מאמר שיטה

שימוש בכתמים אדומים של אליזרין לאיתור אובדן עצם הנגרם כימית בזחלי דגי זברה

DOI:

10.3791/63251

⸱

28 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, השתמשנו בכתמים אדומים של אליזרין כדי להראות שחשיפה לאצטט עופרת גורמת לשינוי במסת העצם אצל זחלי דגי זברה. ניתן להתאים שיטת צביעה זו לחקר אובדן עצם באובדן זחלי דגי זברה הנגרמים על ידי חומרים רעילים מסוכנים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אובדן עצם שנגרם כימית כתוצאה מחשיפה לעופרת (Pb) עלול לגרום למגוון השפעות שליליות על מערכות השלד של בני אדם ובעלי חיים. עם זאת, ההשפעות והמנגנונים הספציפיים בדגי זברה עדיין אינם ברורים. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן והוא יכול לעזור לדמיין את העצם ולהמחיש את מסת המינרלים בשלד. במחקר זה שמנו לנו למטרה לזהות אובדן עצם הנגרם על-ידי אצטט עופרת (PbAc) בזחלים של דגי זברה על-ידי שימוש בכתמים אדומים של אליזרין. עוברי דגי זברה טופלו בסדרה של ריכוזי PbAc (0, 5, 10, 20 מ"ג/ל') בין 2 ל-120 שעות לאחר ההפריה. צביעת שלד שלם בוצעה על זחלים 9 ימים לאחר ההפריה, והשטח המוכתם הכולל כומת באמצעות תוכנת ImageJ. התוצאות הצביעו על כך שהרקמות המינרליות היו מוכתמות באדום, והאזור המוכתם ירד משמעותית בקבוצת החשיפה ל-PbAc, עם שינוי תלוי מינון במינרליזציה של העצם. מאמר זה מציג פרוטוקול צביעה לחקר שינויים בשלד בפגמים בעצמות הנגרמות על ידי PbAc. השיטה יכולה לשמש גם זחלי דגי זברה לאיתור אובדן עצם הנגרם על ידי כימיקלים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אחרונים אישרו כי אוסטאופורוזיס עקב גלוקוקורטיקואידים, מעכבי ארומטאז וצריכת אלכוהול מופרזת נפוצה 1,2. עופרת (Pb) היא מתכת רעילה המצויה בצמחים, באדמה ובסביבות ימיות3. למרות ההשפעות השליליות של Pb על גוף האדם משכו תשומת לב רבה, ההשפעה הבלתי הפיכה שלה על העצם צריך להיחקר עוד יותר. הרעלת עופרת גורמת למגוון רחב של שינויים פתולוגיים הן בשלד המתפתח והן בשלד הבוגר, המשפיעים על פעילויות החיים הרגילות. מחקרים מצאו קשר בין חשיפה כרונית ל-Pb לבין נזק לעצם4, כולל פגיעה במבני העצם5,6, ירידה בצפיפות המינרלים בעצם ואף סיכון מוגבר לאוסטאופורוזיס7.

לרקמה שעברה מינרליזציה יש חשיבות רבה לחוזק העצם8, ותצהיר מטריצת מינרליזציה של העצם הוא מדד קריטי ליצירת עצם9. לאדום אליזרין יש זיקה גבוהה ליוני סידן, וכתמים אדומים של אליזרין הם הליך סטנדרטי להערכת היווצרות עצם10. על פי שיטה זו, רקמה מינרלית מוכתמת באדום, בעוד שכל שאר הרקמות נשארות שקופות. לאחר מכן מכמתים את האזור המוכתם על ידי ניתוח תמונה דיגיטלי11.

דג זברה הוא אורגניזם מודל חשוב הנמצא בשימוש נרחב בגילוי תרופות ובמודלים של מחלות. מחקרים גנטיים בדגי זברה ובבני אדם הראו דמיון במנגנונים הבסיסיים של מורפוגנזה של השלד ברמה המולקולרית12. יתר על כן, בדיקת תרופות או ביו-מולקולות בתפוקה גבוהה אפשרית יותר במצמדים גדולים של דגי זברה מאשר מודלים של מורין, מה שמקל על המחקר המכניסטי של מולקולות פרואוסטאוגניות או אוסטאוטוטוקסיות13. צביעה דיפרנציאלית של השלד בטוטו10 משמשת לעתים קרובות בחקר דיספלסיה של השלד אצל בעלי חוליות קטנים ועוברי יונקים. הכתמה אדומה של אליזרין בוצעה כדי לחקור את הרעילות ההתפתחותית של העצם של כימיקלים בזחלי דגי זברה. כאן, השתמשנו בעופרת כדוגמה לתיאור פרוטוקול לאיתור פגמים בעצמות הנגרמות על ידי אצטט עופרת בזחלי דגי זברה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים לבעלי חיים המפורטים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת Soochow.

1. גידול דגים ואוסף עוברים 14

  1. להאכיל דגים שלוש פעמים בכל יום; ודא שדגי הזברה נשמרים בטמפרטורה של 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור/חושך של 14:10 שעות.
  2. הפרידו בין הדגים הבוגרים הזכרים והנקבות על ידי לוחות בידוד במיכלי ההשרצה ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה בערב.
  3. למחרת בבוקר יש להסיר את לוחות הבידוד בשעה 9:00 ולאסוף את העוברים כעבור שעתיים.
  4. מניחים את העוברים באינקובטור ביוכימי שנשמר בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס לפני הניסוי.

2. חשיפה כימית

  1. מכינים את ציר האם: שוקלים עופרת אצטט טריהידרט (5 גרם), וממיסים אותה במים אולטרה-טהורים (50 מ"ל) תוך ערבוב.
    אזהרה: PbAc רעיל. יש ללבוש מסכות אבק, ביגוד מגן וכפפות מתאימות. בצע את הניסוי מתחת למכסה אדים.
  2. בחר ופזר באופן אקראי עוברי דגי זברה לצלחות נקיות של 6 בארות (30 עוברים לכל באר ב-3 מ"ל של מי רבייה של דגי זברה; ראו טבלה 1 להרכבם). טפלו בעוברים באמצעות PbAc (0, 5, 10, 20 מ"ג/ליטר) בין 2 ל-120 שעות לאחר ההפריה (hpf).
    הערה: הריכוזים של PbAc נבחרו על פי ניסויי מציאת טווח המינון. התוצאות הראו כי LC50 של אצטט עופרת על עוברי דגי זברה היה 41.044 מ"ג/ליטר ב-120 כ"ס. לפיכך, הריכוז הגבוה ביותר נקבע למחצית מה- LC50 וסדרה של פתרונות שהוכנו על ידי דילול פי 2.
  3. להאכיל את הזחלים פעמיים ביום מ 5 ימים לאחר ההפריה (dpf). שמור על עוברי דגי הזברה ב 28.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 14:10 שעות.
  4. רעננו את המדיום נטול ה-Pb (מי רבייה של דגי זברה) כל 24 שעות עד 9 dpf.
    הערה: עם השלמת הניסויים, כל התמיסות המכילות עופרת נשפכו למיכל נוזלי ייעודי וטופלו על ידי מרכז ניהול הניסויים.

3. מכתים אדומים של אליזרין

הערה: יש ללבוש מסכות אבק, ביגוד מגן וכפפות מתאימים במהלך כל תהליך ההכתמה. ההרכבים של כל הפתרונות מוצגים בטבלה 1.

  1. שלבי צביעה ספציפיים
    הערה: תהליך הצביעה בוצע בצלחת של 24 בארות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת כל תמיסה, הניחו את צלחת 24 הבארות על השולחן המטלטל שנקבע במהירות נמוכה.
    1. הסר 10 זחלי דגי זברה באופן אקראי מכל קבוצה ב-9 dpf וקבע את הדגים ב-1 מ"ל של 2% פרפורמלדהיד/1x מלח עם חציית פוספט למשך שעתיים.
    2. דקטו את התמיסה ושטפו את זחלי דגי הזברה ב-100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2 למשך 10 דקות.
    3. דקנט את התמיסה ודגירה של הזחלים בתמיסות הבאות למשך 5 דקות כל אחת לצורך פירוק: תמיסת אתנול נטול מים (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7.5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7.5), ו-25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7.5).
    4. לרוקן את התמיסה, להסיר את הפיגמנט על ידי הלבנה עם תמיסה המורכבת של 3% H 2 O2ו 0.5% KOH, ולצפות אחת ל 10 דקות עד פיגמנט מוסר לחלוטין.
    5. שטפו את זחלי דגי הזברה מספר פעמים עם 25% גליצרין/0.1% KOH למשך 10 דקות כל אחד עד שלא יהיו בועות.
      הערה: חשוב להימנע מבועות; אחרת, הבועות בגוף דג הזברה יופיעו כשדה ראייה שחור מתחת למיקרוסקופ, מה שישפיע על תצפיות וניתוח כמותי.
    6. הכתימו את הזחלים על ידי השרייה ב-1 מ"ל של 0.01% אליזרין למשך 50 דקות.
    7. נטרלו את התמיסה והוסיפו 1 מ"ל של 50% גליצרין/0.1% KOH למשך 10 דקות כדי לנקות את הרקע. אחסנו את הדגים ב-50% גליצרין/0.1% KOH טריים לתצפית שלאחר מכן.

4. רכישת תמונה

  1. מעבירים זחל אחד על מגלשת הזכוכית בכל פעם, ומשאירים את הזחל במרכז טיפת הנוזל.
  2. התבונן בזחלים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  3. הפעל את המצלמה, פתח את התוכנה (עיין בטבלת החומרים) ושמור על הגדרות ברירת המחדל.
  4. לחץ על AE, ובחר זמן חשיפה מתאים (60 מילישניות בניסוי זה) כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר.
  5. צלם את כל התמונות תחת אותן הגדרות. שמור את התמונות בתבנית .tif לניתוח מאוחר יותר.

5. ניתוח תמונות

הערה: ראה את הקובץ המשלים לדוגמה עם קבוצה של גרפים לדוגמה לניתוח תמונות.

  1. לחץ פעמיים על סמל ImageJ ונתח את התמונות שנשמרו בשלב 4.5.
    1. לחץ על קובץ | פתח כדי לפתוח את התמונות שנשמרו בשלב 4.5.
    2. לחץ על תמונה | הקלד, בחר 8 סיביות.
    3. לחץ על ערוך | הפוך.
    4. לחץ על נתח | כייל, בחר OD לא מכויל בממשק הקופץ, סמן את כיול כללי בפינה השמאלית התחתונה של הממשק התחתון ולחץ על אישור.
    5. לחץ על נתח | קנה מידה מוגדר | לחץ כדי להסיר קנה מידה בממשק הקופץ, סמן את כללי למטה ולחץ על אישור.
    6. לחץ על נתח | קבעו מידות, בחרו באזור הפריט בממשק הקופץ, בדקו את ההגבלה לסף למטה (למדידת הטווח שנבחר בלבד) ולחצו על הלחצן 'אשר'.
    7. לחץ על תמונה | התאמה| סף, החלק את המחוון באמצע הממשק הנפתח כדי לבחור את הסף המתאים (שנה את הסף לכל תמונה) כך שכל היעדים לבדיקה בתמונה אחת ייבחרו, ולחץ על Set.
    8. לחץ על נתח | למדוד. רשום את התאריכים של כל קבוצה.
  2. השתמש ב- ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של Tukey כדי לנתח את ההבדלים, והגדר את רמת המובהקות ב - p < 0.001 (***).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צביעה אדומה של אליזרין היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים במינרליזציה של העצם בזחלי דגי זברה. במחקר זה ראינו כי ל-PbAc היו השפעות שליליות על זחלי דגי זברה, כולל מוות, מום, ירידה בקצב הלב וקיצור אורך הגוף. יתר על כן, אזורי השלד המינרלי של זחלי דגי זברה הוערכו כדי לבחון אובדן עצם הנגרם על ידי PbAc. ב-9 dpf (איור 1A), עצמות רבות של שלד הראש עוברות מינרליזציה ולכן מוכתמות באדום, כגון פרספנואיד (PS), אופרקל (OP), צרטובנצ'יאל (CB) ונוטוקורד (NC). לעומת זאת, אוטוליטים (OT) (מבנים לא גרמיים) נרא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה הוא מודל מתאים לחקר מחלות מטבוליות של העצם. בהשוואה למודלים של מכרסמים, מודלים של דגי זברה מהירים יחסית להתבססות, ומדידת חומרת המחלה קלה יותר. בזחלי דגי זברה מסוג בר, מינרליזציה של שלד הראש מתרחשת ב-5 dpf והשלד הצירי ב-7 dpf15. לפיכך, עצמות גולגולת כגון PS, OP, CB ו- NC מפותחות היטב ב 9 dpf. לאחר שהזחלים הושחתו לחלוטין והולבנו, הרקמות הרכות פונו, והתוצאה הייתה מראה שקוף של גוף הדג. ריאגנט הכתמים האדום של אליזרין נוסף כדי להכתים ולדמיין את עצמות המינרלים בדגי זברה באדום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81872646; 81811540034; 81573173) ופיתוח התוכנית האקדמית העדיפה של מוסדות ההשכלה הגבוהה של ג'יאנגסו (PAPD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 M Tris-HCl (pH=7.5)Solarbio, בייג'ינג, סין21לעיכוב
4% Paraformaldehyde Fix SolutionBBI, שנחאי, סין14תיקון רקמות
10x PBS bufferBBI, שנחאי, סין15לתיקון
35% H2O2Yonghua, ג'יאנגסו, סין8הסרת פיגמנט
50 מ"ל צינור צנטריפוגהAKX, ג'יאנגסו, סין4
95% אתנול נטול מיםאנוקס, ג'יאנגסו, סין2מבטל
אליזרין אדום (טוהר 99.5%)סולארביו, בייג'ינג, סין1מכתים
חממה ביוכימיתYiheng, שנחאי, סין3גידול עוברי דג זברה
בקנה מידה אלקטרוניSartorius, גרמניה5שקילת חומרי הגלם המוצקים
גליצרין (טוהר 99.5%)BBI, שנחאי, סין7אחסון הדגים המוכתמים
ImageJ (תוכנה)ארה"ב9 ניתוח דיגיטלי
KOH (טוהר 99.9%)סיגמא, אמריקה10תמיסת הלבנה
עופרת אצטט טריהידרט (טוהר 99.5%)אלאדין, שנחאי, סין11
MgCl2 (טוהר 99.9%)אלאדין, שנחאי, סין12פתרון ניקוי
NIS-Elements F (תוכנה)ניקון, יפן13התבוננות וצילום
תמונות צינורAKX, ג'יאנגסו, סין18הסרת עוברים וצלחות תמיסה
(24 בארות)קורנינג, אמריקה17מיכל להכתמת
צלחות עוברים (6 בארות)קורנינג, אמריקה16מיכל לגידול עוברים
רועדBeyotime, סין19ערבוב התמיסה
מיקרוסקופ סטריאוניקון, יפן20התבוננות וצילום
זברהמרכז ניסויים דג זברה של אוניברסיטת סוצ'ו, סוג'ואו, סין22חיית ניסוי
שולחן דג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageJ

מאמרים קשורים