Method Article

שיטת אלקטרופורמציה יעילה וחסכונית לחקר מסלולי איתות ראשוניים תלויי סיליום במבשר תאי הגרגיר

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אלקטרופורציה במבחנה לשחזור עבור מניפולציה גנטית של מבשרי תאי גרגר המוח הקטן העיקרי (GCPs) כי הוא חסכוני, יעיל, קיימא. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגים גם שיטה פשוטה למחקר מולקולרי של מסלולי איתות קיפוד תלויי ציליום ראשוניים בתאי GCP ראשוניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסיליום העיקרי הוא אברון איתות קריטי שנמצא כמעט בכל תא שמתמר את הקיפוד (Hh) ומאותת לגירויים מפני השטח של התא. במבשר תאי הגרגיר (GCP), הסיליום הראשי משמש כמרכז איתות מרכזי המתזמר את התפשטות התאים המבשרים על ידי ויסות מסלול האיתות של Hh. החקירה של מכונות איתות Hh תלויות cilium העיקרית מתאפשרת על ידי מניפולציה גנטית במבחנה של רכיבי המסלול כדי לדמיין את הלוקליזציה הדינמית שלהם לסיליום הראשי. עם זאת, טרנספקטציה של טרנסג'נים בתרבויות העיקריות של GCPs באמצעות שיטות אלקטרופורציה הידועות כיום היא בדרך כלל יקרה ולעתים קרובות גורמת בכדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטורה לא רצויה. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה יעיל, חסכוני ופשוט המדגים יעילות טרנספקטירה גבוהה של ~ 80-90% ואת הכדאיות התא האופטימלית. זוהי שיטת שינוי גנטי פשוטה, ניתנת לשחזור ויעילה החלה על חקר מסלול האיתות העיקרי התלוי בסיליום בתרבויות GCP ראשוניות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GCPs המוח הקטן נמצאים בשימוש נרחב כדי ללמוד את המכונות של מסלול איתות Hh בסוגי תאים אב עצביים בשל השפע הגבוה שלהם רגישות גבוהה למסלול איתות Hh ב vivo1,2,3,4. ב- GCPs, הסיליום העיקרי פועל כרכזת העברת אות Hh מרכזית 5 המתזמרת את התפשטות התאים המבשרים6,7,8. הדמיה חוץ גופית של רכיבי איתות Hh על הסיליום הראשי הוא לעתים קרובות מאתגר בשל רמות הבסיס האנדוגניות הנמוכות שלהם. לפיכך, שינוי טרנסג'ן של רמות ביטוי חלבון ות....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הקשורים לבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי חיים ולפרוטוקול שאושר על ידי משרד הבריאות, הונג קונג. רישיונות לניסויים בבעלי חיים בעקבות פקודת בעלי חיים (פיקוח על ניסויים) (סעיף 340) התקבלו ממשרד הבריאות, ממשלת הונג קונג. העבודה בבעלי החיים בוצעה בהתאם לאתיקה לבטיחות בעלי חיים שאושרה על ידי משרד המחקר של HKBU וועדת בטיחות המעבדות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנה לניסיון מקדים

  1. הכנת מדיה תרבותית ומאגרים
    1. מדיום ללא סרום (SFM)
      1. כדי להכין 50 מ"ל של SFM, להוסיף 500 μL של תחליף L-גלוטמין 100x, 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין, 1 מ"....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות Opti-MEM (ראה טבלת החומרים) כמגיב האוניברסלי, מתודולוגיית אלקטרופורציה מוצעת זו יכולה להשיג יעילות אלקטרופורציה גבוהה באופן עקבי בשיעור של ~80-90% (איור 1). יעילות האלקטרופורציה של וקטור Smo-EGFP נקבעה ב- DIV 2 לאחר אלקטרופורציה על ידי כימות אחוז התאים החיוביים לפלואורסצנטיות ירוקה בכל תאי ה- GCP המביעים את הקופסה המשויכת - 6 (Pax6). יעילות האלקטרופורציה של קבוצות שטופלו ב-DMSO וב-SAG נראתה דומה (איור 1 וטבלה 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרנספקטציה של טרנסג'נים בתרבות GCP ראשונית על ידי שיטת אלקטרופורציה קשורה בדרך כלל עם כדאיות תאים נמוכה ויעילות טרנספקטיבה ירודה9,10. מאמר זה מציג פרוטוקול אלקטרופורציה חסכוני וניתן לשחזור שהפגין יעילות גבוהה וכדאיות. בנוסף, אנו גם מדגימים שיטה פשוטה של לימוד מסלול האיתות Hh התלוי בסיליום העיקרי בתאי GCP ראשוניים.

שיטות אלקטרופורציה נפוצות אחרות דורשות לעתים קרובות ריאגנטים אלקטרופורציה ספציפיים לתאים יקרים שיש לרכוש מיצרנים ספציפיים. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי קרן הזרעים HKBU ומענק הסטארט-אפ Tier-2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), קרן מחקר מועצת המחקר השיתופית של המועצה למענק מחקר (CRF-C2103-20GF) ל- C.H.H. Hor.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<חזק>GCP תרבית
תוסף B27Life Technologies LTD17504044
מסננת תאים, 70 ומיקרו; מקורנינג352350
DNase I מלבלב בקררוש11284932001
ארל' s תמיסת מלח מאוזנתGibco, Life Technologies14155063
FBS, מוסמכתThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I, 100xGibco, Life Technologies35050061תחליף L-גלוטמין
L-ציסטאיןסיגמא אולדריץ'C7352
MatrigelBD Biosciences354277מטריצת ממברנת מרתף
NeurobasalGibco, Life Technologies21103049
Papain, מתלהWorthington Biochemical CorporationLS003126
Poly-D-lysine HydrobromideSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1אגוניסט מוחלק
<חזק>IF מכתים
סרום בקר אלבומיןסיגמא אולדריץ'A7906
פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ'P6148
טריטון X-100סיגמא אולדריץ'X100
<חזק>תערובת נוגדנים ראשונית
אנטי GFP-עז abרוקלנד600-101-215גורם דילול: 1: 1000
אנטי-Arl13b עכבר חד שבטי abNeuroMab75-287גורם דילול: 1: 1000
אנטי-Pax6 ארנב פוליקלונלי abCovancePRB-278Pגורם דילול: 1: 1000
<חזק>תערובת נוגדנים משנית
Alexa Fluor 488 חמור נגד עזים IgGInvitrogenA-11055גורם דילול: 1: 1000
Alexa Fluor 555 חמור נגד עכבר IgGInvitrogenA-31570גורם דילול: 1: 1000
Alexa Fluor 647 חמור נגד ארנב IgGInvitrogenA-31573גורם דילול: 1: 1000
DAPIThermo Scientific62247גורם דילול: 1: 1000
<חזק>אלקטרופורציה
CU 500 תא קובטהNepageneCU500
קובטה אלקטרופורציה EPA (מרווח של 2 מ"מ)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070מדיום סרום מופחת לטרנספקציה
pEGFP-mSmoAddgene25395
סופר אלקטרופורטור NEPA21 TYPE II במבחנה וב-Vivo אלקטרופורציהNepageneNEPA21אלקטרופורטור

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

Related Articles