פלטפורמת גילוי חזקה לזיהוי מתווכים חדשים של גרורות מלנומה

סיכום

מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.

תקציר

גרורות הן תהליך מורכב, הדורש מהתאים להתגבר על מחסומים שרק מודלים באופן חלקי על ידי בדיקות חוץ גופיות . זרימת עבודה שיטתית הוקמה תוך שימוש במודלים חזקים וניתנים לשחזור in vivo ובשיטות סטנדרטיות לזיהוי שחקנים חדשים בגרורות מלנומה. גישה זו מאפשרת הסקה של נתונים בשלבים ניסיוניים ספציפיים כדי לאפיין במדויק את תפקידו של הגן בגרורות. מודלים נקבעים על ידי החדרת תאי מלנומה מהונדסים גנטית באמצעות זריקות תוך-לבביות, תוך-עוריות או תת-עוריות לעכברים, ולאחר מכן ניטור באמצעות הדמיית in vivo סדרתית. ברגע שמגיעים לנקודות קצה שהוקמו מראש, גידולים ראשוניים ו/או איברים נושאי גרורות נקטפים ומעובדים לניתוחים שונים. ניתן למיין את תאי הגידול ולהכפיף אותם לכל אחת מכמה פלטפורמות 'אומיקה', כולל ריצוף RNA חד-תאי. איברים עוברים הדמיה וניתוחים אימונוהיסטופתולוגיים כדי לכמת את הנטל הכולל של גרורות ולמפות את מיקומן האנטומי הספציפי. ניתן לאמץ את הצינור הממוטב הזה, הכולל פרוטוקולים סטנדרטיים לחריטה, ניטור, קצירת רקמות, עיבוד וניתוח, עבור תרביות קצרות טווח שמקורן בחולה וקווי תאים אנושיים ומורין מבוססים של סוגי סרטן מוצקים שונים.

מבוא

התמותה הגבוהה הקשורה למלנומה גרורתית בשילוב עם שכיחות גוברת של מלנומה ברחבי העולם¹ (עלייה מוערכת של 7.86% עד 2025) קוראים לגישות טיפול חדשות. ההתקדמות בגילוי מטרות תלויה במודלים הניתנים לשחזור של גרורות, תהליך מורכב ביותר. לאורך השלבים של המפל הגרורתי, תאי מלנומה חייבים להתגבר על אינספור מחסומים כדי להשיג התחמקות ממערכת החיסון והתיישבות של רקמות רחוקות². העמידות ויכולת ההסתגלות של תאי מלנומה נובעים מגורמים רבים, כולל נטל המוטציה הגנטית הגבוהה שלהם³ ומקורם העצבי, המעניקים פלסטיות פנוטיפית חיונית ^3,4,5. בכל שלב, תוכניות שעתוק מאפשרות לתאי מלנומה גרורתיים לעבור ממצב אחד למשנהו בהתבסס על רמזים מההצלבה עם המיקרו-סביבה, הכוללת את מערכת החיסון⁶, את הסביבה החוץ-תאית ^7,8 ואת הארכיטקטורה התאית של מחסומים פיזיים⁹ שאיתם הם באים במגע. לדוגמה, תאי מלנומה חומקים ממעקב חיסוני על ידי הפחתת הוויסות של הביטוי של גורמים חשובים המופרשים על ידי גידולים המופרשים על-ידי מערכת החיסון⁶.

מחקרים מתארים "נישה פרמטסטטית", שבמסגרתה תאי מלנומה מפרישים כימוקינים וציטוקינים כדי להכין את איבר ה"מטרה" המרוחק לגרורות¹⁰. ממצאים אלה מעלים שאלות חשובות לגבי טרופיזם האיברים של תאי מלנומה גרורתיים והדרך האנטומית שהם נוקטים כדי לגשת לרקמות רחוקות. לאחר התפשטות, ידוע שתאי מלנומה שולחים גרורות באמצעות לימפה (התפשטות לימפטית) וכלי דם (התפשטות המטוגנית)^2,11. בעוד שרוב החולים נמצאים עם מחלה מקומית, תת-קבוצה קטנה של מקרים מציגה מחלה גרורתית מרוחקת וללא הפצה לימפטית (מעורבות שלילית של בלוטות הלימפה)¹¹, מה שמרמז על קיומם של מסלולים גרורתיים חלופיים למלנומה.

כאשר הם מתיישבים באתר גרורתי, תאי מלנומה עוברים התאמות אפיגנטיות ומטבוליות^12,13. כדי לגשת לתאים חדשים ופלשו אליהם, תאי מלנומה משתמשים בפרוטאזות¹⁴ ובשינויי שלד^11,15, המאפשרים להם לחצות ולגדול במיקומם החדש. הקושי להתמקד בתאי מלנומה שוכן במורכבות ובמספר של התאמות כאלה; לפיכך, על התחום לעשות מאמצים ליצור מחדש באופן ניסיוני כמה שיותר שלבים והתאמות. למרות ההתקדמות הרבה במבחנים במבחנה כגון אורגנואידים ותרביות תלת-ממדיות ^16,17, מודלים אלה רק משחזרים באופן חלקי את המפל הגרורתי in vivo.

מודלים של מורין הראו ערך על ידי יצירת איזון בין יכולת שכפול, היתכנות טכנית וסימולציה של מחלות אנושיות. באופן תוך-שרירי, אורתטופי והטרוטופי מושתל בתאי מלנומה מקסנוגרפטים שמקורם בחולה או מתרביות קצרות טווח לעכברים הסובלים מפגיעה במערכת החיסון או מהאנישה, מייצגים את עמוד השדרה של גילוי המטרה במלנומה גרורתית. עם זאת, מערכות אלה חסרות לעתים קרובות מגבלה ביולוגית מכרעת על גרורות: מערכת החיסון. מודלים של גרורות מלנומה סינגנית בעלי אילוץ זה הם נדירים יחסית בתחום. מערכות אלה, שפותחו בעכברים מדוכאי חיסון, כולל B16-F10¹⁸, משפחת YUMM של קווי תאים¹⁹, SM1²⁰, D4M3²¹, RIM3²² או לאחרונה, RMS²³ ו- M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)²⁴ קווי תאי מלנומה, מאפשרות לחקור את התפקיד המורכב של התגובה החיסונית של המארח בהתקדמות מלנומה.

כאן מוצג צינור לזיהוי מטרות של גרורות מלנומה. כאשר מערכי נתונים 'אומיים' הולכים וגדלים נוצרים מקבוצות חולי מלנומה, אנו מניחים שמחקרים המחזיקים בהבטחה הקלינית הגדולה ביותר הם אלה הנובעים משילוב ביג דאטה, מה שמוביל לחקירה פונקציונלית ומכניסטית קפדנית^של 25,26,27,28. על ידי שימוש במודלים של עכברים כדי לחקור מטרות פוטנציאליות בתהליך הגרורתי, ניתן להסביר אירועים ספציפיים ל-in vivo ואינטראקציות רקמה, ובכך להגדיל את ההסתברות לתרגום קליני. מתוארות שיטות רבות לכימות העומס הגרורתי, המספקות נתונים משלימים על התוצאות של כל ניסוי נתון. פרוטוקול לבידוד של תאים בודדים מגידולים באיברים שונים מתואר כדי לסייע באפיון בלתי מוטה של ביטוי גנים בתאים גרורתיים, שעשוי להקדים ריצוף RNA חד-תאי או בתפזורת.

פרוטוקול

הערה: נהלי בעלי החיים המעורבים בפרוטוקול הבא אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ניו יורק (IACUC). כל ההליכים מתבצעים במתקנים שאושרו על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (AAALAC). איור 1 מתאר את הגישה הניסויית הכללית.

1. תרבויות מלנומה שמקורה בחולה לטווח קצר (STCs)

1. הניחו את הרקמה בצלחת פטרי של 60 מ"מ עם 1 מ"ל של RPMI מלא (RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט, תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 1x MEM, ופניצילין (100 יחב"ל/מ"ל)/סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל)).
   הערה: כדי להגדיל את היחס בין תאי הגידול, במידת הצורך, לנתח ולהסיר את הרקמה המקיפה את הגידול בצלחת פטרי, תחת מיקרוסקופ, באמצעות כלי ניתוח סטריליים.
2. חותכים דק את הרקמה הטרייה באמצעות סכיני גילוח מעוקרים לקוביות 1-2 מ"מ. הוסיפו 4 מ"ל של RPMI שלם ופיפטה את תכולת הצלחת למעלה ולמטה 5-10 פעמים עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
3. מעבירים את תרחיף התא לצינור חרוטי פוליפרופילן של 15 מ"ל ומסובבים את התאים כלפי מטה (180 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס). לשאוף את הסופרנטנט, להחיות את גלולת התא ב 1 מ"ל של תווך טרי, ולהעביר את ההשעיה לבקבוקון תרבית רקמה 25 ס"מ² .
4. כדי לסייע לשברי הרקמה להיצמד לתחתית, הניחו את הבקבוקון מוטה בזווית של 20°-30° באינקובטור תרביות רקמה ב-37°C, 5% CO₂ למשך 20 דקות.
5. הניחו את הבקבוקון שטוח כדי לאפשר למדיום לכסות את הרקמה, ובדקו את מצב התרבית מדי יום. לפצל את התאים כאשר הם מגיעים ל-90-100% מפגש. שמור על תרבויות קצרות טווח במספר מעבר "נמוך".
   הערה: STCs יוקמו כחודשיים לאחר בידוד ותרבית התאים, אם כי ציר הזמן בפועל משתנה בין דגימות וסוגי גידולים. לאחר 10 עד 14 מעברים, קווי התאים מגיעים ל-100% טוהר, ומכילים רק תאי מלנומה²⁹. סף מספר המעבר נקבע באופן אמפירי על ידי התבוננות בשינויים במורפולוגיה של התאים, הכפלת הזמן וההתנהגות in vivo. כדי לשמר את ההטרוגניות ומאפיינים אחרים של גידול האב, אין לפצל את התאים יותר מ 1:5.
6. עם הקמת STC ועם כל מודל קו תאים שיש להזריק לבעלי חיים כמתואר בשלבים הבאים, מתמרים תאים עם כתב.
   הערה: תג פלואורסצנטי (לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)), לדוגמה, מאפשר הדמיה ומיון של תאי גידול על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS). לוציפראז מאפשר הדמיית in vivo bioluminescence, כלי שימושי לניטור התקדמות הניסוי (סעיף 4).

איור 1: סכמטי הממחיש את זרימת העבודה המתוארת, החל משילוב נתוני מטופלים ועד ליצירה וניתוח של נתוני in vivo מעכברים. קיצורים: LOF = אובדן תפקוד; GOF = רווח של פונקציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. השתלת קסנוגרפט

הערה: ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן נערכים בעכברים בעלי מערכת חיסונית מסתגלת ומולדת לקויה, NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) עכברים; או בעכברים שאין להם חסינות מסתגלת בלבד, כגון העכברים האתימיים/עירומים (NU/J) הסובלים ממחסור בתאי T. בעלי חיים הם ממין זכר, 8 עד 10 שבועות של גיל. נקבות מפגינות לעתים קרובות שכיחות גבוהה של גרורות גונדליות עם הזרקה תוך-לבבית של תאי הגידול, מה שמפחית את הישרדותן.

1. עבור זריקות תת-עוריות ותוך-עוריות, הכינו תרחיף של 1:1 על-ידי ערבוב חלק אחד של תאים התלויים ב-1x DPBS של Dulbecco עם מצע מטריצה חוץ-תאי מופשר של Dulbecco (DPBS) עם מצע מטריצה חוץ-תאית מופשר של חלק אחד (EMS), והמשיכו על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. עבור זריקות תוך-וסקולריות (תוך-לבביות, תוך-פחמיות, רטרו-מסלוליות, זנב,או טחול), השעו את התאים ב-DPBS בלבד.
   הערה: יש לשמור על נפח מתאים להזרקות תוך-עוריות נמוך ככל האפשר (30 μL). עבור זריקות תת עוריות, נפח ההזרקה יכול לעלות עד 150 μL, ועבור זריקות תוך-וסקולריות, עד 250 μL (בהתבסס על משקל החיה). הוסיפו לתרחיף התא הסופי נפח נוסף של 10-30% של ההזרקה, בהתבסס על כמות ההזרקה והמזרק המשמש כדי להסביר את הנפח המת בתוך קצה ההחלקה ואת זה של המחט (למשל, מזרק שחפת 1 מ"ל עם מחט 30 G, 25 מ"מ, בעל נפח מת של 100 μL).
2. ערכו פיילוט כדי לאפיין את התנהגות קווי התאים בשימוש ואת ציר הזמן של התקדמות הגידול in vivo. עבור זריקות תוך-עוריות, התחילו בהזרקת 1,000 עד 50,000 תאים/30 μL. עבור זריקות תת עוריות, התחל בהזרקת 10,000 עד 2 × 10⁶ תאים / 150 μL. עבור זריקות תוך-וסקולריות (תוך-לבביות, תוך-קרוטידיות, רטרו-מסלוליות ו-splenic), התחילו בהזרקת 50,000 תאים/150 μL.
   הערה: הזרקות תוך-וסקולריות גורמות לבעלי החיים נטייה לאירועים אמבוליים, בין אם על ידי החדרת אוויר למערכת הדם או על ידי שימוש במספר מוגזם של תאים החותמים את הכלים הקטנים. ערבבו היטב את מתלי התא כדי למנוע גושים. יש להכין את המזרק לפני העמסת מתלי התא. הסר את בועות האוויר בתוך המזרק. יש לשמור את ההשעיה/מזרקים של התא על הקרח עד לזמן הטעינה וההזרקה.
3. לנהל הרדמה על ידי שאיפה. הגדר את וסת רמת החמצן בין 1-2 ליטר לדקה. מקם את החיה בתא האינדוקציה עם מכשיר האידוי איזופלורן שנקבע על 2.5-5% לאינדוקציה ו-1.5-3% לתחזוקה.
   הערה: עקוב אחר הנשימה וקצב הלב של החיה בשלב האינדוקציה בהרדמה. אין להשאיר את החיה ללא השגחה. אין לנטר יותר מבעל חיים אחד בו זמנית. טיטר את כמות ההרדמה למשקל החיה.
4. הזיזו את החיה מתא האינדוקציה לתוך חרוט האף. החל משחה פטרולאטום אופתלמית סטרילית על עיני החיה כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההליך.
5. לגלח את אתר ההליך עם סכין גילוח ישר מוטה בזווית של 30°. נקה את העור של אזור ההליך עם 70% ספוגיות אלכוהול איזופרופיל. לפני כל צעדים נוספים, להעריך עבור רמה מספקת של הרדמה על ידי רפלקס הדוושה.
6. עבור זריקות תוך עוריות, בצע את ההליך כולו בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על מצבים אספטיים.
   1. להרדים ולגלח את החיה כמתואר בשלבים 2.3-2.5.
   2. תפסו את העור לאחור והחזירו אותו לאחור כנגד מסלול דקירה של המחט. באמצעות מחט מזרק אינסולין 31 גרם, באורך 6 מ"מ, המוחזקת בזווית חדה, נקבו בעדינות את העור כאשר השיפוי פונה כלפי מעלה.
   3. הרגישו את שחרור הלחץ בקצה המחט. יש להתקדם בעדינות כדי להישאר בתוך התא התוך-עורי ולא לעבור דרך כל עומק העור אל תוך התת-תת-תא. חיוני: אם מחליקים לתוך החלל התת עורי, מוציאים את המחט, משנים את אזור ההזרקה ומכניסים מחדש את המחט. הזריקו את כל הנפח (30 μL) של תרחיף התא באיטיות עד שנצפה צפצופים בצפצופים בצורת כיפה.
      הערה: נפחי הזרקה נמוכים יגרמו לפחות כריתה של שכבות העור ופחות עיוותים אדריכליים.
   4. שמור את המחט פנימה וספור עד 5.
      הערה: EMS הופך צמיג בטמפרטורת הגוף, ומסייע במניעת זרימה אחורית דרך פצע ניקוב המחט.
   5. מוציאים את המחט ומכניסים את החיה לכלוב על כרית חמה כדי להתאושש. החזירו את החיה לכלוב הוויבריום לאחר שחזרה להכרה, כשהיא קשוחה ואמבולטורית.
      הערה: עקוב אחר החיה באופן רציף במהלך כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה. אין להשאיר את החיה ללא השגחה או לפקח על יותר מבעל חיים אחד בו זמנית.
   6. עקוב אחר התקדמות צמיחת הגידול, הירידה במשקל ומצב הבריאות הכללי בשיתוף עם הצוות הווטרינרי מדי יום בשלב הגדילה הראשוני ובאינטנסיביות רבה יותר, במידת הצורך, לאחר שבעלי חיים מתחילים לרדת במשקל. במהלך מפגשי ניטור אלה: שקלו את בעלי החיים והתוו תרשים לניטור ירידה במשקל, ובדקו סימנים של כיב גידולי, נוירולוגי, לוקומוטור ו/או סימנים התנהגותיים (עייפות, חוסר טיפוח, צריכת מזון או מים נמוכה).
      הערה: המתת החסד את בעלי החיים מיד לאחר התבוננות בסימנים של מחלה מתקדמת (יותר מ -20% ירידה במשקל, ציון מצב גוף של <2, רמות פעילות מופחתות ביותר, שיתוק או התקפים). השתמש בשיטת המתת החסד שאושרה על ידי ה- IACUC של המוסד (לדוגמה, תא CO₂ שולחני אוטומטי משמש לחשיפת בעלי החיים ל- CO₂ למשך 15 דקות ואחריו שיטה משנית של המתת חסד, או פריקה של צוואר הרחם, עריפת ראש או pneumothorax המושרה באופן דו-צדדי על ידי חתך הצלעות).
   7. קח מדידות עם קליפרים והשתמש בממדי האורך (L) והרוחב (W) של הגידול כדי לחשב את הנפח (V) עם הנוסחה:
      
7. עבור זריקות תת עוריות:
   1. בצע את ההליך כולו בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים אספטיים ^26,27.
   2. להרדים ולגלח את החיה כמתואר בשלבים 2.3-2.5.
   3. באמצעות מחט מזרק אינסולין של 28 G עד 31 G, באורך 6 מ"מ, המוחזקת בזווית חדה, נקבו בעדינות את העור כאשר השיפוף פונה כלפי מעלה. הרגישו את שחרור הלחץ בקצה המחט פעמיים תוך כדי מעבר דרך האפידרמיס, הדרמיס וההיפודרמיס.
      הערה: הפעם השנייה שבה מורגש שחרור לחץ בקצה המחט מצביעה על כך שהתא התת-עורי הושג.
   4. הזריקו את כל הנפח (30-150 μL) של תרחיף התא באיטיות עד שנצפה צפצופים מוארכים בצורת אליפסה. שמור את המחט פנימה וספור עד 5. ספירת עד 10 עבור נפחים גדולים יותר (יותר מ-50 μL).
      הערה: EMS הופך צמיג בטמפרטורת הגוף, ומסייע במניעת זרימה אחורית דרך פצע ניקוב המחט.
   5. מוציאים את המחט ומכניסים את החיה לכלוב על כרית חמה כדי להתאושש. החזירו את החיה לכלוב הוויבריום שלה לאחר שחזרה להכרה, כשהיא קשוחה ואמבולטורית.
      הערה: במהלך הניטור הפוסט-פרופורציונלי, יש לבחון סימנים של סיבוכים (קצב נשימה נמוך, דימום, התאוששות איטית) ולטפל בהם כראוי. אם לא נצפה שיפור, המשך להליכי המתת חסד הומאניים המתוארים בהערה של שלב 2.6.6.
   6. עקוב אחר החיה אחר גדילת הגידול, הירידה במשקל ומצב הבריאות הכללי כמתואר בשלבים 2.6.6.6-2.6.7.
8. עבור זריקות תוך לבביות:
   1. בצע את כל ההליך בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים אספטיים ^26,30.
   2. הרדמה את החיה כמתואר בשלבים 2.3-2.4.
   3. העבירו את החיה לפלטפורמה המחוממת של מכשיר האולטרסאונד והצמידו אותה באמצעות סרט היפואלרגני לחרוט האף.
   4. גילחו את בית החזה באמצעות סכין גילוח ישר המוטה בזווית של 30 מעלות. נקה את העור של אזור ההליך עם 3 יישומים של 10% povidone-יוד לסירוגין עם 3 יישומים של אלכוהול איזופרופיל.
   5. לפני כל צעדים נוספים, להעריך עבור רמה מספקת של הרדמה על ידי רפלקס הדוושה. יש למרוח ג'ל אולטרסאונד באתר ההליך.
   6. צלם את חלון הלב עם בדיקת האולטרסאונד. מקם את בדיקת האולטרסאונד באמצע בית החזה בצד שמאל של החיה כדי ללכוד חלון אופקי המכוון כדי לקבל תצוגת חתך (ציר קצר) של החדר השמאלי. כדי לוודא שהציר הארוך של הגשושית פונה כלפי מעלה, מקבעים את הגשושית בזווית של 50° ואת הפלטפורמה המחוממת בזווית של 20°. נעל את הבדיקה ואת מסגרת התמיכה במקומה.
   7. ציירו את מתלי התא תוך כדי עבודה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית במזרק שחפת 1 מ"ל עם מחט 30 G, 25 מ"מ. הסר את בועות האוויר במזרק.
      הערה: חשוב ליצור ולתחזק תרחיף חד-תאי בזמן שהתאים מעובדים ומוזרקים. הסרת בועות אוויר היא צעד חשוב כדי למנוע תסחיף אוויר. מערכת מחט מזרקים מצוידת היטב תמנע מקרי מוות הניתנים למניעה בקבוצת הניסוי. תמיד למשוך יותר נפח לתוך המזרק מאשר יוזרק. הנפח הנוסף יעזור להסיר את האוויר על ידי הזרקת חלק מתלי התא בחזרה לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   8. נעל את המזרק במזרק הסטריאוטקטי. בהנחיית אולטרסאונד, הקדמו את המחט דרך דופן בית החזה לחדר השמאלי של הלב. הזריקו את כל הנפח (100-250 μL) של תרחיף התא באיטיות.
   9. מוציאים את המחט ומכניסים את החיה לכלוב על כרית חמה כדי להתאושש. החזירו את החיה לכלוב הוויבריום שלה לאחר שחזרה להכרה, כשהיא קשוחה ואמבולטורית. עקוב אחר החיה אחר גדילת הגידול, הירידה במשקל ומצב הבריאות הכללי כמתואר בשלב 2.6.6.
9. עבור זריקות תוך-קרוטיד:
   1. בצע את ההליך כולו על משטח מחוטא כראוי כדי לסייע בשמירה על מצבים אספטיים³⁰.
   2. מרדימים את החיה בקוקטייל קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) בהזרקה תוך-צפקית עם מזרק אינסולין, מחט 28 גרם. החל משחה פטרולאטום אופתלמית סטרילית על עיני החיה כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההליך.
   3. גילחו את אזור הפרוצדורה באמצעות סכין גילוח ישר המוטה בזווית של 30°. לפני כל צעדים נוספים, להעריך עבור רמה מספקת של הרדמה על ידי רפלקס הדוושה.
   4. מניחים את החיה מתחת למיקרוסקופ סטריאופוני על כרית חימום. נקה את העור של אזור ההליך עם 3 יישומים של 10% povidone-יוד לסירוגין עם 3 יישומים של אלכוהול איזופרופיל.
   5. דון ציוד הגנה אישי סטרילי (PPE) וכפפות סטריליות. מכינים את השדה הסטרילי על ידי הנחת וילון סטרילי על גוף החיה.
      הערה: אם לווילון הסטרילי אין חור המתאים לגודל ולמיקום החתך, קפלו את הוילון לשניים והשתמשו במספריים של מצנבאום כדי לחתוך את חור הגודל המתאים באמצע הווילון הסטרילי.
   6. השתמשו באזמל או במספריים של איריס כדי להסיט את העור ממחצית הצוואר ועד עצם החזה. עם שני מלקחיים מיקרו-כירורגיים, לנתח באופן בוטה את 2 בלוטות הרוק התת-מנדיבולריות במישור קו האמצע. השתמש cautery חשמלי עבור hemostasis, במידת הצורך.
   7. נתחו את החיתולית המקיפה את עורק הצוואר המשותף (CCA) מהמנובריום לכיוון הביפורקציה והמשיכו באופן מדיאלי כדי לשחרר את הקיר האחורי של הצוואר החיצוני. קוצצים את עורק הצוואר החיצוני (ECA) באופן זמני לפני ההזרקה.
      הערה: כאשר מנתחים את היקף ה- CCA, יש להקפיד שלא לפגוע בעצב הוואגוס (שוכב לרוחב העורק).
   8. טען את מתלי התא במזרק של 1 מ"ל עם מחט 33 G, 15 מ"מ.
   9. מעבירים שתי ליגטורות 7-0 מתחת ל-CCA, ומבצעים קשר כלי רופף לכל אחת משתי הליגטורות. השתמש בתפס כלי לחץ של 5 מ"מ, 10 G וצמצם באופן זמני את ה- ECA. לקשור את הליגטורה הפרוקסימלית; לאחר מכן, קשרו את הליגטורה הדיסטלית באופן רופף (ליד הביפורקציה של ה-CCA). השתמש בלולאה הדיסטלית מאוחר יותר כדי לשלוט בדימום שלאחר ההזרקה.
   10. באמצעות המזרק עם מחט 33 G, 15 מ"מ, לנקב בעדינות את CCA עם שיפוע המחט פונה כלפי מעלה ובזווית חריפה. הזריקו את כל הנפח (50-150 μL) של תרחיף התא באיטיות.
   11. אחזה את הלולאה הדיסטלית עם המלקחיים והרם אותה תוך כדי הסרת המחט כדי לחסום את לומן ה- CCA ולעצור את הדימום. החליפו את המזרק עם מלקחיים מס' 7 של תכשיטנים וקשרו את הלולאה הדיסטלית.
   12. יש לזרוק קשר מכשיר נוסף על הליגטורה הדיסטלית ולהסיר את תפס כלי השיט מה-ECA. שלוט בשדה הניתוח לדימום וצרב את כל כלי הדם הדימומים לפני הסגירה. השתמש במכשיר הידוק 9 מ"מ כדי לסגור את עור החיה ולהניח את החיה על כרית חמה כדי להתאושש.
       הערה: הסר את הסיכות 7-10 ימים לאחר הניתוח.
   13. מתן תרופות משככות כאבים תת עורית-בופרנורפין (0.3 מ"ג/מ"ל) כל 12 שעות למשך 72 שעות לאחר הניתוח בריכוז של 0.1 מ"ג/ק"ג.
       הערה: לחלופין, שקול להשתמש בתרופה למשככי כאבים בשחרור ממושך, הדורשת מנה אחת כל 72 שעות.
   14. החזירו את החיה לכלוב הוויבריום שלה לאחר שחזרה להכרה, כשהיא קשוחה ואמבולטורית. עקוב אחר בעלי החיים לאחר הניתוח מדי יום לאיתור סימנים של זיהום או כאב באתר הניתוח, מצב בריאותי כללי וסיבוכים.
       הערה: בעלי חיים שאינם מתאוששים היטב מניתוח הישרדות עשויים לקבל מינונים נוספים של תרופות לשיכוך כאבים ויומתו באופן הומני אם לא יתאוששו לחלוטין עד 72 שעות לאחר הניתוח.
   15. עקוב אחר החיה אחר גדילת הגידול, הירידה במשקל ומצב הבריאות הכללי כמתואר בשלב 2.6.6.
10. עבור זריקות רטרו-מסלוליות:
    הערה: השתמש בטכניקה זו כחלופה לזריקות ורידים בזנב כאשר המפעיל מאומן ומיומן בטכניקה זו וכאשר יש הצדקה מדעית חזקה. מתלי תאים המועברים בדרך זו יכולים לגרום לצמיחת הגידול במרחב הרטרו-מסלולי; לפיכך, יש לשקול היטב את הסיכונים והיתרונות בעת בחירת טכניקה זו. לדוגמה, כדי לנצל את הקשר הישיר במחזור הדם של הסינוס הוורידי הרטרו-מסלולי עם הוורידים התוך-מוחיים באמצעות אנסטומוזות, בחר בשיטה זו כאשר היווצרות גידולי המוח נכשלה באמצעות נתיבי הזרקה אחרים.
    1. בצע את כל ההליך בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים אספטיים. דון PPE סטרילי וכפפות.
    2. הרדמה את החיה כמתואר בשלבים 2.3-2.4.
       הערה: עבור הליך זה, אין להחיל משחה פטרולאטום אופתלמית סטרילית על עיני החיה כי זה יעכב את ההזרקה; להחיל רק טיפות הרדמה מקומיות.
    3. טען את תרחיף התא במזרק אינסולין עם מחט 28-31 גרם, 6 מ"מ.
    4. כאשר החיה במצב נוטה, יש להחזיר את העפעפיים עד שהעין בולטת. יש למרוח טיפה אחת של חומר הרדמה מקומי לתוך העין בצד העובר את ההליך.
    5. הכנס את המחט בזווית של 30-45° בין העין לבין האפיקנתוס המדיאלי כאשר השיפוי פונה כלפי מטה. הזריקו את תרחיף התא (10-150 μL) באיטיות.
       הערה: תנועות איטיות יותר מונעות נזק לעין ולזרימה האחורית של המזרק.
    6. בצע את השלבים המתוארים ב- 2.7.5-2.7.6.
11. עבור זריקות splenic:
    1. בצע את ההליך כולו בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי לשמור על תנאים אספטיים³¹. דון PPE סטרילי וכפפות סטריליות.
    2. להרדים ולגלח את החיה כמתואר בשלבים 2.3-2.5.
    3. מקם את החיה בתנוחת שכיבה צידית ימנית. נקה את העור של אזור ההליך עם 3 יישומים של 10% povidone-יוד לסירוגין עם 3 יישומים של אלכוהול איזופרופיל ולהכין את שדה הניתוח כמתואר בשלב 2.9.5.
    4. באמצעות מספריים של מצנבאום או אזמל, לבצע חתך של 1 ס"מ באגף השמאלי של דופן הבטן ואחריו חתך לתוך הצפק.
       הערה: הטחול ייראה דרך דופן הבטן השקופה לאחר ביצוע החתך בעור. בצע את החתך הצפקי בדיוק באתר זה.
    5. חשוף את הטחול ואת ההמולה הטחולנית דרך החתך. באמצעות מחט מזרק אינסולין 28-31 גרם, באורך 6 מ"מ, נקבו בעדינות את הטחול כאשר שיפוע המחט פונה כלפי מעלה ובזווית חדה.
       הערה: אם פצע הניקוב מדמם, צמצם את האתר כדי להגביל את הדימום ואת זרימת הגב.
    6. הזריקו את כל הנפח (50-100 μL) של תרחיף התא באיטיות. הסר את המחט. מניחים גזה קטנה על הטחול ומפעילים לחץ עם מלקחיים. מהדקים את הטחול בקלילות בין הגזה באמצעות מלקחיים עדינים של יתושים ומחכים 15 דקות.
    7. בצע כריתת פאר על ידי קשירת הילום הטחול עם תפר משי 3-0 או 4-0, תוך צביעת הכלים במידת הצורך. סגור את הצפק עם תפר 5-0 פולידיוקסנון (PDS) או חומצה פוליגליקולית נספגת.
    8. בצע את השלבים המתוארים בשלבים 2.7.5-2.7.6.
       הערה: בעלי חיים המציגים סיבוכים מדממים או שלא התאוששו באופן מלא 72 שעות לאחר הניתוח צריכים להיות מורדמים באופן הומני. זכור כי רווחתם של העכברים היא בראש סדר העדיפויות בכל עת.

3. ניתוח הישרדות מבוים (SSS)

1. בהתבסס על מסקנות הניסוי משלב 2.2, קבעו את הזמן המתאים לניתוח הישרדותי. בהתאם לקו התא ולהשערה הניסיונית, בחר נקודת זמן מוקדמת יותר לכריתת הגידול (בנפח גידול = 150 מ"מ³) או נקודת זמן מאוחרת יותר (בנפח גידול = 500 מ"מ³)²⁶.
   הערה: מגבלת נפח הגידול היא 1,500 מ"מ³ כאשר נטל הגידול גבוה מספיק כדי להזיק לרווחת החיה ולנטייה לסיבוכים.
2. להרדים ולגלח את החיה כמתואר בשלבים 2.3-2.5.
   הערה: ההליך כולו מתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
3. נקה את העור של אזור ההליך עם 3 יישומים של 10% povidone-יוד לסירוגין עם 3 יישומים של אלכוהול איזופרופיל ולהכין את שדה הניתוח כמתואר בשלב 2.9.5.
4. באמצעות מספריים של איריס או אזמל, לנטות את העור, תוך שמירה על מרווח כריתה של 5-7 מ"מ מקצה הגידול.
   הערה: המרווח לכריתה תלוי ביכולתו של הגידול להתפשט באופן מקומי. עבור גידולים אגרסיביים, הגדל את שולי הכריתה תוך הקפדה על כך שנשאר מספיק עור כדי לבצע את סגירת הפצע.
5. במקרה של גידולים תוך עוריים, לכרות את הגידול יחד עם העור ההיקפי.
6. עבור גידולים תת עוריים, לנתח ולהסיר את הגידול מתחת לעור.
   הערה: אם הגידול פולש לצפק ו/או לעור, יש לכרות אותו עם הגידול ולסגור את הצפק עם תפרים נספגים של חומצה פוליגליקולית 5-0/4-0.
7. סגור את הפצע עם מכשיר הידוק 9 מ"מ.
   הערה: הסר את הסיכות 7-10 ימים לאחר הניתוח. תנו תרופות משככי כאבים והניחו את החיה על כרית חמה כדי להתאושש. יש להמשיך במתן תרופות משככי כאבים במשך 72 שעות לאחר הניתוח, אחת ל-12 שעות על פי שלב 2.9.13. בעלי חיים עם סיבוכים מדממים או שלא חזרו להכרה מלאה לאחר הניתוח צריכים להיות מורדמים באופן הומני.
8. בית יחיד את החיה בכלוב, על כרית חמה כדי להתאושש. החזירו את החיה לכלוב הוויבריום לאחר שחזרה להכרה, כשהיא קשוחה ואמבולטורית.
9. המשך לעקוב אחר בעלי החיים לאחר הניתוח לאיתור הישנות מקומית, ירידה במשקל, נוירולוגית, תנועה ו/או סימנים התנהגותיים (עייפות, חוסר טיפוח, צריכת מזון או מים נמוכה) ומצב בריאותי כללי.

4. הדמיית In vivo (איור 2A)

1. מתן מצע D-לוציפרין (150 מ"ג/ק"ג) לבעלי חיים על ידי הזרקה תוך-צפקית עם מזרק אינסולין 1 מ"ל, מחט 28 גרם.
   הערה: תאי הגידול חייבים לעבור התמרה יציבה עם לוציפראז cDNA.
2. לגרום להרדמה כמתואר בשלבים 2.3-2.4, 6 דקות לאחר הזרקת מצע D-לוציפרין.
3. בצע הדמיה באמצעות סורק הדמיה ביולומינסנציה (BLI) (מערכת הדמיה in vivo )²⁶.
4. הזיזו את החיה לתוך תא ההדמיה ולתוך חרוט האף. תמונה של עד 5 בעלי חיים בו זמנית, בהתאם לקיבולת של מערכת ההדמיה.
5. הפעל את המכשיר על-ידי לחיצה על אתחול. הגדר את הגדרת זמן החשיפה לאוטומטי (1-120 שניות).
6. צלם תמונה ריקה כדי להחסיר כל רקע במידת הצורך. לחץ על רכוש ושמור את התמונה לאחר השלמת רצף הרכישה.
7. מניחים את החיה בחזרה בכלוב, שיושב עם 50% משטח הבסיס מעל כרית חימום כדי להתאושש מהרדמה. החזירו את החיה לכלוב הוויבריום לאחר שחזרה להכרה, כשהיא קשוחה ואמבולטורית.
8. לניתוח נתונים באותה תוכנת הדמיה in vivo שבה צולמו התמונות, נווטו לתיקייה שבה נשמרות התמונות ופתחו את התמונות של כל העכברים הנוגעים לניסוי בבת אחת.
   הערה: ניתוח של תמונה אחת בכל פעם לא יאפשר נורמליזציה בין קבוצות.
9. הגדר את היחידות לזוהר (לא נחשב). ודא שתיבת הסימון המציינת את הפרט אינה מסומנת, מכיוון שהדבר ימנע נורמליזציה של האות בין קבוצות.
10. באמצעות הכלי ציור אזור עניין (ROI), צייר ROIs עגולים עבור אזור המוח ו- ROIs מלבניים עבור הגוף. הקפידו להוציא את האוזניים והאף מהמוח ROI, מכיוון שהם נוטים לפלוט זוהר לא ספציפי. כדי למזער את ההטיה בתהליך זה, צייר ROIs על תצלומי העכברים בלבד, ללא כיסוי האות הזוהר.
11. בחר מדידת ROIs כדי לכמת את האות ולייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. נתחו הבדלים בין קבוצות על ידי התוויית שטף זוהר כולל (p/sec/cm²/sr) באזורי הגוף המעניינים.
    הערה: כדי להעריך הבדלים בין קבוצות בטרופיזם מוחי באופן ספציפי, חשב את היחס בין אות המוח לאות הגוף עבור כל עכבר. זה שולט על שונות אינטרמוזית בנטל הגידול הכולל ועל הבדלים ברמות הביטוי של לוציפראז בין קבוצות ניסוי.

5. דימות תהודה מגנטית Ex vivo

1. בצע MRI ex vivo מיד לאחר המתת חסד. לחלופין, לקצור את האיברים המעניינים, לתקן אותם בפורמלין עד 72 שעות, ולבצע את ההדמיה בנקודת זמן מאוחרת יותר.
2. רכשו את התמונות עם מערכת מיקרו-MRI של 7-Tesla (7-T) (300-MHz) המצוידת בקונסולת NMR ובמגנט נשא אופקי עם אפס רתיחה או ציוד דומה.
   הערה: הצורך בהוספת סליל מעבר צבע מסוכך באופן פעיל עם פשרה נכונה של ביצועים הוא קריטי. עליו לספק ליניאריות הדרגתית של לפחות 50 מ"מ של נפח כדורי דינמי (DSV) כדי לכסות את קבוצת הדגימות שנבדקו בו זמנית ללא עיוות גיאומטרי. השילוב של חוזק גרדיאנט (הנע בין 440 ל-750 mT/m) ומחזור עבודה המאפשר זרמי DC סימולטניים מרביים הנעים בין 3 x 30 A ל-3 x 87 A יאפשר ביצועי הדמיה נאותים. הוספת סליל ההדרגה שבה נעשה שימוש (ראה טבלת החומרים) מאפשרת את הביצועים הבאים: 660 mT/m, זמן עלייה של 130 מיקרון, 3 x 87 A ו- DSV = 80 מ"מ.
3. בצע את הסריקות עם סליל מסחרי מקוטב באופן מעגלי של גוף העכבר כולו (OD = 59 מ"מ, ID = 38 מ"מ, L = 40 מ"מ) מכוון ל- 300.16 MHz, תדר ^{1 H}פרוטון לרמור.
   הערה: בדיקת RF זו מאפשרת רכישה של מערכי נתונים תלת-ממדיים עם רזולוציה איזוטרופית תת-מימית (<150 מיקרומטר) במהלך סריקות לילה המשתרעות על פני 8-12 שעות.
4. זהה את נטל הגידול באמצעות רצפים מרובים³⁰.
   הערה: אות Hyperintense שזוהה על ידי רצף T 2-weighted, הדמיה מהירה עם הדים ממוקדים מחדש (נדיר) מזהה בצקת המקיפה גידולים.
5. בצע את רצף 3D RARE עם הפרמטרים הבאים לרכישה: [120 μm]³ רזולוציה איזוטרופית; זמן רכישה 5 שעות, 27 דקות; זמן חזרה (TR) = 500 אלפיות השנייה; ריווח הד (ES) = 12.7 דקות; טורבו פקטור TFx = 12; זמן הד יעיל (TE_eff) = 76.2 אלפיות השנייה; רוחב פס (BW) = 75 קילוהרץ; גודל מטריצה = 284³; שדה ראייה (FOV) = [4.0 מ"מ]³; מספר הממוצעים (Nav) = 6.
6. זהה גרורות באמצעות הפרמטרים הבאים.
   1. עבור גרורות פיגמנטיסטיות עם הבהרת אותות, השתמש ברצף הדים של מעבר צבע תלת-ממדי משוקלל T₁ עם הפרמטרים הבאים: [רזולוציה איזוטרופית של 120 μm]³ ; זמן רכישה 2 שעות, 41 דקות; TR = 20 אלפיות השנייה; זמן הד (TE) = 4.0 אלפיות השנייה; זווית היפוך (FA) = 18°; BW = 75 קילוהרץ; גודל מטריצה = 2843; FOV = [34.0 מ"מ]³; Nav = 6.
   2. עבור גרורות לא מזוהמות ו/או דימומיות, השתמש באות היפונטנס בעת רכישה תחת רצף הד משוקלל ומשוקלל T₂* (MGE) (3D MGE, [120 μm]³ רזולוציה איזוטרופית; זמן רכישה 3 שעות, 35 דקות; TR = 40 אלפיות השנייה; TE = 3.6 אלפיות השנייה; ES = 3.2 אלפיות השנייה; 4 הדים; FA = 20°; BW = 100 קילוהרץ; גודל מטריצה = 284³; FOV = (34.0 מ"מ)³; Nav = 4.
7. השתמש בכל 3 הרצפים כדי לכמת את נטל הגידול.
8. הצלבת אזורי הגידול שזוהו במהלך הניתוח עם מקטעים היסטולוגיים כדי להבטיח דיוק. ראו סעיפים 7 ו-8.

6. עיבוד רקמות לריצוף RNA חד-תאי או בתפזורת

1. המתת החסד את החיה באמצעות כל שיטה שאושרה על ידי IACUC של המוסד. ראה אחד מההליכים המתוארים בהערה של שלב 2.6.6.
2. נתחו את האיברים המעניינים והניחו אותם בבארות נפרדות של צלחת המכילה את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) על הקרח. עבוד במהירות ושמור את הרקמה על הקרח בכל עת כדי למקסם את הכדאיות של התא.
   הערה: השלבים הבאים הם ספציפיים לעיבוד המוח. התאימו את סוג הקולגאז לרקמה הספציפית, בהתאם לצרכים שלכם.
3. הכינו צלחת של 6 בארות עם 3 מ"ל של HBSS בכל באר.
4. כדי לדמיין ולעזור עוד יותר להנחות את הנתיחה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי וזיהה את האזורים המסומנים.
5. נתחו את האזורים הפלואורסצנטיים והניחו את שברי הרקמה בלוחית 6 הבאר (שבר אחד לכל באר אם יש לנתח מוקדים גרורתיים בודדים או מספר שברים מאיבר אחד אם יש לנתח גרורות מרובות באותו איבר). השתמש בסכיני גילוח סטריליים כדי לטחון את הרקמה לרסיסים קטנים ככל האפשר (מבלי להשקיע יותר מ -1-2 דקות על שלב זה עבור כל דגימה).
   הערה: הגבלת זמן העיבוד של הגידולים מסייעת בשמירה על כדאיות התא.
6. לשאוף ולהעביר את התוכן של כל באר לצינור חרוטי 15 מ"ל.
   הערה: חתכו את הקצה של קצה פיפטה של 1,000 μL כדי להקל על העברת שברים גדולים יותר.
7. הוסיפו 1 מ"ל של HBSS לבאר וודאו ששברי/תאים הנותרים של הרקמה יועברו לצינור 15 מ"ל, שיכיל נפח סופי של 4 מ"ל. הוסיפו 50 μL של קולגן מסוג I (40 מ"ג/מ"ל) ו-12.5 μL DNase I (2,000 יחידות/מ"ל) לכל צינור.
8. הניחו את הצינורות החרוטיים באמבט מים מחומם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לזמן קצר מערבולת את הצינורות החרוטיים כל 5 דקות.
9. יש להכין מראש מסננת של 70 מיקרומטר עם HBSS. השתמשו בקצה המכוסה של צינור מיקרו-סנטריפוג מעוקר או בחלק הפלסטי של בוכנה עם מזרק וטוחנים את הרקמה בהומוגנטים דרך מסננת של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל.
   הערה: הטיית המסננים מראש עם HBSS או מאגר FACS מקלה על המאמץ.
10. יש לשטוף את המסננת ב-1 מ"ל של HBSS. יש להכין מראש מסננת של 40 מיקרומטר עם HBSS. סנן שוב כל דגימה דרך מסננת של 40μm לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. הוסיפו 1 מ"ל של FBS למסננת של 40 מיקרומטר כדי לשטוף אותה. שמור את הצינורות החרוטיים על הקרח כל הזמן.
11. מלאו את הצינור החרוטי ל-50 מ"ל ב-DPBS קר כקרח. סובב את התאים (180 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס). להשליך את supernatant, להיזהר לא לאבד את גלולת התא.
    הערה: עבור דגימות מוח, בצעו החייאה של התאים ב-2.5 מ"ל של תמיסת הפרדת צפיפות של 38% (דילול ב-HBSS ואחסון בטמפרטורת החדר (RT)). העברה לצינורות FACS של 5 מ"ל. ספין במשך 20 דקות ב 800 × גרם. חותכים את קצה קצה הפיפטה של 1,000 μL ומסירים את שכבת השומן העליונה. אין להשאיר שומן על קירות הצינורות. אם נשאר שומן כלשהו, סובבו שוב למטה וחזרו על התהליך. זהו צעד קריטי . הסר את שאר השלב הנוזלי (הכדור יהיה שקוף וקשה לדמיין אותו).
12. בצעו החייאה של התאים ב-1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים (RBC) ודגרו במשך 60 שניות ב-RT. מרווים את תמיסת הליזיס על ידי הוספת 20 מ"ל של DPBS.
13. סובב את התאים ב 180 × גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את ה-supernatant ובצע שימוש חוזר בתאים ב-2 מ"ל של מאגר FACS (5% FBS ב-DPBS).
14. המשך במיון תאים מסומנים ו/או הכנת ספרייה לריצוף RNA בתפזורת או של תא יחיד.
    הערה: ניתן לסובב את התאים כלפי מטה, להקפיא אותם ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני בידוד ה-RNA עבור RNA-seq בתפזורת.

7. זלוף רקמות בעלי חיים והכנה לניתוחים אימונוהיסטולוגיים

1. מרדימים את החיה עם מנת יתר של קטמין (300 מ"ג/ק"ג) וקוקטייל קסילזין (30 מ"ג/ק"ג) בהזרקה תוך-צפקית עם מזרק אינסולין ומחט של 28 גרם.
2. חשוף את הלב על ידי דיסקציה גסה ועשה חתך באטריום הימני. החזיקו את הלב בעדינות במקומו עם מלקחיים ארוכים ומעוקלים הפונים קדימה.
   הערה: פורמלין ופרפורמלדהיד (PFA) הם חומרים מסרטנים. קרא את גיליון נתוני הבטיחות (SDS), הימנע מחשיפה לאדים והרכיב את ה- PPE המתאים.
3. באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 22 G, 22 מ"מ, להזריק 10 מ"ל של DPBS ואחריו 10 מ"ל של 4% PFA לחדר השמאלי.
4. המשך לקצור את האיברים ולהעמיס אותם לקלטות היסטולוגיות עם תווית מוקדמת. הניחו את הקסטות במיכל בגודל מתאים שמתאים למספיק מקבע (פורמלין) כדי לכסות את הרקמות.
   הערה: באופן אידיאלי, הנפח המקבע צריך להיות פי 5-10 מנפח הרקמות.
5. לתקן את האיברים בתוך קלטות היסטולוגיות ב 10% פורמלין במשך 48-72 שעות. השליכו את הפורמלין של 10% ושטפו את הקסטות פעמיים עם 1x DPBS.
6. התחילו את תהליך ההתייבשות על ידי טבילת הקסטות ב-70% אתנול למשך שעתיים. המשיכו לטבול את הקסטות ברצף בהגדלת ריכוזי האתנול: 80%, 95%, 100% למשך שעה אחת כל אחת. שנה את הפתרון של 100% פעמיים לאחר 1.5 שעות. לטבול את קלטות קסילן במשך 1.5 שעות ולבצע שלושה שינויים של הפתרון.
7. הטמיעו את הקלטות בשעווה פרפין בטמפרטורה של 58-60 מעלות צלזיוס. חתך את בלוקי הפרפין. המשך לצביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) אורימנוהיסטוכימיה.
8. כדי לזהות תאי מלנומה, השתמש באחד מהסממנים האלה או בפאנל: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. במידת האפשר, השתמש בכתם חלבון מנגנון מיטוטי גרעיני (NuMA) מכיוון שהוא סמן תאים אנושי ספציפי ביותר.
   הערה: צביעת NuMA מציעה תיחום חד בין פונדקאי (עכבר) לתאים חרוטים (אנושיים) המסייע בעיבוד תמונה ובשלבי כימות הגידולים הבאים.

איור 2: דוגמאות לתמונות BLI, brightfield, ex vivo fluorescence ו-H&E הממחישות את הגישה הרב-תכליתית לניתוח ההשפעות של גנים מועמדים בגרורות מלנומה. (A) BLI, (B) BF, (C) אקס-ויוו פלואורסצנציה, ו-(D) תמונות מכתימות H&E. התמונות המשמשות להמחשה תואמות לניסוי שבו הוזרקו תאי מלנומה 131/6-4L שעברו התמרה עם shRNA בקרה שאינו ממוקד מטרה (shNTC) או shRNA המכוון FUT8 לעכברים אימונו-נדיפיקטיביים (NSG). השתקת FUT8 פגעה בהפצה גרורתית של תאי מלנומה. סרגלי קנה מידה ופס צבע = p/sec/cm²/sr × 10⁶ (A), 100 מ"מ (B, C), 100 מיקרומטר (D). קיצורים: BLI = הדמיית ביולומינסנציה; H&E = המטוקסילין ואוזין; shRNA = RNA קצר סיכת שיער; shNTC = shRNA בקרה שאינו מכוון; NSG = גמא כשל חיסוני משולב חמור של סוכרת שאינו שמן; FUT8 = פוקוסילטרנספראז 8; BF = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

8. צביעת חלבון מנגנון מיטוטי גרעיני (NuMA) (איור 3)

1. השתמש בנוגדן anti-NuMA כסמן ציר מיטוטי ספציפי מאוד לבני אדם לזיהוי וכימות של עומס גרורתי בחתכי רקמות. 8.1. זיהוי ספציפי ורגיש ביותר של תאי מלנומה מושג.
2. אם אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית עבור NuMA מבוצעת על מכשיר חיסון אוטומטי, בצע את השלבים הבאים כמתואר³²:
3. דפאראפין של החלקים בקסילן וייבש אותם מחדש בירידה רציפה בריכוזי האתנול. שמור את השקופיות שקועות במשך 15 דקות בקסילן והעבר אותן ל-100% אתנול למשך 15 דקות נוספות.
   הערה: שאר שלבי ההתייבשות של האתנול (95%, 80%, 75%) נמשכים 3 עד 5 דקות כל אחד.
4. יש לשטוף את המגלשות במים שעברו דה-יוניזציה.
5. בצעו שליפת אפיטופים על ידי טבילת המגלשות במיכל (לדוגמה, צנצנת צביעת קופלין) ב-10 מ"מ מאגר נתרן ציטראט, pH 6.0, בתנור מיקרוגל של 1200 וואט בהספק של 100% למשך 10 דקות.
6. השתמש בנוגדן NuMA אנטי-אנושי לא-מדולל של ארנב פוליקלונלי אנטי-אנושי לסימון, מדולל 1:7,000 באלבומין סרום Tris-Bovine (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7.2). הפעל את הבקרות החיוביות והשליליות המתאימות במקביל לסעיפי המחקר.
7. דגירה של השקופיות עם הנוגדן העיקרי למשך 12 שעות. זהה את הנוגדן העיקרי עם מולטימר מצומד HRP נגד ארנב עזים ודמיין את הקומפלקס עם 3,3-diaminobenzidine ומשפר נחושת גופרתית.
8. יש לשטוף את המגלשות במים מזוקקים, לנטרל את ההמטוקסילין, לייבש ולהרכיב עם מדיום קבוע.
   הערה: שלבי ההתייבשות הם ההיפך של שלבי ההתייבשות המתוארים בשלב 8.3. סרוק את השקופיות באמצעות הסורק הזמין בהגדלה של פי 20 או 40x והעלה אותן למסד נתונים.
9. באמצעות תוכנה, צייר ROIs כך שיכללו את כל התאים המוכתמים ב-NuMA בתוך רקמת האיברים, למעט פרנכימה איברית אחרת וחללים ריקים.
10. התאם את ההגדרות כדי לסווג את התאים החיוביים ל- NuMA ו- NuMA-negative תוך שימוש בבקרות חיוביות ושליליות מתאימות עבור כל איבר. השתמש באלגוריתם תוכנה מבוסס כדי לכמת את המספר/האחוז הכולל של תאים חיוביים ל-NuMA עבור כל דגימה.

9. אימונופלואורסצנציה פרוסת רקמות

כדי לזהות את השלב הגרורתי שבו נדרש מועמד לגן מסוים (למשל, ראוותנות לעומת הישרדות לאחר זריעה), ניתן לקבוע אימונופלואורסצנציה של פרוסת רקמות בנקודות זמן שונות כדי לעקוב אחר התקדמות תאי הגידול מהזרקה לפלישת איברים מרוחקים, זריעה וצמיחה. גישה זו מאפשרת להוסיף סמנים לתאים שכנים כדי ללכוד את אירוע האקסטרווסציה ואת השינויים המיקרו-סביבה של הגידול שמסביב³³.

1. להרדים את החיה כמתואר בשלב 7.1.
2. להזריק 100 מיקרוגרם של פלואורופור מצומד Lycopersicon Esculentum (עגבנייה) Lectin לתוך החדר השמאלי של כל חיה, 3 דקות לפני זלוף, כדי להגדיר את האנדותל הווסקולרי.
   הערה: אפשרו זמן ללקטין העגבניות להתרברב במערכת כולה.
3. תכניסו את החיה כמתואר בשלבים 7.2-7.3. לקצור את האיברים המעניינים ולהעביר אותם למיכלים עם תווית מוקדמת מלאים ב-4% PFA. תקן את הרקמה במשך 24 עד 48 שעות. חתכו את הרקמה באמצעות ויברטום לפרוסות בעובי 30-50 מיקרומטר.
   הערה: העובי צריך להיות מותאם. פרוסות בעובי של בין 30 מיקרומטר ל-50 מיקרומטר מומלצות, במיוחד בעת ביצוע הדמיית z-stack.
4. דגירו את הפרוסות במאגר חוסם (10% סרום עיזים רגיל, 2% BSA, 0.25% טריטון X-100 ב-DPBS) למשך שעתיים ב-RT.
5. בצע ניסוי אופטימיזציה של צביעה.
   הערה: כמו זמן אחזור אנטיגן, מאגרים המשמשים לאחזור אנטיגן, טמפרטורה, נוגדנים שונים / הרבה שונים, ואת סוג הרקמה להשפיע על הכתם, ניסויי אופטימיזציה הם נחוצים.
6. הוסיפו נוגדנים ראשוניים בדילול אופטימלי ודגרו לזמן ממוטב בטמפרטורה אופטימלית (ראו דוגמאות בטבלה 1).
   הערה: השתמש בבקרות מתאימות עבור נוגדנים ראשוניים/משניים ודגימות רקמה לא מוכתמות.
7. לשטוף את פרוסות הרקמות 3 פעמים במשך 5 דקות עם 0.25% Triton X-100 ב- DPBS.
8. דגירה של פרוסות הרקמה בנוגדנים משניים המדוללים בתמיסת חסימה לזמן הרצוי (טבלה 1).
9. לשטוף את פרוסות הרקמות 3 פעמים במשך 5 דקות עם 0.25% Triton X-100 ב- DPBS.
10. הכתימו את הגרעינים ב-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל 1:1,000 ב-DPBS או בחסימת מאגר למשך 5 דקות.
11. הוסיפו 2 טיפות של מדיום הרכבה פלואורסצנטית של אנטיפאדה לכיסוי והרכיבו את הרקמה על מגלשות זכוכית, וודאו שהפרוסות מכוסות במלואן על ידי מדיום הרכבה.
    הערה: ודא שאין בועות אוויר ישירות על הפרוסות מכיוון שהדבר מעוות את המיקרוסקופיה.
12. צלם תמונות קונפוקליות באמצעות המיקרוסקופ הזמין באמצעות מטרת טבילת שמן פי 60.
    הערה: בעת רכישת תמונות קונפוקליות, החל את אותם פרמטרים של הגדרות (מתח, יחידות אווריריות ורווח) על כל התמונות בניסוי.
13. צלם תמונות שאינן קונפוקליות באמצעות המיקרוסקופ ב-10x, 20x או 40x.
14. העלה את התמונות בתוכנת ניתוח תמונות ונתח אותן על ידי השוואת הפרמטרים המועדפים (כלומר, שטח, מספר, עוצמת סמנים או מגע עם תאים סמוכים).

תוצאות

הנתונים הבאים ממחישים כיצד זרימת העבודה המתוארת יושמה לזיהוי מניעים חדשים של גרורות מלנומה. איור 2 מסכם את התוצאות של מחקר שפורסם, שבו נחקרו²⁶ ההשפעות של השתקת הפוקוסילטרנספראז FUT8 בגרורות מלנומה in vivo. בקצרה, ניתוח של נתונים גליקומיים של מטופלים אנושיים (המתקבלים על ידי מערכי לקטין) ופרופיל תעתיק חשפו רמות מוגברות של אלפא-1,6-fucose הקשורות להתקדמות ממלנומה ראשונית למלנומה גרורתית, העולה בקנה אחד עם עלייה בפוקוסילטרנספראז המתאים (FUT8).

דיון

מטרת דוח טכני זה היא להציע זרימת עבודה סטנדרטית מלמעלה למטה לחקירת שחקנים פוטנציאליים בגרורות מלנומה. מכיוון שניסויי in vivo יכולים להיות יקרים וגוזלים זמן רב, אסטרטגיות למקסום היעילות ולהעלאת הערך של המידע המתקבל הן בעלות חשיבות עליונה.

חובה להשתמש בגישות משלימות לאורך כל הדרך כדי להצליב ממצאים בתוך אותו ניסוי. לדוגמה, הן צביעה אימונוהיסטוכימית של NuMA והן BLI הן שיטות משלימות לכמות הנטל הגרורתי מכיוון שאף אחת מהן אינה מקיפה. בעוד ש-BLI היא שיטה שלא תסולא בפז ולא פולשנית למעקב אחר הת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
#15 להב סקאפל	WPI	500242	להליכים כירורגיים
#3 ידית סקייפל	WPI	500236	להליכים כירורגיים
מזרק טוברקולין 1 מ"ל, קצה החלקה	זריקות BD	309626
מזרק 10 מ"ל, קצה החלקה	BD	301029	זלוף
10% פורמלין נתרן חוצץ	EK Industries	4499-20L	לקיבוע זילוף/רקמות
15 מ"ל קורנינג חרוטי			430052 תרבית תאים
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי	פלקון	352196	תרבית תאים
200 הוכחה אתנול	Deacon Labs	04-355-223	היסטולוגיה
22G – מחט 22 מ"מ	BD	305156	זלוף
4-0 תפר ויקריל	Ethicon	J464G	תפר
4% פוספט קרסון חוצץ פרפורמלדהיד	EMS	15733-10	לקיבוע זילוף/רקמות
40µ m	Corning	431750	עיבוד רקמות
5-0 תפר נספג	Ethicon	6542000	סגירה
50 מ"ל חרוטי	קורנינג		430828 תרבית תאים
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי	Falcon	352070	תרבית
תאים 7-0 תפר משי	FST	18020-70	ליגטורה
70 ומיקרו; m	Corning	431751	רקמות
מדיית הרכבה נגד דהייה	Vector Labs	H-1000-10	קירוב אימונופלואורסצנטי
באמצעות מלקחיים, 10 ס"מ	WPI	14189	להליכים מיקרוכירורגיים
קונסולת Avance	Bruker	3 HD	NMR
ביוספק: 7030	Bruker	7030	Micro MRI
BSA	Bioreg	A941	NuMA מלקחיים תפרים מכתימים
Castroviejo, קצות ישרים פלטפורמת קשירה 5.5 מ"מ, 11 ס"מ	WPI	WP5025501	להליכים מיקרוכירורגיים
צנצנת צביעה קופלין	Bel-Art	F44208-1000	היסטולוגיה
DAPI	סיגמא-אולדריץ'	D9542-1MG	אימונופלואורסצנציה
dCas9-KRAB	Addgene	110820	מניפולציה גנטית
DNase I	NEB	M0303L	עיבוד רקמות
DPBS	קורנינג	21-030-CM	עיבוד רקמות
חד במיוחד להב קצה יחיד	GEM	62-0167	עיבוד רקמות
מצע מטריצה חוץ-תאית	קורנינג	354234	מחשיבים את גורם הגדילה מופחת (כחלופה
FBS	Cytiva	SH30910.03	תרבית תאים
פיג'י תמונה J	פיג'י תמונה J	תוכנה	אימונופלואורסצנציה
עז אנטי ארנב HRP מצומד מולטימר	Thermo Fisher	A16104	NuMA סרום עיזים מכתים
	Gibco	PCN5000	אימונופלואורסצנטי
HBSS	Corning	21-020-CV	עיבוד רקמות
המטוקסילין	ריצ'רד-אלן סיינטיפיק	7231	היסטולוגיה
אילומינה III	מזרק אינסולין מכשיר PerkinElmer	CLS136334	BLI
28G - מחט 8 מ"מ	BD	329424	זריקות
מזרק אינסולין 31G - מחט 6 מ"מ	BD	326730	זריקות
מלקחיים לקשתית, 10.2 ס"מ, עקומה מלאה,	WPI	504478	לזלוף והליכים כירורגיים
Isoflurane USP	Covetrus	11695067772	תכשיטני הרדמה
#7 מלקחיים טיטניום 11 ס"מ 0.07 x 0.01 מ"מ טיפ	WPI	WP6570	להליכים מיקרוכירורגיים
קטמין HCl 100 מ"ג/מ"ל	Mylan Ind.	1049007	הרדמה
lentiCRISPRv2	Addgene	98290	מניפולציה גנטית
Lycopersicon Esculentum (עגבנייה) לקטין, DyLight 649	Invitrogen	L32472	סמן תאי אנדותל כלי דם
MEM חומצות אמינו לא חיוניות X 100	Corning	25-025-CI	תרבית תאים
מצנבאום מספריים	WPI	503269	לניתוחים נהלים
יחידת מיקרו הזרקה	KOPF	5000	זריקות תוך לב
NaCl	Fisher	S25877	מכתים NuMA
מחט 30G x 25 מ"מ	BD	305128	הזרקה תוך לבבית
33G x 15 מ"מ	המילטון	7747-01	מחט הזרקה תוך קרוטידית
, Castroviejo, 14 ס"מ, עם מנעול, 1.2 מ"מ לסתות משוננות	WPI	14137-G	להליכים מיקרוכירורגיים
NOD. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ עכברי	מעבדת ג'קסון	005557	עכברי
NU/J	002019	מעבדת ג'קסון	מודל עכברים
מנגנון מיטוטי גרעיני חלבון ארנב רב-שבטי אנטי-אנושי	Abcam	97585	NuMA מכתים
פניצילין-סטרפטומיצין 10000U/mL	Gibco	15140122	תרבית תאים
Percoll	GE	0891-01	תמיסת הפרדת צפיפות
PI כפפות כירורגיות קלאסיות	קרדינל בריאות	2D72PT75X	ניתוח
pLKO Tet-On	Addgene	21915	מניפולציה גנטית
פובידון-יוד 10% תמיסה	Medline	MDS093943
ניתוח טיפות פרופרקאין 0.5%	Akorn Pharma	AX0501	הרדמה מקומית אופטלמוסית
Puralube Petrolatum משחה אופטלמית	Dechra	83592
סכין גילוח הרדמה להבי קצה כפול	EMS	72000	גילוח וחיתוך מוח רטט
רפלקס 9 מ"מ EZ קליפ	בריינטרי	EZC-	סגירת פצע
RPMI 1640	קורנינג	10-040-CM	לתרבית תאים
, קפיץ 10.5 ס"מ Str, להבים 8 מ"מ	WPI	501235	להליכים מיקרוכירורגיים
להב רוטט חצי אוטומטי מיקרוטום	Leica	VT1200	פרוסת מוח אימונופלואורסצנציה
מערכת אידוי הרדמה חד ערוצית	Kent Scientific	VetFlo-1210S	הרדמה
Smartbox מערכת תא שולחן ומפוח פליטה	EZ Systems	TT4000	CO2 המתת חסד
סטרילית סטרילית חד פעמית מנוסחת	medline		NON21002
ניתוח סטרילי לא מחוזק שמלות כירורגיות אורורה סטריליות לא מחוזקות עם שרוולים קבועים	medline		DYNJP2715 ניתוח
t25 בקבוק	קורנינג	430639	תרבית תאים
Tris	Corning	46-031-CM	NuMA מכתים
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	X100-500ML	אימונופלואורסצנציה
טראוטמן מלקחיים קשירה, 10 ס"מ, דפוס G מעוקל, קצה 0.52 מ"מ עם פלטפורמת קשירה	WPI	WP505210	להליכים מיקרוכירורגיים
קליפס כלי 10G לחץ 5x 0.8 מ"מ לסתות, 5/חבילה	WPI	15911	עבור הליכים מיקרוכירורגיים
Visiopharm	Visiopharm Visiopharm		NuMA תוכנת כימות צביעה
קסילזין 100 מ"ג/מ"ל	Akorn Pharma	59399-111-50	הרדמה
קסילן	פישר	X3P-1GAL	היסטולוגיה