מאמר שיטה

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

DOI:

10.3791/63232

⸱

30 ביוני 2022

1College of Arts and Sciences, Northwest University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטציות שהוכנסו בספליקוזום או במצע שלו תרמו באופן משמעותי להבנתנו את המורכבות של תפקוד השחבור. בין אם הן קשורות למחלה או נבחרו באופן פונקציונלי, רבות מהמוטציות הללו נחקרו באמצעות מבחני גדילה באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae (שמרים). בדיקת צמיחת הנחושת הספציפית לשחבור, או בדיקת ACT1-CUP1, מספקת ניתוח מקיף של מוטציה ברמה הפנוטיפית. בדיקת ACT1-CUP1 משתמשת בעיתונאים המעניקים עמידות לנחושת כאשר הם מחוברים כהלכה. לפיכך, בנוכחות נחושת, שינויים בכדאיות השמרים מתואמים לשינויים בייצור mRNA באמצעות שחבור. בניסוי טיפוסי, שחבור השמרים מאותגר עם כתבי שחבור שונים שאינם בקונצנזוס ומוטציה של גורם שחבור מעניין כדי לזהות כל השפעה סינרגטית או אנטיתטית על השחבור. כאן ניתן תיאור מלא של הכנת לוחות נחושת, ציפוי של תאי שמרים והערכת נתונים. מתואר מבחר של ניסויים משלימים, המדגישים את הרבגוניות של כתבי ACT1-CUP1. בדיקת ACT1-CUP1 היא כלי שימושי בארגז הכלים של השחבור הודות לקריאה ישירה של אפקטים מוטציוניים והאפשרויות ההשוואתיות מהמשך השימוש בשטח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השחבור הוא מכונה ביולוגית גדולה המזרזת הסרה של אינטרונים, אזורים שאינם מקודדים ב-RNA שליח מבשר (pre-mRNA)1,2. אפיון ההשפעה של מוטציה נקודתית אחת ב-1 מתוך כמעט 100 חלבונים ו-5 רנ"א שאינם מקודדים הוא לעתים קרובות דו-משמעי כאשר חוקרים את החלבון או הרנ"א בבידוד. את השינוי בתפקוד הרכיב המוטנטי ניתן להעריך בצורה הטובה ביותר in vivo בהקשר של השחבור המלא והמתפקד.

בדיקת צמיחת הנחושת המתוארת כאן היא מדד מהיר של יעילות שחבור ב- Saccharomyces cerevisiae או שמרים ניצנים. בדיקה זו, שפותחה על ידי C.F. Lesser ו- C. Guthrie ופורסמה בשנת 1993, משלבת את קלות העבודה עם אורגניזם מודל פ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית זן שמרים

  1. צור או קבל זן S. cerevisiae שהרקע שלו כולל leu2 ו - cup1Δ. כדי ליצור את הרקע הזה, השתמש בשיטת השמרים המבוססת היטב המשתמשת בליתיום אצטט ובדנ"אחד-גדילי 39.
    הערה: זני שמרים הפלואידים עשויים להכיל עותק אחד, שניים או יותר של CUP1 6,38. עיין במידע גנומי עבור זן השמרים שנבחר בעת תכנון פריימרים נוק-אאוט כדי לאגף את מיקומי הגנים CUP1.
  2. בצע טרנספורמציה של שמרים כדי לשלב את ה- QSP באמצעות שילוב גנומי או על פלסמיד. השתמש בפרוטוקול מבוסס היטב כמו אלה שתוארו במחקרים קודמים40,41,42

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני צמיחה, כמו ACT1-CUP1, דורשים הערכה חזותית והשוואתית של מושבות מרובות. כאן, כל זן גדל לרוויה בן לילה, מדוללל-OD 600 של 0.5, ומצופה על 20 לוחות המכילים טווח של ריכוזי נחושת מ-0 mM עד 1.1 mM CuSO4 (איור 3). טווח זה קטן יותר מזה המופיע בפרוטוקול מכיוון שהוא מאפשר הערכה מלאה של ההשפעה של כתבי QSPs ו- ACT1-CUP1 המשמשים ומתוארים להלן. הלוחות צולמו וקיבלו ניקוד (איור 3 וטבלה משלימה 3).

עבור הניסוי .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACT1-CUP1 הוא מבחן גדילה, ויש לנקוט בזהירות כדי להבטיח שניתן לייחס הבדלי גדילה שנצפו רק לפגמים בשחבור. יש לטפל בכל הזנים באופן דומה לפני הציפוי, כולל אורך וסוג דומים של תנאי גידול ואחסון. אם משתמשים בזנים רגישים לטמפרטורה, יש לבצע בדיקות ACT1-CUP1 רק בתנאים שבהם זנים אלה גדלים באופן דומה לסוג בר. באופן דומה, עבור רכיב QSP, מומלץ שיהיו רקעים זהים של שמרים ורמות ביטוי זהות של גנים QSP כדי לא להעיב על הפרשנות של התוצאות. כאשר בוחנים את מספר ה- QSPs והכתבים לשימוש, לא מומלץ לבדוק יותר מ -30 זנים בכל פעם בשיטת משכפל הפינים. ע.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחבר אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה לאהרון הוסקינס ולחברי מעבדת הוסקינס באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון על השימוש בזני שמרים ובציוד בדור של איורים 3-5. תודה להרפרט קאור ושינגיאנג פו על הערותיהם התובנות על כתב היד. תודה לסטודנטים, לסגל ולסגל התומכים באוניברסיטת נורת'ווסט במהלך הכתיבה, העריכה והצילומים של מאמר זה. תודה לאיזבל מרסיגן על העזרה בצילום שיטה זו.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 1.5 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-129או פריט דומה מיצרן אחר.
צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 2 מ"לפישר סיינטיפיק05-408-138או פריט דומה מיצרן אחר.
צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מ"לפישר סיינטיפיק07-201-332או פריט דומה מיצרן אחר.
מיקרופלייט תחתון עגול 96 בארפישר סיינטיפיק07-200-760או פריט דומה מיצרן אחר.
190 הוכחת אתנולפישר סיינטיפיק22-032-600או פריט דומה מיצרן אחר.
מערכת סינון 500 מ"ל (0.22 ומיקרו; מ)מוצרים מדעיים של CellTreat229707או פריט דומה מיצרן אחר.
אגרפישר סיינטיפיקBP1423-500כל אגר בדרגה מולקולרית יעבוד.
אוטוקלאבTuttnauer3870EAאו פריט דומה מיצרן אחר.
מבער בונסןHumboldtPN6200.1או פריט דומה מיצרן אחר.
מד צפיפות תאיםVWR490005-906או מכשיר ספקטרלי אחר שיכול למדוד ספיגה ב-595 ננומטר.
נחושת גופרתית PentahydrateFisher ScientificLC134051או פריט דומה מיצרן אחר.
מערכת הדמיה דיגיטליתCytiva29399481ImageQuant 4000 (משמשת לאיור 3),  Amersham ImageQuant 800, או פריט דומה מיצרן אחר.
תערובת נשירה (-Leu)USBiological Life SciencesD9525השתמש בתערובת הנשירה המתאימה לניסוי שלך. יתכן שתשתמש בסמן תזונתי של שמרים גם להפרעת השאילתה שלך. במקרה כזה, תערובת הנשירה צריכה להיות עבור אותו סמן ו-Leu
D-GlucoseFisher ScientificAAA1682836או פריט דומה מיצרן אחר.
תוכנת כימות פס ג'לCytiva29-0006-05ImageQuant TL v8.1 (משמש לאיור 5A) או פריט דומה מיצרן אחר.
מצלמת כף ידNikonD3500או פריט דומה מיצרן אחר.
ליד מכשיר הדמיית ג'ל אינפרא אדוםCytiva29238583Amersham Typhoon NIR (משמש לאיור 5a) או פריט דומה מיצרן אחר.
מהדק בדרגת מעבדהפישר סיינטיפיק05-769-7Qאו פריט דומה מיצרן אחר.
מעמד ומהדק בדרגת מעבדהפישר סיינטיפיק12-000-101או פריט דומה מיצרן אחר.
מוטות ערבוב מגנטייםפישר סיינטיפיק14-513-51או פריט דומה מיצרן אחר.
משכפל סיכותVP ScientificVP 407AH
קובטות חד פעמיות חצי מיקרוVWR97000-590או פריט דומה מיצרן אחר.
שייקרJEIO TechIST-3075או פריט דומה מיצרן אחר.
ספקטרופוטומטרביו-גל80-3000-45או כל ספקטופופוטומטר שיכול למדוד את הספיגה ב-600 ננומטר.
לוחות מרובעיםVWR102091-156ניתן להשתמש גם בלוחות עגולים, אם כי הם מאתגרים יותר אם משתמשים במשכפל פינים.
צלחת ערבובפישר סיינטיפיק11-520-16Sאו פריט דומה מיצרן אחר.
בסיס חנקן שמריםUSBiological Life SciencesY2025או פריט דומה מיצרן אחר.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guth....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ACT1 CUP1SplicingSaccharomyces cerevisiaepre mRNA

מאמרים קשורים