בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מוטציות שהוכנסו בספליקוזום או במצע שלו תרמו באופן משמעותי להבנתנו את המורכבות של תפקוד השחבור. בין אם הן קשורות למחלה או נבחרו באופן פונקציונלי, רבות מהמוטציות הללו נחקרו באמצעות מבחני גדילה באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae (שמרים). בדיקת צמיחת הנחושת הספציפית לשחבור, או בדיקת ACT1-CUP1, מספקת ניתוח מקיף של מוטציה ברמה הפנוטיפית. בדיקת ACT1-CUP1 משתמשת בעיתונאים המעניקים עמידות לנחושת כאשר הם מחוברים כהלכה. לפיכך, בנוכחות נחושת, שינויים בכדאיות השמרים מתואמים לשינויים בייצור mRNA באמצעות שחבור. בניסוי טיפוסי, שחבור השמרים מאותגר עם כתבי שחבור שונים שאינם בקונצנזוס ומוטציה של גורם שחבור מעניין כדי לזהות כל השפעה סינרגטית או אנטיתטית על השחבור. כאן ניתן תיאור מלא של הכנת לוחות נחושת, ציפוי של תאי שמרים והערכת נתונים. מתואר מבחר של ניסויים משלימים, המדגישים את הרבגוניות של כתבי ACT1-CUP1. בדיקת ACT1-CUP1 היא כלי שימושי בארגז הכלים של השחבור הודות לקריאה ישירה של אפקטים מוטציוניים והאפשרויות ההשוואתיות מהמשך השימוש בשטח.
מבוא
השחבור הוא מכונה ביולוגית גדולה המזרזת הסרה של אינטרונים, אזורים שאינם מקודדים ב-RNA שליח מבשר (pre-mRNA)1,2. אפיון ההשפעה של מוטציה נקודתית אחת ב-1 מתוך כמעט 100 חלבונים ו-5 רנ"א שאינם מקודדים הוא לעתים קרובות דו-משמעי כאשר חוקרים את החלבון או הרנ"א בבידוד. את השינוי בתפקוד הרכיב המוטנטי ניתן להעריך בצורה הטובה ביותר in vivo בהקשר של השחבור המלא והמתפקד.
בדיקת צמיחת הנחושת המתוארת כאן היא מדד מהיר של יעילות שחבור ב- Saccharomyces cerevisiae או שמרים ניצנים. בדיקה זו, שפותחה על ידי C.F. Lesser ו- C. Guthrie ופורסמה בשנת 1993, משלבת את קלות העבודה עם אורגניזם מודל פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בניית זן שמרים
- צור או קבל זן S. cerevisiae שהרקע שלו כולל leu2 ו - cup1Δ. כדי ליצור את הרקע הזה, השתמש בשיטת השמרים המבוססת היטב המשתמשת בליתיום אצטט ובדנ"אחד-גדילי 39.
הערה: זני שמרים הפלואידים עשויים להכיל עותק אחד, שניים או יותר של CUP1 6,38. עיין במידע גנומי עבור זן השמרים שנבחר בעת תכנון פריימרים נוק-אאוט כדי לאגף את מיקומי הגנים CUP1. - בצע טרנספורמציה של שמרים כדי לשלב את ה- QSP באמצעות שילוב גנומי או על פלסמיד. השתמש בפרוטוקול מבוסס היטב כמו אלה שתוארו במחקרים קודמים40,41,42
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מבחני צמיחה, כמו ACT1-CUP1, דורשים הערכה חזותית והשוואתית של מושבות מרובות. כאן, כל זן גדל לרוויה בן לילה, מדוללל-OD 600 של 0.5, ומצופה על 20 לוחות המכילים טווח של ריכוזי נחושת מ-0 mM עד 1.1 mM CuSO4 (איור 3). טווח זה קטן יותר מזה המופיע בפרוטוקול מכיוון שהוא מאפשר הערכה מלאה של ההשפעה של כתבי QSPs ו- ACT1-CUP1 המשמשים ומתוארים להלן. הלוחות צולמו וקיבלו ניקוד (איור 3 וטבלה משלימה 3).
עבור הניסוי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ACT1-CUP1 הוא מבחן גדילה, ויש לנקוט בזהירות כדי להבטיח שניתן לייחס הבדלי גדילה שנצפו רק לפגמים בשחבור. יש לטפל בכל הזנים באופן דומה לפני הציפוי, כולל אורך וסוג דומים של תנאי גידול ואחסון. אם משתמשים בזנים רגישים לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות ACT1-CUP1 רק בתנאים שבהם זנים אלה גדלים באופן דומה לסוג בר. באופן דומה, עבור רכיב QSP, מומלץ שיהיו רקעים זהים של שמרים ורמות ביטוי זהות של גנים QSP כדי לא להעיב על הפרשנות של התוצאות. כאשר בוחנים את מספר ה- QSPs והכתבים לשימוש, לא מומלץ לבדוק יותר מ -30 זנים בכל פעם בשיטת משכפל הפינים. ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחבר אין מה לחשוף.
תודות
תודה לאהרון הוסקינס ולחברי מעבדת הוסקינס באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על השימוש בזני שמרים ובציוד בדור של איורים 3-5. תודה להרפרט קאור ושינגיאנג פו על הערותיהם התובנות על כתב היד. תודה לסטודנטים, לסגל ולסגל התומכים באוניברסיטת נורת'ווסט במהלך הכתיבה, העריכה והצילומים של מאמר זה. תודה לאיזבל מרסיגן על העזרה בצילום שיטה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 1.5 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 05-408-129 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 2 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 05-408-138 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מ"ל | פישר סיינטיפיק | 07-201-332 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מיקרופלייט תחתון עגול 96 באר | פישר סיינטיפיק | 07-200-760 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| 190 הוכחת אתנול | פישר סיינטיפיק | 22-032-600 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מערכת סינון 500 מ"ל (0.22 ומיקרו; מ) | מוצרים מדעיים של CellTreat | 229707 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| אגר | פישר סיינטיפיק | BP1423-500 | כל אגר בדרגה מולקולרית יעבוד. |
| אוטוקלאב | Tuttnauer | 3870EA | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מבער בונסן | Humboldt | PN6200.1 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מד צפיפות תאים | VWR | 490005-906 | או מכשיר ספקטרלי אחר שיכול למדוד ספיגה ב-595 ננומטר. |
| נחושת גופרתית Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מערכת הדמיה דיגיטלית | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (משמשת לאיור 3), Amersham ImageQuant 800, או פריט דומה מיצרן אחר. |
| תערובת נשירה (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | השתמש בתערובת הנשירה המתאימה לניסוי שלך. יתכן שתשתמש בסמן תזונתי של שמרים גם להפרעת השאילתה שלך. במקרה כזה, תערובת הנשירה צריכה להיות עבור אותו סמן ו-Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| תוכנת כימות פס ג'ל | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (משמש לאיור 5A) או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מצלמת כף יד | Nikon | D3500 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| ליד מכשיר הדמיית ג'ל אינפרא אדום | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (משמש לאיור 5a) או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מהדק בדרגת מעבדה | פישר סיינטיפיק | 05-769-7Q | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מעמד ומהדק בדרגת מעבדה | פישר סיינטיפיק | 12-000-101 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| מוטות ערבוב מגנטיים | פישר סיינטיפיק | 14-513-51 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| משכפל סיכות | VP Scientific | VP 407AH | |
| קובטות חד פעמיות חצי מיקרו | VWR | 97000-590 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| שייקר | JEIO Tech | IST-3075 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| ספקטרופוטומטר | ביו-גל | 80-3000-45 | או כל ספקטופופוטומטר שיכול למדוד את הספיגה ב-600 ננומטר. |
| לוחות מרובעים | VWR | 102091-156 | ניתן להשתמש גם בלוחות עגולים, אם כי הם מאתגרים יותר אם משתמשים במשכפל פינים. |
| צלחת ערבוב | פישר סיינטיפיק | 11-520-16S | או פריט דומה מיצרן אחר. |
| בסיס חנקן שמרים | USBiological Life Sciences | Y2025 | או פריט דומה מיצרן אחר. |
מקורות
- Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
- Lesser, C. F., Guth....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
