ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Alexander J. Bolt; Linh D. Do; Maryam Raeeszadeh-Sarmazdeh

doi:10.3791/63263

מאמר שיטה

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

DOI:

10.3791/63263

⸱

30 במרץ 2022

Alexander J. Bolt^*¹ , Linh D. Do^*¹ , Maryam Raeeszadeh-Sarmazdeh¹

¹Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור התג שלו, דיאליזה, והפעלה מועסקים כדי להגדיל את התשואות של מסיס, מטריצה פעילה metalloproteinase-3 ביטוי חלבון תחום קטליטי בחיידקים. שברי חלבון מנותחים באמצעות ג'ל SDS-PAGE.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטריצה metalloproteinases (MMPs) שייכים למשפחה של פרוטאזים מצינזין עם תפקידים מרכזיים מטריצה חוץ תאית (ECM) השפלה ושיפוץ, כמו גם אינטראקציות עם מספר גורמי גדילה וציטוקינים. ביטוי יתר של MMPs ספציפיים אחראי במספר מחלות כגון סרטן, מחלות ניווניות ומחלות לב וכלי דם. MMPs היו מרכז תשומת הלב לאחרונה כמטרות לפתח טיפולית שיכולה לטפל במחלות בקורלציה MMP overexpression.

כדי ללמוד את מנגנון ה- MMP בפתרון, נדרשות שיטות ביטוי וטיהור חלבונים רקומביננטיות מקלות וחזקות יותר לייצור MMPs פעילים ומסיסים יותר. עם זאת, התחום הקטליטי של רוב MMPs לא יכול לבוא לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli) בצורה מסיסת בשל חוסר מכונות פוסט-טרנסלטיות, בעוד מערכות ביטוי יונקים הם בדרך כלל יקרים ויש להם תשואות נמוכות יותר. גופי הכללת MMP חייבים לעבור את התהליך המייגע והמייגע של טיהור נרחב ושיפוץ מחדש, מה שמפחית באופן משמעותי את התשואה של MMPs בקונפורמציה מקומית. מאמר זה מציג פרוטוקול באמצעות Rosetta2(DE3)pLysS (להלן R2DP) תאים כדי לייצר מטריצה metalloproteinase-3 תחום קטליטי (MMP-3cd), המכיל N-מסוף His-tag ואחריו pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) לשימוש בטיהור זיקה. תאי R2DP משפרים את הביטוי של חלבונים אאוקריוטים באמצעות פלסמיד עמיד בפני כלורמפניקול המכיל קודונים נדירים בדרך כלל במערכות ביטוי חיידקיות. בהשוואה לקו התא המסורתי המועדף על ביטוי חלבון רקומביננטי, BL21(DE3), טיהור באמצעות זן חדש זה שיפר את התשואה של Hisx6-pro-MMP-3cd מטוהר. לאחר ההפעלה וההתפלה, התחום המקצועי נבקע יחד עם ה- N-terminal His-tag, ומספק MMP-3cd פעיל לשימוש מיידי באינספור יישומי הפריה חוץ גופית . שיטה זו אינה דורשת ציוד יקר או חלבוני היתוך מורכבים ומתארת ייצור מהיר של MMPs אנושיים רקומביננטיים בחיידקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב החלבונים האוקריוטים המורכבים עוברים שינויים פוסט-טרנסליים מורכבים לאחר ההבעה, הדורשים קיפול חלבונים בסיוע גבוה וגורמים משותפים כדי להיות ^{פונקציונליים1}. ייצור כמויות גדולות של חלבון אנושי מסיס בפונדקאי חיידקי נותר אתגר משמעותי בשל עלויות גבוהות והיעדר שיטות ביטוי וטיהור חזקות, אפילו לניסויי מעבדה בקנה מידה קטן ^יותר2,3. MMPs, אנדופטידסים אנושיים עם משקל מולקולרי גדול, מתבטאים בדרך כלל כגופי הכללה בלתי מסיסים כאשר הם באים לידי ביטוי ב- E. coli. הפקת MMPs אנושיים מסיסים מובילה לעתים קרובות לתהליך solubilization מייגע וגוזל זמן ^רב4.

ל- MMPs יש תפקידים קריטיים הן בתהליכים פיזיולוגיים והן בתהליכים פתוגניים. MMPs אנושיים הם משפחה של 23 אנדופטידסים אבץ, מסווגים לפי מבנה ומצע ספציפיים, ובאים לידי ביטוי דיפרנציאלי למרות תחום קטליטי שמור מאוד ^5,6. MMPs מופרשים כמו זימוגנים לא פעילים, מוסדר באמצעות הפעלה פוסט-טרנסלטית ומעכבים אנדוגני שלהם, מעכבי רקמות של metalloproteinases (TIMPs)7,8,9,10. למרות שהוכרו בתחילה על תפקידם במחזור ECM, MMPs היו מעורבים גם בפיתוח, מורפוגנזה, תיקון רקמות, ^{ושיפוץ8}. Dysregulation של MMPs נקשרה באופן בולט לסרטן יחד עם מחלות ניווניות, לב וכלי דם, פיברוטיות, בין מחלות ^{אחרות5,7}.

הפיתוח של שיטות ייצור MMP חזקות בקנה מידה גדול הוא קריטי כדי להבטיח את הצלחתם של מחקרים עתידיים של מנגנוני MMP באמצעות בדיקות ביוכימיות ומבוססות תאים. MMPs שונים התבטאו בעבר ^{בחיידקים11}, כולל MMPs מתויגים Hisx6, מבלי לשנות את פעילות ה- MMP12,13,14,15. עם זאת, שיטות אלה כוללות צעדים מייגעים וארוכים שעשויים להיות קשים לשכפול.

תאי יונקים יכולים לשמש גם כדי לבטא חלבונים אנושיים רבים ושונים תוך הבטחת השינויים הפוסט-טרנסליים ^{הנכונים16}. למרות שמערכת הביטוי של היונקים היא בחירה אידיאלית לייצר חלבונים אנושיים רקומביננטיים עם שינויים נכונים לאחר התרגום, החסרונות העיקריים של שיטה זו הם תשואות נמוכות ראשוניות, מדיה צמיחה יקרה ורגנטים, צירי זמן ארוכים כדי להגיע לקווי ביטוי יציבים, וסיכון לזיהום עם מינים אחרים כגון פטריות או ^{חיידקים2,11} . יתר על כן, ייצור MMP בשורות תאי יונקים מניב זיהומים מחלבונים תאיים הקשורים כגון TIMPs או ^{פיברונקטין11}. שלא כמו צמיחת התאים האיטית שנצפתה בתאי יונקים, מערכת הביטוי החיידקית מציעה ייצור חלבון בקנה מידה גדול בפרק זמן קצר יחד עם מדיה פשוטה יותר ודרישות צמיחה. עם זאת, בשל היעדר חלבונים תאיים אחרים הקשורים (כלומר, TIMPs) במערכות ביטוי חיידקי, MMPs פעיל בריכוזים גבוהים יותר כפופים השפלה באמצעות autoproteolysis, וכתוצאה מכך תשואה MMP ^ירודה17.

מאמר זה מתאר שיטה מפורטת לביטוי חיידקי, טיהור והפעלה של Hisx6-pro-MMP-3cd רקומביננטי באמצעות E. coli כפונדקאי ביטוי בשל סבירותו, פשטותו, והצלחה בהפקת תשואות גבוהות יותר של MMPs2,3,18. מאז E. coli חסר את מכונות קיפול חלבון ועיבוד פוסט-טרנסלנטי הנדרש עבור MMPs רקומביננטי וחלבונים מורכבים אחרים, זנים רבים E. coli תוכננו כדי להתגבר על מגבלות אלה, מה שהופך את E. coli פונדקאי מתאים יותר לביטוי של MMP-3cd אנושי רקומביננטי, ^19,20 . לדוגמה, זן R2DP המשמש במחקר זה משפר את הביטוי האוקריוטי על ידי אספקת פלסמיד עמיד בפני כלורמפניקול המכיל קודונים המשמשים לעתים רחוקות E. coli.

כפי שמתואר בפרוטוקול זה, לאחר הבעת יתר של גופי הכללה טהורים יחסית מווקטור pET-3a (איור 1) בתאי R2DP, חלבוני Hisx6-pro-MMP-3 קטליטי (MMP-3cd) מופקים ומנוטרלים4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 היה מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה תג זיקה. לאחר refolding ודיאליזה, pro-MMP-3cd (זימוגן) הופעל על ידי אצטט 4-aminophenylmercuric (APMA), וניתוח SDS-PAGE משמש להערכת התשואות ואת הצורך בטיהור ^נוסף5,21. פרוטוקול זה מתאר ביטוי, טיהור והפעלה של MMP-3cd מסיס כדוגמה. עם זאת, הוא עשוי לשמש גם כמדריך לביטוי של MMPs ופרוטאזים אנושיים אחרים עם ביטוי דומה, ומנגנוני הפעלה (איור 2). עבור חלבונים אחרים שאינם MMP-3cd, הקורא מומלץ לקבוע קומפוזיציות חיץ אופטימליות ושיטות עבור חלבון היעד שלהם לפני ניסיון פרוטוקול זה.

figure-introduction-1
איור 1: מפת פלסמיד של הפלסמיד pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. וקטור pET-3a כולל גן עמידות אמפיצילין. רצף תגים מסוג N-terminal Hisx6 משוכפל לתוך וקטור מבוסס pET-3a, כולל פרו-MMP-3cd, כדי להניב את המבנה pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd תחת שליטה של מקדם T7 בין אתרי ההגבלה BamHI ו- NdeI. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-introduction-2
איור 2: ביטוי חיידקי של פלסמיד פרו-MMP-3cd, טיהור, שכפול מחדש והפעלה. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd פלסמיד הפך לתאי BL21(DE3) או R2DP. 1.2: ביטוי חלבון פרו-MMP-3cd הושרה באמצעות IPTG. 1.3: תמוגה כימית ו sonication משמשים כדי לחלץ Hisx6-pro-MMP-3cd חלבונים כי הם בעיקר מסיסים ונמצאים בגופי ההכללה. אוריאה שימשה כדי denature ו solubilize חלבון מגופי הכללה. 2.1. חלבון Hisx6-pro-MMP-3cd מטוהר באמצעות טיהור כרומטוגרפיה של זיקה. 3. Hisx6-pro-MMP-3cd המנוטרל נפרש לאט במהלך דיאליזה באמצעות הסרה הדרגתית של אוריאה מהחוצץ. 4. לבסוף, חלבון MMP-3cd משוחזר הופעל באמצעות APMA על ידי הסרת תחום N-מסוף פרו פפטיד. APMA מוסר מאוחר יותר מהפתרון באמצעות התפלה. המספרים תואמים למקטעי פרוטוקול המתארים שלבים אלה. קיצורים: MMP-3cd = מטריקס metalloproteinase-3 תחום קטליטי; APMA = אצטט 4-אמינופניל-מרקורי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ביטוי MMP

שיבוט וטרנספורמציה של pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd לתאי R2DP
1. לעכל את pET-3a plasmid (ראה את טבלת החומרים) עם אנזימי הגבלה NdeI ו BamHI ב Digest Buffer (ראה טבלת החומרים). בנפח תגובה כולל של 40 μL, להוסיף 4 μL של מאגר תקציר, 33 μL של 100 ng / μL plasmid, ו 1.5 μL של כל אנזים הגבלה ולאפשר את התגובה להמשיך ~ 2 שעות עד להשלמת ב 37 °C (37 °F).
2. בצע תגובת PCR ברצף MMP-3cd כדי להוסיף תג שלו N-מסוף. השתמש ב-25 μL של תערובת PCR (ראו טבלת החומרים), 2.5 מיקרו-ל' של 10 מיקרומטר פריימרים (איור S1 משלים) ו-1.25 μL של רצף ההוספה של 100 ננוגרם/μL. הוסף מים סטריליים לנפח תגובה סופי של 50 μL.
3. הפעל את מוצר ה- PCR ואת הווקטור המעוכל על ג'ל אגרוז 1%. טהרו את רצועות הג'ל באמצעות ערכת התאוששות ג'ל (ראו טבלת החומרים) לפי פרוטוקול היצרן.
4. שכפלו את מוצר ה-PCR המוגבר לווקטור המעוכל בין אתרי ההגבלה של NdeI ו-BamHI באמצעות תערובת הרכבות DNA (ראו טבלת החומרים). השתמש בכלים מקוונים כדי לקבוע את הנפח הנדרש של וקטור ההוספה והחיתוך עבור נפח תגובה כולל של 15 μL.
5. להפשיר aliquot 50 μL של תאים בעלי יעילות טרנספורמציה גבוהה (ראה טבלת החומרים) על קרח עד להפשרה. לפני המלחמה SOC צמיחה בינוני (ראה את טבלת החומרים) עד 37 °C (LB-אמפיצילין) לוחות (LB-amp) (ראה את טבלת החומרים).
6. הוסף 1-2 μL של pET-3a-Hisx6-פרו-MMP-3cd תגובת הרכבה כדי aliquot 50 μL. דגירה על קרח במשך 30 דקות.
7. הלם חום התאים על ידי דגירה ב 42 °C (50 °F) עבור 30 s. דגירה על קרח במשך 2 דקות.
8. הוסף 950 μL של מדיום צמיחה SOC לכל תערובת שנאי. יש לנער למשך שעה אחת ב-250 סל"ד וב-37°C (37°F).
9. צלחת 100 μL של שנאים על לוחות מגבר LB ודגרה לילה ב 37 °C (60 °F).
10. לחסן כל מושבה מבודדת ב 10 מ"ל של LB Amp בינוני. יש לנער למשך הלילה ב-250 סל"ד וב-37 מעלות צלזיוס.
11. חלץ דנ"א פלסמיד לפי פרוטוקול היצרן עבור ערכת ההכנה הזעירה (ראה טבלת החומרים). אשרו את רצף המבנה באמצעות פריימרים T7 קדימה והפוך (איור S1 משלים).
  הערה: ניתן לאחסן את ה- DNA של מבנה PET-3a-Hisx6-Pro-MMP-3cd ב-20 °C (60 °F). כאשר אתה מוכן, המשך בהפיכה לתאי R2DP.
12. להפשיר אחד 20 μL aliquot של תאי R2DP (ראה את טבלת החומרים) על קרח במשך 2-5 דקות. צמיחת SOC לפני המלחמה בינונית לטמפרטורת החדר ולוחות LB Amp ^CamR עד 37 °C (ראה טבלת החומרים).
13. הוסף 1 μL של 100 ng/ μL רצף מאושר pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd כדי aliquot 50 μL. מערבבים בעדינות לערבב ולהחזיר את הצינור לקרח.
14. לדגור על הצינור על קרח במשך 5 דקות.
15. הלם חום התאים על ידי דגירה ב 42 °C (50 °F) בדיוק 30 s. אל תרעד.
16. מניחים את התאים על קרח במשך 2 דקות.
17. הוסיפו 80 μL של מדיום SOC בטמפרטורת החדר לתערובת השנאים. יש לנער למשך שעה אחת ב-250 סל"ד וב-37°C (37°F).
18. צלחת את השנאים על צלחות LB Amp ^CamR ודגור לילה ב 37 °C (50 °F).
צמיחה ואינדוקציה
1. לחסן מושבה אחת, מבודדת של R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd טרנספורמט מצלחת LB Amp ^CamR ב 10 מ"ל של מדיה LB Amp ^CamR ב 37 °C (57 °F). יש לנער ב-250 סל"ד למשך הלילה (כ-16 שעות). שמור aliquots מכל תרבות ולהכין 40% (v /v) גליצרול (ראה טבלת החומרים) מניות אם תרצה.
2. לכל תרבות לילה, לחסן בקבוקון 1 L המכיל 500 מ"ל של LB Amp ^CamR בינוני לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (_OD600) של 0.05-0.1.
  הערה: זה אמור להחזיר את התאים לצמיחה לוגריתמית.
3. מדוד את _OD600 במספר נקודות זמן, בדרך כלל עבור 3-4 שעות, עד שהוא נופל בין 0.4 ל 0.6.
4. לפני האינדוקציה, aliquot שבר של תרבות לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל (ראה את טבלת החומרים) ולתייג אותו שבר לא מושרה. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F) לניתוח ג'ל. אם אינך מפעיל ג'ל SDS-PAGE, דלג על שלב זה והמשיך לשלב 1.2.5.
5. לגרום את התרבויות לריכוז סופי של 1 mM באמצעות 1 M איזופרופיל-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) מלאי (IPTG) (ראה את טבלת החומרים). ממשיכים לדגור בשייקר של 37 °C (37 °F) למשך 3-4 שעות נוספות.
  הערה: במהלך הביטוי, הקורא צריך לקבוע את _OD600 האופטימלי בזמן האינדוקציה ואת ריכוז IPTG. אם התשואה יורדת באופן משמעותי לאחר הטיהור, ריכוז imidazole במאגרי טיהור עשוי לדרוש התאמה, או גלולה התא ייתכן שיהיה צורך sonicated עוד יותר.
6. לפני צנטריפוגת התרבויות, aliquot שבריר של תרבות לתוך צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל שני ולתייג אותו שבר המושרה. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F) לניתוח ג'ל. אם אינך מפעיל ג'ל SDS-PAGE, דלג על שלב זה והמשיך לשלב 1.2.7.
7. צנטריפוגה תרבית התא בבקבוקים חרוטיים 250 מ"ל (ראה טבלת החומרים) במהירות המרבית ו 4 °C (60 °F) במשך 10 דקות.
8. חזור על שלב 1.2.7 עד שהתרביות יתגלו לחלוטין.
  הערה: השהה: כדורי תא ניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר לעיבוד נוסף. אחרת, דלג על שלב זה והמשך לשלב 1.3.1.
מיצוי גוף הכללה ו solubilization
הערה: הכינו אוריאה טרייה של 10 מ' אוריאה, רצוי לא לפני יום אחד מראש, תוך ערבוב יסודי עד להמסה מלאה. אין לחמם או אוריאה אוטומטית; לאחסן אותו בטמפרטורת החדר.
1. Resuspend את הכדור (משלב 1.2.8) במאגר תמוגה (ראה את טבלת החומרים). לכל גרם של גלולה, להוסיף 3 מ"ל של מאגר תמוגה resuspend על ידי מערבולת או pipetting. לנער לילה ב 4 °C (7 °F).
2. הוסף 1.25 מ"ל של 10% (w/v) נתרן deoxycholate (ראה טבלת החומרים) לכל 1 L של תרבות. יש לנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-150 סל"ד.
3. הוסף 10 μL של DNase I (ראה את טבלת החומרים) לכל 1 L של תרבות. יש לנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב-150 סל"ד.
4. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 × גרם ו 4 °C (60 °F).
5. מניחים בצד שבריר של MMP Lysed לניתוח ג'ל. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 1.3.6.
  הערה: לאחר צנטריפוגה, הכדור עשוי להיות מחרוזת ולא ארוז בצורה קומפקטית, מה שהופך אותו מסוכן להשליך את supernatant. אם זהו המקרה, דלג על שלב 1.3.6 והמשך לשלב 1.3.7.
6. זרוק את הסופר-נרטיב מהדגימות הצנטריפוגליות.
  הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה ואת כדורי התא קפוא ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר. אחרת, דלג על שלב זה והמשך לשלב 1.3.7.
7. Resuspend את הכדור בתרבית 100 מ"ל / L של חוצץ גוף הכללה (ראה את טבלת החומרים) על ידי צנרת למעלה ולמטה.
8. במהלך sonication, לשמור את הדגימות על קרח כדי למנוע התחממות יתר. Sonicate כל מדגם עבור 6 מחזורים של 15 s, פלט 5, ו 50% דופק. אפשר תקופות מנוחה של 15 שניות לקירור בין מחזורים.
  הערה: במידת הצורך, להעביר את הדגימות לתוך צינורות חרוטיים 50 מ"ל עבור צנטריפוגה נוספת (ראה את טבלת החומרים). צנטריפוגה ל-10 דקות ב-13,000 × גרם ו-4 מעלות צלזיוס.
9. מניחים בצד שבריר של MMP Sonicated לניתוח ג'ל. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 1.3.11.
10. תבדוק את הכדור. אם stringy, חזור על שלבים 1.3.8-1.3.10. אם הכדור הוא קומפקטי, להשליך את supernatant ולהמשיך לשלב 1.3.12.
  הערה: Sonication במאגר גוף הכללה ניתן לחזור על עצמו כדי לשחזר יותר חלבון מפסולת התא lysed. עם זאת, יותר מדי sonication יכול לגרום גזירה, אשר פוגע בתשואה MMP. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, ואת כדורי התא ניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר.
11. Resuspend כל גלולה מתרבית 1 L ב 5 מ"ל של מאגר Solubilization (ראה את טבלת החומרים) על ידי צינורות. דגירה במשך 30 דקות לפחות על קרח כדי לאפשר לחלבונים להתפחות.
12. מניחים בצד שבריר של MMP Solubilized לניתוח ג'ל. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 1.3.14.
13. צנטריפוגה התאים במשך 10 דקות ב 13,000 × גרם ו 4 °C (60 °F) לא להשליך את SUPERNATANT.
14. אם גלולה נוצרת/ נשארת לאחר צנטריפוגה, יוצקים את supernatant לתוך צינור חרוט נפרד 50 מ"ל. Resuspend את הכדור עוד 5 מ"ל של מאגר Solubilization (לכל 1 L של תרבות) על ידי צנרת למעלה ולמטה.
15. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 13,000 × גרם ו 4 °C (50 °F) לא להשליך את SUPERNATANT.
16. חזור על שלבים 1.3.13 ו 1.3.14 עד קצת ללא צורות גלולה לאחר צנטריפוגה או רק משקעים אפורים נשאר. תאחדו את הסופר-נאטנטים. להשליך או לאחסן את הכדור ב -80 °C (80 °F) עבור sonication נוסף.

2. טיהור MMP וכיסוי מחדש

טיהור זיקה לתגית שלו (HT)
1. לפי פרוטוקול היצרן, מלאו עמודת זרימת כבידה (ראו טבלת החומרים) בשרף Ni-NTA מעורבב היטב (ראו טבלת החומרים). אפשרו לשרף להתיישב ולהיפרד ממאגר האחסון כך שקו נפרד ייווצר בין שתי השכבות.
  הערה: לעולם אל תאפשר לשרף להתייבש, מכיוון שהאוויר יחדור לשרף ויפגע בתפוקת החלבון. בין שימושים, בצע את הליך התחדשות השרף המתואר בסעיף 2.2.
2. אפשר למאגר האחסון להתנקז. מלא את העמודה בשני כרכים של מיטת שרף של מאגר שיווי משקל HT.
3. רוקנו את מאגר שיווי המשקל של HT והשליכו אותו. כאשר העמוד מתרוקן, צנטריפוגות תמצית החלבון ב 13,000 × גרם במשך 1 דקה לסנן לסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר (ראה את טבלת החומרים).
4. החלף את מיכל הפסולת עבור צינור חרוטי 50 מ"ל שכותרתו HT Flowthrough. מוסיפים את תמצית החלבון המוכנה לעמודה.
5. החל מחדש את הזרימה כדי למקסם את האיגוד.
6. מניחים בצד שבר של Flowthrough לניתוח ג'ל. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 2.1.7.
7. מיד לשטוף את השרף עם 15 מ"ל של HT לשטוף חוצץ (ראה את טבלת החומרים). לאסוף את הזרימה בצינורות חרוטיים 15 מ"ל (ראה את טבלת החומרים) שכותרתו HT לשטוף.
  הערה: ערכי ספיגה ב- 280 ננומטר (A280) התקבלו באמצעות ספקטרופוטומטריה ושימשו יחד עם מקדם משקל מולקולרי ומקדם הכחדה, ε, להערכת ריכוזי חלבון. עבור Hisx6-pro-MMP-3cd, המשקל המולקולרי הוא 29.86 kDa, ε הוא 34.38 ^M-1 ס"^{מ-1 ס"מ.1}.
8. ריקון נגד מאגר כביסה HT, למדוד ולהקליט את A280. חזור על שלבים 2.1.7 ו- 2.1.8 עם שברי כביסה נוספים. לאחר A280 מתקרב בסיסי זיהומים כבר ממוזער, להמשיך לשלב 2.1.9.
9. מניחים בצד חלק קטן מ-Wash Fraction לניתוח ג'ל. חזור על הפעולה עבור שברי כביסה מרובים. אחסן את השברים בטמפרטורה של -80 °C (60 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 2.1.10.
10. מיד לברוח חלבונים מתויגים שלו על ידי הוספת 5 מ"ל של HT Elution Buffer (ראה את טבלת החומרים). לאסוף את הזרימה כמו שברי 0.5-1 מ"ל בצינורות microfuge שכותרתו HT Elution.
11. מניחים בצד שבר של Elution לניתוח ג'ל. חזור על הפעולה עבור שברי הארכה מרובים. אחסן את השברים בטמפרטורה של -80 °C (60 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 2.1.12.
12. אם A280 הוא >0.3 מ"ג / מ"ל, לדלל את השבר באמצעות מאגר שיווי משקל HT (ראה את טבלת החומרים).
  הערה: יש לדלל את השבר המנוטרל ל- A280 של 0.3 מ"ג / מ"ל או פחות כדי למנוע משקעים במהלך דיאליזה. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת השברים במאגר קפוא ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר. אחרת, דלג על שלב זה והמשך לשלב 2.2.1.
התחדשות שרף
1. לשטוף את השרף עם עשרה כרכים במיטת שרף של מאגר התחדשות HT (ראה טבלת החומרים) ועשרה נפחי מיטת שרף של מים סטריליים.
2. יש לאחסן את השרף כתסיסה של 50% ב-20% (v/v) אתנול במים.

3. קיפוח מחדש של חלבונים

הערה: עבור אמצעי אחסון קטנים יותר, ניתן להשתמש בקלטות דיאליזה בסיכון נמוך יותר לאובדן דגימה. צינורות דיאליזה נדרשים אם נעשה שימוש בנפחים גדולים יותר (עיין בטבלת החומרים).

דיאליזה
הערה: ריכוז החלבון האופטימלי לדיאליזה הוא ~ 0.3 מ"ג / מ"ל. אם משקעים משמעותיים מתרחשים במהלך דיאליזה, להפחית את שיפוע ריכוז אוריאה בין כל דיאליזה באמצעות שיטת דיאליזה צעדים ולהוסיף צעדי ביניים נוספים (למשל, מ 6 M ל 5 M, ולאחר מכן 5 M עד 4 M, במקום לדלג על שלב 5 M). כמו מחזורי הפשרה להקפאה לפגוע במבנה הסלולר והחלבון, זה חיוני כדי למזער את ההפסקות בפרוטוקול.
1. לפי פרוטוקול היצרן, השתמש בכמות המתאימה של צינורות דיאליזה בהתאם לנפח של דגימות שבר Elution .
2. הטביעו את שברי ה- MMP המנוטרלים בצינורות דיאליזה ב- 1 L של מאגר דיאליזה 1 (עיין בטבלת החומרים). מערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבל מגנטי לא פחות מ 8 שעות ב 4 °C (60 °F).
3. העבר ל- 1 L של מאגר דיאליזה 2 (עיין בטבלת החומרים). מערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבל מגנטי לא פחות מ 8 שעות ב 4 °C (60 °F).
4. העבר ל- 1 L של מאגר דיאליזה 3 (עיין בטבלת החומרים). מערבבים את הצינורות ותכולתם על מערבל מגנטי לא פחות מ 8 שעות ב 4 °C (60 °F).
5. העבר את הדגימה לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מ"ל וסמן אותם כ - MMP דיאליזד.
6. תבדוק את הצינור כדי למצוא משקעים. אם נוצר משקעים, צנטריפוגה המדגם במשך 1 דקה ב 13,000 × גרם ו 4 °C (65 °F).
7. העבר את supernatant לתוך צינורות חרוטיים חדשים 15 מ"ל ולתייג אותם כמו MMP Refolded.
8. מניחים בצד שבר לניתוח ג'ל ומתייגים אותו כ-MMP מקופל מחדש. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 3.1.9.
  הערה: אם התשואות נמוכות, ניתן להמיס את המשקעים במאגר שיווי המשקל של HT ולשלבים בסעיף 3.1 החוזרים על עצמם עם צינורות דיאליזה. אם אין לבצע ניתוח ג'ל או אם יש להשהות את הפרוטוקול כאן, להקפיא את הדגימות ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר אותם מאוחר יותר. אם התשואות נמצאות בטווח הרצוי, המשך לשלב 3.2.1.
שיתוף פעולה מחדש
הערה: מקדמי ההכחדה עבור Hisx6-pro-MMP-3cd מקופלים ומנוטרלים צפויים להיות זהים; לפיכך, חישובי A280 אינם מושפעים.
1. לרכז מחדש את המדגם עד 0.5 מ"ג / מ"ל. השתמש בתא מעורבב 400 מ"ל (ראה את טבלת החומרים) כדי לרכז את המדגם ל 15 מ"ל. כדי למנוע הקצפה, יש להשתמש בצינור קירור של 50 מ"ל כדי להתרכז עוד יותר במידת הצורך.
  הערה: אם נוצר משקעים, ניתן להטיל אותו ולהמיס אותו במאגר שיווי המשקל של HT. לאחר מכן, חזור על סעיפים 3.1 ושלב 3.2.1. אחרת, המשך לשלב 3.2.2.
2. מניחים בצד שבר לניתוח ג'ל ומתייגים אותו כ-MMP מרוכז.
  הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת הדגימות קפואות ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר.

4. הפעלה

4-אמינופנילמריק אצטט (APMA) הפעלה
הערה: APMA הוא רעיל מאוד. הפוך פתרון מלאי טרי של 20 מ"מ APMA לפני ההפעלה, ותמיד לעבוד תחת מכסה המנוע אדים בעת שימוש APMA. להשליך את פסולת APMA לתוך המיכל שלה.
1. לכל 1 מ"ל aliquot של MMP (1 מ"ג / מ"ל), להוסיף 50 μL של 20 mM APMA (ראה את טבלת החומרים) כדי להגיע לריכוז APMA הסופי של 1 מ"מM. דגירה לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. אם נוצר משקע, צנטריפוגה זה במהירות המרבית במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F). אחסן את supernatant בצינור microfuge 1.5 מ"ל שכותרתו MMP פעיל. השלך את המשקעים לתוך מיכל מסומן עבור פסולת APMA.
3. מניחים בצד שבר לניתוח ג'ל ומתייגים אותו כ-MMP פעיל.
  הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת הדגימות קפואות ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר. אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לשלב 4.2.1. לאחר ההפעלה, מקדם המשקל וההכחדה המולקולרי של MMP-3cd הם 19.40 kDa ו- 28.42 ^M-1 ^cm-1, בהתאמה.
התפלה
1. הסר APMA מדגם MMP-3cd המופעל עם עמודת התפלה של 2 מ"ל (עיין בטבלת החומרים), בהתאם לפרוטוקול היצרן.
2. מניחים בצד שבר לניתוח ג'ל ומתייגים אותו מותפל MMP. לאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). אם לא מבצע ניתוח ג'ל, המשך לסעיף 4.3 עם הדגימות הנותרות.
  הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת הדגימות קפואות ב -80 °C (80 °F) ולהפשיר מאוחר יותר.
הפעלת ג'לים SDS-PAGE
1. הפעל את כל שברי החלבון על ג'לים SDS-PAGE: שבר לא מושרה, שבר מושרה, MMP Lysed, MMP Sonicated, MMP Solubilized, שבר Flowthrough, שבר לשטוף, שבר Elution, MMP מעובד מחדש, MMP מרוכז, MMP מופעל, ו- MMP מותפל.
אחסון ארוך טווח של MMP-3
1. הוסף 0.05% (v/v) פעילי שטח לא יוניים (עיין בטבלת החומרים) לדגימות MMP-3cd המותפלות ואחסן אותן בטמפרטורה של -80 °C (80 °F).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעת הפעלת דגימות על SDS-PAGE, כי החלבון מתבטא בצורה של גופי הכללה מסיסים, שברי lysed ו sonicated צריך להכיל מעט מאוד תמצית Hisx6-pro-MMP-3cd, כמו החלבון עדיין לא היה resolubilized ב אוריאה. איור 3 משווה את שברי הארכת הטיהור של His-tag של Hisx6-pro-MMP-3cd מתאי BL21(DE3) ותאי R2DP. שברי Elution אוגדו בנפרד עבור תאי BL21(DE3) ו- R2DP לפני הדיאליזה. שברים מכל שלב הופעלו לאחר שהחלבונים הותזו (איור 4). כל דגימות ה-Hisx6-pro-MMP-3cd מציגות רצועה במהירות של כ-30 kDa, ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הייצור בקנה מידה גדול של MMPs מסיסים, אנושיים, רקומביננטיים נשאר משימה מאתגרת. תאי יונקים יכולים לבטא MMPs פונקציונליים בעלויות גבוהות וזמני המתנה ארוכים, ואילו E. coli מייצר במהירות כמויות גבוהות של גופי הכללת MMP שיש לטהר ולטפח מחדש ^11,16. תאי R2DP מגדילים באופן משמעותי את התפוקה של גופי הכללת MMP, ומאפשרים תהליך עיבוד מחדש חסכוני ופרודוקטיבי יותר של MMP. עם זאת, E. coli חסר את המכונות הפוסט-טרנסלנציונליות הדרושות לקפל MMPs, ולמרות זנים מהונדס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לד"ר אווט רדיסקי ואלכסנדרה הוקלה במרפאת מאיו בג'קסונוויל, פלורידה, על כך שסיפקו את הפלסמיד pET-3a-pro-MMP-3cd כתבנית לשיבוט הגן Hisx6pro-MMP-3cd, ואת הערותיהם, יחד עם ד"ר פול הארטלי ממרכז הגנומיקה של נבאדה באוניברסיטת נבאדה, רינו, לרצף DNA. המחברים רוצים גם להודות לקסנדרה הרגנרדר על שעזרה עם חלק מביטוי החלבון. מ.ר.ס. רוצה להודות למענק NIH-P20 GM103650-COBRE אינטגרטיבי למדעי המוח ולפרס מענק הזרעים MICRO MICRO של UNR R&D.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.22 ומיקרו; מסנן סטרילי m	Sigma Aldrich	SLGP033RS	משמש להסרת כמה מזהמים מתמצית החלבון לפני הטיהור, ומניעת סתימת עמוד Ni-NTA צלוחיות
1 ליטר Erlenmeyer	Thermo Fisher Scientific	S76106F	בקבוקי
זכוכית 1 ליטר	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	לא ישים
צינורות חרוטיים 15 מ"ל	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 גרם, 1 אינץ' מחט משופעת	אמזון	B07S7VBHM2	בשימוש בשילוב עם קלטת הדיאליזה
2 מ"ל עמוד התפלה	Thermo Fisher Scientific	89890	מסיר APMA לאחר הפעלה
2-(N-Morpholino)חומצה אתנסולפונית (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	/a
250 מ"ל כריות בקבוקים חרוטיות	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	ייצוב בקבוקים חרוטיים במהלך צנטריפוגה בנפח גדול
250 מ"ל בקבוקים חרוטיים	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 מ"ל תא מעורבב	Sigma Aldrich	UFSC40001	מרכז מחדש נפח גדול בהרבה מיחידת המסנן הצנטריפוגלי. תאי Rosetta2(DE3)pLysS מייצרים כמויות גבוהות של חלבון שעשויים לחרוג ממגבלת 15 מ"ל של יחידת המסנן הצנטריפוגלי
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	מפעיל MMP-3 על ידי פיצול מזרק הפרופפטיד
5 מ"ל	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	משמש בשילוב עם קלטת הדיאליזה
50 מ"ל צינורות חרוטיים	Thermo Fisher Scientific	339650	משמש לאחסון בשלבי טיהור רבים
צינור ריכוז מחדש של 50 מ"ל	סיגמא אולדריץ'	UFC901024D	משמש לריכוז מחדש של דגימות חלבון לאחר דיאליזה או הסרת מזהמים
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	מרכיב חיץ הממצק את מדיית LB חיטוי בעת קירור
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	אנטיביוטיקה בשימוש עם וקטור pET3a; בשימוש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל במדיה LB
BamHI	NEB	R3136S	אנזים הגבלה לשימוש עם וקטור pET3a
סידן כלורי (CaCl₂)Thermo	Fisher Scientific	600-30-23	יון הסידן מייצב את מבנה MMP
מפזרי תאים	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	ניתן להשתמש בו כדי להפיץ תאים על פני צלחת פטרי לאחר טרנספורמציה
כלורמפניקול	תרמו פישר סיינטיפיק	22-055-125GM	אנטיביוטיקה בשימוש עם וקטור pET3a; בשימוש ב-34 ומיקרו; גרם/מ"ל במדיה LB
מאגר דיאליזה 1	n/a	n/a	20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ CaCl₂, 1 ומיקרו; M ZnCl₂, 4 M אוריאה.
מאגר דיאליזה 2	n/a	n/a 20	מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ CaCl₂, 1 ומיקרו; M ZnCl₂, 2 M אוריאה.
מאגר דיאליזה 3	n/a	n/a 20	מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ CaCl₂ , 1 ומיקרו; M ZnCl₂.
מהדקי דיאליזה	Thermo Fisher Scientific	68011	בשימוש בשילוב עם צינורות דיאליזה מעור נחש
צינורות דיאליזה	Thermo Fisher Scientific	88243	שיטת דיאליזה אלטרנטיבית המחזיקה נפחי דגימה גדולים בהרבה, אך עם סיכון גבוה יותר לאובדן דגימה
מאגר עיכול	NEB	B7204S	מאגר המשמש לעיכול וקטור pET3a
קוביות חד פעמיות	Thermo Fisher מדעי	21-200-257	משמש למדידת תרבית חיידקים OD במהלך צמיחה וביטוי
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	מסייע בדנטורציה של חלבון על ידי הפחתת כל קשרי דיסולפיד
תערובת הרכבת DNA	NEB	E2621S	משמש לקשירת מוצר ה-PCR Hisx6-pro-MMP-3cd וקטור pET3a מעוכל
DNase I	NEB	M0303S	אנדונוקלאז לפירוק מזהמי DNA שליליים שעלולים להשפיע מאוחר יותר על טיהור החלבון
אתנול	תרמו פישר סיינטיפיק	A995-4	n/a
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	משמש בדנטורציה. מונע חמצון והיווצרות לאחר מכן של קשרי דיסולפיד
ערכת התאוששות ג'ל	Promega	A9281	מבודד ומטהר DNA מג'ל אגרוז
גליצרול	תרמו פישר סיינטיפיק	G33-500	משמש להכנת מלאי גליצרול, המוקפאים בטמפרטורה של -80 מעלות;
C עמודת זרימת כבידה	BioRad	7321010	משמש לטיהור Ni-NTA של חלבונים מתויגים רקומביננטית
תאים בעלי יעילות טרנספורמציה גבוהה	NEB	C2987	תאים בעלי יעילות טרנספורמציה גבוהה עם סיכוי גדול יותר להצלחה לשיבוט ה-N-terminal His-tag למבנה pET3a-pro-MMP-3cd
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 6 מ"מ אוריאה, 250 מ"מ אימידזול. התאם את ה-pH ל-7.4
HT מאגר שיווי משקל	n/a	n/a	20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 6 מ' אוריאה. התאם את ה-pH ל-7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. התאם את ה-pH ל-5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 6 מ"מ אוריאה, 25 מ"מ אימידזול. התאם את ה-pH ל-7.4
חומצה הידרוכלורית (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	משמש למאגרי pH
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	מחקה את קבוצת הצד של ההיסטידין. משמש להפרדת חלבונים לא קושרים באופן ספציפי מחלבון המטרה המתויג
שלו Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. התאם את ה-pH ל-8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	מגיב המשרה ביטוי גן מטרה ב-pET3a. הכינו 0.5 מ"ל 1 מ ', סננו, עקרו ואחסנו ב -20 מעלות; C
LB Amp Cam^R מדיה	n/a	n/a	למזיגה לבקבוק סטרירי של 1 ליטר או בקבוק 1 ליטר. עבור 1 ליטר, הוסף 25 גרם מרק LB. עיקור על ידי חיטוי. לאחר שהתקרר מתחת ל-50 מעלות; C, הוסף אמפיצילין ל-100 ומיקרו; גרם/מ"ל וכלורמפניקול עד 34 ומיקרו; g/mL
LB Amp Cam^R צלחות	n/a	n/a	למזיגה לצלחות פטרי סטריליות. יוצקים עד שמכסה צלחת הפטרי מכוסה לחלוטין. 1 ליטר מדיה מניב 40-60 לוחות. עבור 1 ליטר: 25 גרם מרק LB, 16 גרם אגר. עיקור על ידי חיטוי. לאחר שהתקרר מתחת ל-50 מעלות; C, הוסף אמפיצילין ל-100 ומיקרו; גרם/מ"ל וכלורמפניקול עד 34 ומיקרו; g/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	מעורבב מראש עם טריפטון, תמצית שמרים ונתרן כלורי
Lysis Buffer	n	/a n/a	50 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 1 מ"מ EDTA, 100 מ"מ NaCl, 0.133 גרם/מ"ל ליזוזים, 0.49% v/v Triton X-100. התאם את ה-pH ל-8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	משמש במיצוי חלבון. אנזים המבצע ליזה של דפנות תא חיידקים
ערכת Miniprep	Promega	A1330	אם מצליח, מחלץ את מבנה pET3a-pro-MMP-3cd משנאים
NdeI	NEB	R0111S	אנזים הגבלה לשימוש עם וקטור pET3a
שרף Ni-NTA	Thermo Fisher Scientific	PI88221	משמש לקשירת חלבונים רקומביננטיים המתויגים שלו. ניתן להחליף אינטראקציה חזקה זו עם ריכוזים גבוהים יותר של
ניקוי פעילי שטח אימידזול Nonionic	Thermo Fisher Scientific	PI28316	Storage למניעת צבירת MMP. ממזער אינטראקציות בין שאריות הידרופוביות על פני השטח של MMP ומולקולות מים, מבלי לשבש את הפעילות הקטליטית.
PCR mix	NEB	M0492S	מגיב PCR להכנסת תג N מסוף לתוך pET3a-pro-MMP-3cd
וקטור pET פלסמיד	Addgene	n/a	וקטור pET3a מציע עמידות לאמפיצילין, ביטוי השראת של גן מטרה וריצוף עם פריימרים T7
צלחות פטרי	VWR	25384-342	משמש לציפוי טרנספורמטורים על תאי LB agar media
R2DP Novagen		714033	נגזרות BL21 עם ביטוי משופר של חלבונים אוקריוטיים. מכיל tRNAs של קודונים שנמצאו נדירים
במצע גידול	NEB	B9020S	מצע גידול לא סלקטיבי לצמיחה מהירה במהלך הטרנספורמציה
נתרן כלורי (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	משמש במאגרים ומסייע ביציבות החלבון
נתרן דאוקסיכולאט	Thermo Fisher Scientific		PI89905 חומר ניקוי המשמש למיצוי חלבון. מאגר מסיסות דפנות התא של Lyses
	n/a	n/a	20 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 50 מ"מ NaCl, 10 מ"מ DTT, 6 מ' אוריאה. התאם את ה-pH ל-8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	מאגר נפוץ המשמש בטווח ה-pH הפיזיולוגי.
חומר ניקוי Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	לטמפרטורה המשמש לליזיס תאים
אוריאה	תרמו פישר סיינטיפיק	AAJ75826A7	חומר כאוטרופי ראשון לשיבוש מבנה משני של חלבון
אבץ כלורי (ZnCl₂)Thermo	Fisher Scientific	AAA162810E	מייצב את מבנה MMP. יון האבץ נמצא באתר הקטליטי של MMP-3

nחומר e. coli SOC רגיש

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).
Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).
Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).
Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981(2011).
Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).
Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313(2020).
Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).
McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).
Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).
Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).
Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

E Coli His Tag SDS PAGE R2DP

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים