ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

Summary

בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.

Abstract

מספר רב של תוכניות גנטיות מופעל במהלך ההתפתחות העוברית אשר מתזמר את התמיינות התאים כדי ליצור מגוון מדהים של תאים, רקמות ואיברים סומטיים. ההפעלה המדויקת של תוכניות גנטיות אלה מווסתת על ידי מורפוג'נים, מולקולות מפוזרות המכוונות את גורל התא לסף שונה. הבנת האופן שבו הפעלה גנטית מתאמת מורפוגנזה דורשת מחקר של אינטראקציות מקומיות המופעלות על ידי מורפוגנס במהלך ההתפתחות. השימוש בחרוזים ספוגים בחלבונים או בתרופות המושתלים באזורים מובחנים של העובר מאפשר לחקור את תפקידן של מולקולות ספציפיות בביסוס ספרות ותהליכי התפתחות אחרים. טכניקה ניסיונית זו מספקת מידע על השליטה באינדוקציה של התא, בגורל התא ובהיווצרות תבניות. לפיכך, בדיקת חרוזים ספוגה זו היא כלי ניסיוני רב עוצמה ובעל ערך החל על מודלים עובריים אחרים.

Introduction

פריצות דרך במנגנונים המולקולריים השולטים בביטוי גנים במהלך ההתפתחות העוברית אפשרו לנו להבין כיצד נקבע גורל התא. מחויבות לשושלות תאים שונות מתרחשת ברגע שהתאים מתחילים בביטוי המולקולרי של גורמי שעתוק¹. תבנית ביטוי זו מתואמת מאוד במרחב ובזמן ובכך מכוונת את העיצוב, המיקום והדפוס של תאים, רקמות ואיברים ^1,2,3,4,5. אינדוקציה עוברית היא התהליך שבו תאים מחויבים לשושלות ספציפיות על ידי יצירת היררכיות המגבילות את הפוטנציאל של התאים, הכוללות אף את יצירת תוכנית הגוף הבסיסית כפי שקורה עם מארגן Spe....

Protocol

מחקר זה נסקר ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון לביומדיקה של המכון לביומדיקה של Investigaciones, אוניברסיטת נסיונל אוטונומה דה מקסיקו (UNAM, מקסיקו סיטי, מקסיקו).

1. דגירה של ביצית והדבקת עוברים

הערה: ניתן להשיג ביצי תרנגולות מופרות מחוות מקומיות. ביצי תרנגולת לבנה מופרות של הלגהורן נמצאות בשימוש הנפוץ ביותר. אחסנו את ביצי העוף המופרות הטריות בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני הדגירה.

1. הדגירה של ביצי העוף המופריות בצורה אנכית עם הצד המחודד למטה באינקובטור לח בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 70% עד שהן מגיעות לשלב של 28 HH (כ-5.5 י....

Results

שימוש בחרוזים ספוגים להערכת התנהגות התא באיבר האפרוח העוברי
כדי להבטיח את יעילותו של מבחן זה, יש למקם את החרוז באופן עקבי ומדויק במיקום הנכון; במקרה זה, הדיסטלי-רוב של האינטרדיגיט השלישי מתחת לרכס האקטודרמלי האפי AER (איור 1A). מיקום זה מאפשר למולקולה המדוברת להתפשט באופן שווה בכל הרקמה הבין-דיגיטלית. יתר על כן, האזור שמתחת ל-AER מכיל תאים לא מובחנים שמגיבים בקלות לטיפול. כדי להעריך את ההשפעות על התמיינות תאים, ניתן להכתים את העוברים בכחול אלקיאני ובאדום אליזרין כדי להעיד.......

Discussion

היתרון העיקרי של הכלי הניסויי המפורט בפרוטוקול זה הוא היכולת לשלוט בזמן ובמיקום של החשיפה לחרוזים הספוגים במולקולה ניסיונית נתונה. שילוב המיקום הנכון עם תזמון התפתחותי מדויק מספק אפשרויות עצומות לחקור תהליכי התמיינות תאים. ביצוע ניסויים אלה ברקמות לא מובחנות מאפשר לחקור את האירועים המכריעים הראשונים בשושלת התאית. לדוגמה, הצבת חרוז ספוג TGFß ברקמה הבין-דיגיטלית של גפיים עובריות 28 HH גורמת להיווצרות ספרה חוץ רחמית שבה מופעל מפל מולקולרי המעורר את הביטוי הגנטי של דור המאסטר Sox9²⁵. למרבה הפ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חרוזי ג'ל כחול Affi-Gel	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 חרוזים	Bio-Rad	1400123
חממת ביצים	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
מלקחיים כירורגיים עדינים	Fine Science Tools	9115-10
חרוזי Heparine Sepharose	Abcam	ab193268
קן צלחת פטרי
705001 סטריאומיקרוסקופ	Zeiss	Stemi DV4
קלטת	NA
NA מחט טונגסטן	GoodFellow	E74-15096/01