים כירורגיים עדינים, הסר אותו לחלוטין.
3. פתחו את שק מי השפיר ליד הפתח הקדמי כדי לחשוף את האגף הימני של העובר. פתח רק את הסכום הדרוש לביצוע ההליך.
4. מונחה על ידי תנוחת הפורמלימב, בצע גירוד פצע עם מחט טונגסטן (ראה טבלת חומרים) לאורך 2-3 סומיטים, תוך פגיעה קלה במזודרם עד שהוא מדמם.
5. מעבירים בנפרד אקטודרם מלא (RL) לתוך עובר האפרוח ומניחים את בסיס הגפה הרקומביננטית מעל הפצע הסומיט.
   הערה: העברת RL יכולה להיעשות עם פיפטה מפלסטיק או עם סכין חריץ זוויתית.
6. תקן את ה-RL בצורה נכונה עם שתי חתיכות של חוט פלדיום בקוטר 0.025 מ"מ ובאורך 0.5-1 מ"מ (ראה טבלת חומרים). יישרו את הבסיס של ה-RL עם הפצע כדי להבטיח שהוא יהיה מחובר לאגף של העובר המארח וייצור כלי דם (איור 1E).
7. אטמו את החלון בנייר דבק, והחזירו את הביצה לחממה. לאסוף את העוברים בנקודות הזמן הרצויות לניתוח.

תוצאות

זיהוי איבר רקומביננטי בעל ביצועים טובים
לאחר ההשתלה, העוברים שעברו מניפולציה הוחזרו לחממה כדי לאפשר ל-RL להתפתח. זמן הדגירה תואם את דרישות הניסוי. עם זאת, ניתן להבחין בקלות בין RL לאחר 12 שעות של השתלה. כדי לקבוע אם ההשתלה הייתה מספקת, ה-RL נצפתה כבליטה שהייתה מחוברת היטב לדופן המזודרמלית של העובר התורם (איור 2A). להיפך, בין אם הכדאיות של התא ו/או השתל נכשלו, ה-RL נותק מהדופן המזודרמלית או הציג מורפולוגיה גסה (איור 2B).

דיון

באופן כללי, ניתן לחלק את פרוטוקול RL לחמישה שלבים: (1) דגירה של עוברים, (2) השגת תאים מזודרמליים של הגפיים כדי למלא את האקטודרמים, (3) קבלת האקטודרמים, (4) הרכבת תאים מזודרמליים בתוך הכיסויים האקטודרמליים, ו-(5) השתלת האקטודרמים המלאים בעוברים המארחים. המגבלה העיקרית של טכניקת RL היא הפרוטוקול הארוך והמפורט, שיש בו נקודות קריטיות רבות הדורשות סבלנות כדי לבצע כראוי. כדי להשלים את הפרוטוקול בהצלחה, יש לזהות רגעים קריטיים. במהלך רכישת תאים מזודרמליים, השלמות והכדאיות של התאים הן חיוניות. מוות תאי ימנע התפתחות תקינה של RL. ב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
סכין חריץ זוויתי	Alcon	2.75 מ"מ DB
מלקחיים קהים	Fine Science Tools	11052-10
קולגנאז מסוג IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
חממת ביצים	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
סרום בקר עוברי	Gibco	16000069
מלקחיים כירורגיים עדינים	Fine Science Tools	9115-10
Hanks תמיסת מלח מאוזנת	Sigma	H6648
מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	5417R
Micropipet	NA
NA חוט פלדיום	GoodFellow	7440 05-3
צלחת פטרי	קן	705001
פיפטה	crmglobe	PF1016
סטריאומיקרוסקופ	Zeiss	Stemi DV4
קלטת	NA	NA
טריפסין חזיר	Merck	9002 07-7
מחט טונגסטן	GoodFellow	E74-15096/01