מאמר שיטה

בידוד ופרופיל של תאי אנדותל עורקים מזנטריים ראשוניים אנושיים ברמת השעתוק

DOI:

10.3791/63307

⸱

14 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבית והפרופיל של תאי האנדותל מהעורק המזנטרי האנושי. בנוסף, מסופקת שיטה להכנת העורק האנושי לתעתיק מרחבי. פרוטאומיקה, תעתיק ובדיקות תפקודיות יכולות להתבצע על תאים מבודדים. פרוטוקול זה יכול להיות repurposed עבור כל עורק בגודל בינוני או גדול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אנדותל (ECs) חיוניים לתפקוד כלי הדם והגוף כולו באמצעות התגובה הדינמית שלהם לרמזים סביבתיים. הבהרת השעתוק והאפיגנום של ECs היא בעלת חשיבות עליונה להבנת תפקידם בהתפתחות, בבריאות ובמחלות, אך היא מוגבלת בזמינותם של תאים ראשוניים מבודדים. הטכנולוגיות האחרונות אפשרו פרופיל בתפוקה גבוהה של תעתיק EC ואפיגנום, מה שהוביל לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאי EC שלא היו ידועים קודם לכן ומסלולי התפתחות. בעוד שתרביות EC הן כלי שימושי בחקר תפקוד EC וחוסר תפקוד לקוי, תנאי התרבית והקטעים המרובים יכולים להציג משתנים חיצוניים המשנים את התכונות של EC ילידי, כולל מורפולוגיה, מצב אפיגנטי ותוכנית ביטוי גנים. כדי להתגבר על מגבלה זו, המאמר הנוכחי מדגים שיטה לבידוד ECs ראשוניים אנושיים מעורקים מזנטריים של תורמים שמטרתם ללכוד את מצב מולדתם. ECs בשכבה האינטימית מנותקים מכנית וביוכימית עם שימוש באנזימים מסוימים. התאים המתקבלים יכולים לשמש ישירות לריצוף RNA בתפזורת או לריצוף RNA חד-תאי או מצופה לתרבית. בנוסף, מתוארת זרימת עבודה להכנת רקמת עורקים אנושית עבור תעתיק מרחבי, במיוחד עבור פלטפורמה זמינה מסחרית, אם כי שיטה זו מתאימה גם לטכניקות אחרות של פרופיל תעתיק מרחבי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו על כלי שיט שונים שנאספו ממגוון תורמים במצבי בריאות או מחלות כדי לקבל תובנות לגבי ויסות שעתוק ואפיגנטי של EC, היבט מרכזי בביולוגיה של תאי האנדותל.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי האנדותל (ECs) הם מווסתים חיוניים של טונוס כלי הדם ושל זלוף הרקמות. ECs הם יוצאי דופן ביכולתם להגיב לסביבה החוץ-תאית ולהסתגל לשינויים בדינמיקה ובהרכב של זרימת הדם. תגובות דינמיות אלה מתווכות באמצעות רשת של אירועי איתות תוך-תאיים, כולל אפנון שעתוק ופוסט-שעתוק עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית. חוסר הוויסות של תגובות אלה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל אך לא מוגבל למחלות לב וכלי דם, סוכרת וסרטן 1,2.

חלק גדול מהמחקרים עושים שימוש בקווי תאים או במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את תעתיק ה-EC. הראשון הוא כלי שימושי, בהתחשב בקלות השימוש היחסית ובזולות. עם זאת, התרבות הסדרתית יכולה להכניס שינויים פנוטיפיים ל-ECs, כגון תכונות פיברובלסטיות וחוסר קיטוב, ולנתק אותן ממצב ה-in vivo 3 שלהן. התאים הראשוניים, למשל, EC של וריד טבור אנושי (HUVEC) היו בחירה פופולרית מאז שנות ה-80 של המאה ה-20, אך הם נגזרים ממצע כלי דם התפתחותי שאינו קיים אצל מבוגרים, ולכן לא סביר שייצגו באופן מלא ECs בוגרים. בעלי חיים, במיוחד מודלים של עכברים, מייצגים טוב יותר את הסביבה הפיזיולוגית או הפתופיזיולוגית של ECs ומאפשרים חקירה של תעתיקים כתוצאה מהפרעה גנטית. ניתן לבודד את ה-ECs של מורין מרקמות שונות, כולל אבי העורקים, הריאות ורקמות השומן באמצעות הליכים מבוססי אנזימים 4,5,6,7. עם זאת, לא ניתן להשתמש בתאים המבודדים עבור מעברים מרובים אלא אם כן הם מומרים6 ולעתים קרובות הם מוגבלים במספרם, מה שדורש איגום מבעלי חיים מרובים 5,8,9.

הופעתן של טכנולוגיות חדשות החוקרות את ארכיטקטורת כלי השיט ברמה תעתיקית, במיוחד עם רזולוציה של תא יחיד, אפשרה עידן חדש של ביולוגיה אנדותל על ידי חשיפת פונקציות ותכונות חדשניות של ECs 5,10,11,12,13,14. משאב עשיר שנבנה על ידי חוקרי טאבולה מוריס אסף פרופילי תעתיק חד-תאיים של 100,000 תאים, כולל ECs על פני 20 איברי מורין שונים15, אשר חשפו הן גנים נפוצים של סמן EC והן חתימות תעתיק ייחודיות עם הבדלים בין רקמותותוך-רקמה 5,13. עם זאת, ישנם הבדלים ברורים בין עכבר לאדם בגנום, באפיגנום ובשעתוק, במיוחד באזורים שאינם מקודדים 16,17,18. חסרונות אלה הנ"ל מדגישים את החשיבות של ניתוח של ECs באמצעות דגימות אנושיות על מנת לקבל פרופיל נאמן של ECs במדינת מולדתם בבריאות ומחלות.

רוב שיטות הבידוד של EC מסתמכות על דיסוציאציה פיזית באמצעות הומוגניזציה, חיתוך דק וטחינה של הרקמה לפני הדגירה עם אנזימים פרוטאוליטיים לזמנים שונים. האנזימים והתנאים גם משתנים במידה ניכרת בין סוגי הרקמות, מטריפסין ועד קולגן, המשמשים לבדם או בשילוב 19,20,21. העשרה או טיהור נוספים מבוססי נוגדנים נכללים לעתים קרובות כדי להגביר את טוהר ה- ECs. בדרך כלל, נוגדנים נגד סמני ממברנה EC, למשל, CD144 ו- CD31 מצומדים לחרוזים מגנטיים ומוסיפים לתרחיף התא22,23. אסטרטגיה כזו יכולה להיות מותאמת באופן כללי לבידוד EC ממספר רקמות אנושיות ועכבריות, כולל הטכניקות שהוצגו בפרוטוקול זה.

במצבם המקורי, ECs מקיימים אינטראקציה עם סוגי תאים מרובים ועשויים להתקיים בנישות כלי דם שבהן קרבת התאים חיונית לתפקוד. בעוד שמחקרים של ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני (scRNA ו-snRNA-seq) היו בעלי חשיבות עליונה לפריצות הדרך האחרונות בתיאור ההטרוגניות של EC, תהליך הדיסוציאציה משבש את הקשר הרקמות ואת המגע בין התא לתא, שגם הם חשובים להבנת הביולוגיה של EC. פותח בשנת 2012 ונבחר לשיטת השנה בשנת 202024, פרופיל תעתיק מרחבי שימש לפרופיל ביטוי גנים גלובלי תוך שמירה על המאפיינים המרחביים ברקמות שונות כולל מוח25, גידול26 ורקמת שומן27. ניתן למקד את הטכנולוגיות, תוך שימוש בגששים מיוחדים ספציפיים לרצפי RNA מסוימים המחוברים לריאגנטים של זיקה או לתגים פלואורסצנטיים, ובכך לזהות גנים נבחרים ברזולוציה תת-תאית 28,29,30,31. הם יכולים גם להיות לא ממוקדים32,33, בדרך כלל באמצעות אוליגונוקלאוטידים בעלי ברקוד מרחבי כדי ללכוד רנ"א, אשר יחד מומרים ל-cDNA להכנת ספריית seq לאחר מכן ולכן יש להם את היתרון של הסקת ביטוי גנים של רקמות שלמות באופן בלתי משוחד. עם זאת, רזולוציה מרחבית אינה מושגת כיום ברמה תאית אחת עם טכנולוגיות זמינות מסחרית. ניתן להתגבר על כך במידה מסוימת באמצעות שילוב נתונים עם נתוני scRNA-seq, מה שבסופו של דבר מאפשר מיפוי של תעתיק חד-תאי בהקשר של רקמה מורכבת תוך שמירה על המידע המרחבי המקורי שלו34.

כאן, מתוארת זרימת עבודה לפרופיל תעתיק EC באמצעות עורק מזנטרי עליון אנושי, עורק היקפי ששימש לחקר הרחבת כלי דם, שיפוץ כלי דם, עקה חמצונית ודלקת 35,36,37. שתי טכניקות מתוארות: 1) לבודד ולהעשיר ECs מן האינטימה של כלי הדם המשלבים דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי המתאים לריצוף תעתיק של תאים בודדים או לתרבית מבחנה שלאחר מכן; 2) להכין מקטעי עורקים ליצירת פרופיל תעתיק מרחבי (איור 1). ניתן לבצע את שתי הטכניקות הללו באופן עצמאי או משלים לפרופיל ECs ולתאים הסובבים אותם. יתר על כן, ניתן להתאים זרימת עבודה זו לשימוש בכל עורק בינוני או גדול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרי רקמות אנושיות נערכו על דגימות לא מזוהמות שהתקבלו ממרכז משאבי התאים של האיים של דרום קליפורניה בעיר התקווה. ההסכמות המחקריות לשימוש ברקמות אנושיות לאחר המוות התקבלו מקרובי משפחתם של התורמים, ואישור אתי למחקר זה ניתן על ידי מועצת הביקורת המוסדית של עיר התקווה (IRB No. 01046).

1. דיסוציאציה פיזית (זמן משוער: 1-2 שעות)

  1. מניחים עורק טרי על תבשיל בקוטר 10 ס"מ ושוטפים עם מלח סטרילי של Dulbecco עם מאגר פוספט (D-PBS).
  2. עם מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר את השומן ואת רקמות החיבור החיצוניות עד הכלי נקי. מדוד את אורך הכלי עם סרגל המוצב מחוץ לצלחת וצלם תמונות לתיעוד (איור 1A).
  3. חיץ עיכול מתאים מראש ל-37 מעלות צלזיוס: עבור scRNA-seq השתמשו באנזים דיסוציאציה של תאים; עבור מבחני תרביות תאים, השתמשו ב-1-6 מ"ג/מ"ל של קולגןאז D, 3 מ"ג/מ"ל של פרוטאז שמקורו בחיידקים, 100 mM של HEPES, 120 mM של NaCl, 50 mM של KCl, 5 mM של גלוקוז, עם 1 mM של CaCl2 6,38 (pH 7.0, אינו דורש התאמה) שנוספו 5 דקות לפני השימוש.
  4. קח את העורק המזנטרי (בדרך כלל בקוטר של 6-8 מ"מ) וחתוך לאורך עם מספריים כדי לפתוח את לומן הכלי אנכית.
  5. באמצעות מחטים, חברו את הכלי לשעווה שחורה בכל ארבע הפינות, והשאירו את האינטימה חשופה (איור 1B).
  6. מוסיפים 1 מ"ל של מאגר עיכול שחומם מראש לאינטימה. קח אזמל סטרילי ולגרד את לומן של הכלי בעדינות פעמיים.
    הערה: מטרת הליך זה היא לנתק את השכבה האינטימית, שעשויה להצריך תרגול. מספיק כוח צריך להיות מופעל כדי להסיר אנדותל, אבל לא כל כך הרבה כי שכבות עמוקות יותר של רקמה מוסרים גם, אשר יפחית את ייצוג EC.
  7. מעבירים את חיץ העיכול לצינור של 5 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ עיכול לאינטימה ופיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהוסיף לצינור 5 מ"ל. תאי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, מסתובבים ב-150 סל"ד למשך 5 דקות.
  8. הוסף 2 מ"ל של M199 בינוני (או D-PBS אם ממשיכים עם scRNA-seq) לתרחיף התא כדי להרוות את התגובה האנזימטית. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 600 x גרם למשך 5 דקות.
  9. הסר את הסופרנטנט ואחסן את הסופרנאטנט בנפרד לתרבית כבקרה כדי לבחון אם כל התאים נלכדים בכדור בשלב 1.8. בצעו החייאה של כדור התא ב-1 מ"ל של מדיום M199 (או D-PBS אם ממשיכים עם scRNA-seq).
  10. הערך את כדאיות התא על-ידי ערבוב של 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של מלאי התאים. שימו לב למורפולוגיה של התאים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
    הערה: בשלב זה, ניתן להשתמש בתאים לכימות חלבונים או RNA או בתרבית במבחנה באמצעות מדיה של תרבית EC בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים39. לחלופין, ניתן להכין אותם לריצוף כמתואר בסעיף הבא.
  11. עבור התרבות, מצפים שתי בארות של צלחת של 6 בארות על ידי צנרת 500 μL של מגיב חיבור לתוך בארות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת ריאגנט חיבור ושטיפה עם D-PBS סטרילי, מחלקים את מלאי התאים המלא לבאר אחת, והסופרנטנט נשמר כבקרה לתוך הבאר השנייה.

2. הכנה למחקרי scRNA-seq (זמן משוער: 3-4 שעות)

  1. צנטריפוגה מלאי התאים משלב 1.11 ב 4 °C ,600 x g במשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנטנט ומחזירים את הכדור בעדינות עם פיפטה P1000 וטיפ רחב ב-1 מ"ל של 0.04% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-D-PBS. ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית.
  2. מעבירים את התמיסה דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי להסיר את פסולת התאים. אם נשארת פסולת, עברו דרך מסננת שנייה ל-4 מ"ל של 0.04% BSA ב-D-PBS.
  3. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 600 x גרם למשך 5 דקות. הסר את ה-supernatant והחזיר את הכדור ב-500 μL של 0.04% BSA ב-D-PBS באמצעות פיפטה P1000 עם קצה פיפטה רחב-נשא. ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית.
  4. הערך את הכדאיות של התא על-ידי ערבוב של 10 μL של מלאי התאים עם 10 μL של טריפאן כחול. באמצעות המוציטומטר, שימו לב למורפולוגיה, קבעו אם יש תרחיף חד-תאי ללא אשכולות, בדקו אם יש פסולת רקמה, וחשבו את מספר התאים החיים והמתים.
  5. אם התאים מקובצים או נשארת פסולת, יש לחזור על שטיפה עם 0.04% BSA ב-D-PBS או לעבור שוב דרך מסננת של 40 מיקרומטר.
    הערה: אמנם זה יפחית את התפוקה, אך חשוב שהתאים יתקיימו בתרחיף נקי של תא יחיד לריצוף אופטימלי.
  6. ההשעיה החד-תאית יכולה לשמש ל-scRNA-seq.

3. פרופיל תעתיק מרחבי (זמן משוער: 3-4 שעות)

  1. מוסיפים איזופנטן (2-מתילבוטאן) למכל מתכת וצוננים בחנקן נוזלי (LN2) או בקרח יבש (LN2 עדיף מכיוון שהוא יביא את הטמפרטורה נמוכה יותר מקרח יבש). יוצקים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בבארות של קריומולדות פלסטיק מסומנות תוך הקפדה לא ליצור בועות ולהסיר את אלה המופיעות. השאירו את הקריומלד על קרח יבש כדי להצטנן.
  2. חותכים לפחות שני חלקים קורונליים, 1 ס"מ אורך הכלי. באמצעות מלקחיים ארוכים (12 אינץ') מטביעים את הרקמה באיזופנטן עד להקפאה. הטביע במהירות את הרקמה ב- OCT בכיוון עם הלומן הנראה במרכז. הקפידו להסיר בועות, במיוחד אלה שליד הרקמה.
  3. באמצעות מלקחיים ארוכים (12 אינץ'), תפסו את הקרימולדים והצמידו אותם למכל המתכת. בעוד הבסיס של תבניות צריך להיות בנוזל, זה לא צריך להיות עמוק מדי כדי לאפשר איזופנטן לרוץ על הרקמה. שימו לב להקפאה, ה-OCT יהפוך ללבן בהדרגה מבחוץ תוך 1-2 דקות.
  4. אחסן חלקים אלה במיכל אטום בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) למשך עד 6 חודשים.
    הערה: שמרו דגימות על קרח יבש בכל עת ואל תאפשרו יותר ממחזור הפשרה אחד של הקפאה. רקמה זו יכולה לשמש לניתוח היסטולוגי, פלואורסצנציה של RNA/DNA בהכלאה באתרה (FISH), או תעתיק מרחבי, שיתואר כעת.
  5. הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל -20 מעלות צלזיוס עבור החדר ו -10 מעלות צלזיוס עבור ראש הדגימה. שיווי משקל OCT משובץ קטעי כלי שיט, סכינים, מברשות, ומגלשות ל -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט למשך כ -30 דקות. תוך כדי שיווי משקל, נקו את המכונה ואת כל הציוד שעשוי לגעת בחלקים, כולל הלהב, עם 70% אתנול ואחריו תמיסת RNase deontamination.
  6. חברו את הדגימה על ידי חלוקת כמות קטנה של OCT על בלוק ה-cryostat העגול והנחת הדגימה למעלה לפני שהיא קופאת. מניחים את הבלוק במרכז ראש הדגימה ומבריגים את הבלוק במקומו באמצעות ידית שחורה גבוהה משמאל. חתכו כל עודף OCT המקיף את כלי השיט.
  7. הגדרת עובי החיתוך ל-10 מיקרומטר על הקריוסטט, חותכים כ-60 חלקים ומניחים אותם בצינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל. סעיפים אלה ישמשו להערכת איכות הרנ"א. עם הסרת הקריוסטט, יש להוסיף מיד 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA ומערבולת עד שהקטעים מומסים לחלוטין.
  8. מוסיפים 200 μL של כלורופורם ומערבבים עד שהתמיסה דומה למילקשייק תות. צנטריפוגה ב 11,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
  9. אספו את הפאזה המימית (פאזה שקופה על גבי שכבות לבנות וורודות) והוסיפו לה 500 μL של איזופרופנול. מערבבים על ידי היפוך הצינורות מעל 10 פעמים ומניחים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות.
  10. צנטריפוגה ב 11,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). ממיסים את גלולת ה-RNA המטוהרת ב-5 μL של מים נטולי RNase. בדוק את מספר שלמות הרנ"א (RIN).
    הערה: דוגמאות עם RIN ≥ 7 עדיפות, אך RIN ≥ 6 מקובל. מספר חלקי הרקמה ונפח התמיסה להמסת RNA עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתאם למערכת המשמשת כדי להבטיח שריכוז הרנ"א הסופי נמצא בטווח התפקוד של RIN כדי לאפשר הערכת RIN מדויקת.
  11. תרגלו חיתוך והצבה של מקטעים בצורה נכונה בתוך המסגרות הפידוקיאליות באמצעות שקופיות זכוכית רגילות לפני שתמשיכו לאופטימיזציה של רקמות זמינות מסחרית או לשקופיות ביטוי גנים. ניתן להשיג זאת על ידי ציור ריבועים של 6.5 מ"מ x 6.5 מ"מ על מגלשת זכוכית רגילה, קירור ל -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט, והצבת חלקים באזור לכידה זה.
  12. חותכים מקטעים של 10 מיקרומטר עם צלחת נגד גלגול במקום, הופכים ומשטיחים בזהירות על ידי נגיעה עדינה בקטע דרך ה-OCT שמסביב.
  13. באמצעות מברשות cryostat ללא RNase ממקמות את חלק הרקמה בתוך הריבוע, תוך שימוש רק ב- OCT שמסביב. יש להניח מיד אצבע אחת (בכפפות) על החלק האחורי של אזור הלכידה כדי להמיס את החלק אל המגלשה.
  14. לאחר שהקטע נדבק, הניחו את השקופית על ה-cryobar כדי לאפשר למקטע להקפיא. יש להיזהר כדי למנוע קיפול רקמות ורקמות מעל הקצוות המסומנים של המסגרת הפידוקיאלית. במידת הצורך, חתכו את הרקמה לחצאים או לרבעים לאורך הלומן באמצעות להב כדי לוודא שמקטע הכלי מתאים למסגרת של 6.5 מ"מ x 6.5 מ"מ.
  15. חותכים 10 מיקרומטר מקטעי רקמה לפי 3.12-3.14 לאופטימיזציה של רקמות או לשקופיות ביטוי גנים. העבר את המגלשה לדואר שקופיות המונח על קרח יבש. אחסן שקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות לפני שתמשיך עם פרוטוקולים מרחביים שפורסמו33,34.

4. ניתוח נתוני רצף (זמן משוער: עד שבוע אחד בהתאם להיכרות עם התוכנה)

הערה: לניתוח תעתיק מרחבי בלבד, דלג לשלב 4.8. נתוני scRNA-seq מעובדים באמצעות הצינור הסטנדרטי המותאם לתעתיק הייחוס האנושי hg38. חבילת R Seurat (v3.2.2) משמשת לניתוח נתוני scRNA-seq בעקבות הנחיותשפורסמו 40.

  1. מסננים באמצעות מדדי בקרת איכות מבוססים היטב: תאים נדירים עם מספר גבוה מאוד של גנים (פוטנציאליים מכפילים) ותאים עם אחוזי מיטוכונדריאליים גבוהים (תאים באיכות נמוכה או גוססים מציגים לעתים קרובות זיהום מיטוכונדריאלי) מוסרים.
  2. נרמל נתונים באמצעות "sctransform", שיטה לשיפור שילוב הדגימה בהשוואה לנורמליזציה של יומן. נתונים מנורמלים אלה משמשים להפחתת ממדיות ולאשכולות, בעוד שרמות ביטוי מנורמלות ביומן משמשות לניתוח המבוסס על רמות ביטוי גנים, כגון סיווג מסוג תאים41.
  3. בחר גנים של סמן לכל סוג תא, לדוגמה, מולקולת הידבקות של תאי אנדותל טסיות דם -1 (PECAM1) ופקטור פון וילברנד (VWF) עבור ECs, לומיקן (LUM) ופרוקולגן C-Endopeptidase משפר (PCOLCE) עבור פיברובלסטים, גן טרנסלוקציה של תאי B 1 (BTG1) ו - CD52 עבור מקרופאגים, C1QA ו- C1QB עבור מונוציטים, ושרשרת כבדה של מיוזין 11 (MYH11) ו transgelin (TAGLN) עבור תאי שריר חלקים של כלי הדם36.
  4. חישב את רמת הביטוי הממוצעת על פני תאים בודדים בין כל זוג סמנים כדי שיהיה סמן יחיד עם רמת ביטוי ממוצעת המשויכת לכל סוג תא42.
  5. החל מודל תערובת גאוס (GMM) עם שני מרכיבים על נתוני הביטוי של כל סמן על פני תאים בודדים על מנת להפריד תאים לשתי קבוצות, כלומר, ביטוי גבוה של הסמן וביטוי נמוך של הסמן. בדרך זו, עבור כל סמן, כל תא בודד מוקצה לאחד משני הרכיבים42.
  6. השתמש בהעשרה סטטיסטית עבור קבוצת הגנים של הסמן, הבדיקה המדויקת של פישר, כדי להקצות סוג תא לכל אשכול. על ידי כך מתקבלת קבוצה של ערכי p לכל אשכול, שכל אחד מהם מתאים לסוג תא. סוג התא עם ערך ה-p הנמוך ביותר מוקצה לאשכול זה.
  7. לעבד את נתוני התמלול המרחבי באמצעות צינורות Space Ranger וכתוצאה מכך לנטרל את הברקוד המרחבי וליצור מדדי בקרת איכות (QC), כולל סך כל הקריאות המיושרות לתעתיק האנושי hg38, המספר החציוני של מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) או גנים לנקודה35.
    הערה: חבילת R Seurat (v3.2.2) משמשת לניתוח הנתונים המעובדים על-ידי Space Ranger בהתאם להנחיותשפורסמו 40.
  8. נרמל נתונים באמצעות "sctransform", שיטה אשר הוכחה כדי לשפר את הניתוח במורד הזרם בהשוואה לנורמליזציה של לוגים בהתחשב בהטרוגניות של הרקמה והשונות הגבוהה מאוד בספירה על פני הכתמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח של ECs מעורק מזנטרי באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית ואנזימטית או שימור בהקפאה לשימוש במבחנים שונים במורד הזרם מתואר כאן (איור 1). ECs ניתן פרופיל בעורקים מזנטריים באמצעות השלבים הבאים: A) דיסוציאציה מכנית מן האינטימה יחד עם עיכול קולגן לתאי תרבית; ב) יצירת תרחיף חד-תאי ל-scRNA-seq; או C) חתכי רוחב של העורק יכולים להיות מוטמעים ב-OCT כדי שיהיו מכוונים לפרופיל של תעתיק מרחבי (איור 1 ואיור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה המוצגת מפרטת סדרה של טכניקות ליצירת פרופיל של ECs מתוך פיסת עורק אנושי יחידה עם רזולוציה חד-תאית ומרחבית. ישנם מספר שלבים קריטיים וגורמים מגבילים בפרוטוקול. אחד המפתחות ליצירת פרופילי תעתיק הוא רעננות הרקמה ותקינות הרנ"א. חשוב לשמור על רקמות על קרח ככל האפשר לפני העיבוד כדי למזער את פירוק הרנ"א. בדרך כלל, הרקמות שלאחר המוות מעובדות בין 8-14 שעות לאחר זמן המוות. עם זאת, מומלץ להתחיל את הבידוד או את ההקפאה בהקדם האפשרי לאחר החילוץ מהתורמים. במיוחד לצורך מיפוי תעתיק מרחבי, יש לשמור את הרקמה על קרח יבש ולא לאפשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ש.ז. הוא מייסד וחבר מועצת המנהלים של Genemo, Inc.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (ל- Z.B.C.); DP1DK126138 ו- DP1HD087990 (ל- S.Z.); מענק של קרן אלה פיצג'רלד ופרויקט משפחת וונק (ל-Z.B.C.); ומענק רשת זרעים של אטלס תאים אנושיים (ל-Z.B.C. ול-S.Z.). המחקר שדווח בפרסום זה כלל עבודה שבוצעה בליבת הגנומיקה האינטגרטיבית בעיר התקווה הנתמכת על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA033572. המחברים רוצים להודות לד"ר איסמעיל אל-עבדאללה ולד"ר מריגנג צ'י מצוות השתלת האיים ב-City of Hope לבידוד רקמות אנושיות, לד"ר דונגצ'יאנג יואן ב-City of Hope על עזרתו בניתוח scRNA-seq, ולד"ר מארק הלושקה מהמחלקה לפתולוגיה של הלב וכלי הדם, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס על תובנותיו שלא יסולאו בפז על היסטולוגיה של כלי הדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ"לארה"ב סיינטיפיק1615-5500
צלחת 10 ס"מGenesee Scientific25-202
23G מחטיםBD305145
2-methylbutaneThermo FisherAC327270010
40 ומיקרו; m מסננתפישר14100150
4200 מערכת TapeStation AgilentTechnologiesG2991BA
צינור 5 מ"לתרמו פישר14282300
צלחת 6 בארותגריינר ביו-וואן07-000-208
גורם התקשרותיישומי תאים123-500מגיב מצורף בפרוטוקול
שעווהניתן להשתמש בכל שעווה שחורה מסחרית
סרום אלבומין מטופל בהלם חוםפישרBP1600-100
CaCl2FisherBP510
צנטריפוגהאפנדורף
כלורופורםפישרC607
קולגנאז DRoche11088866001
Cryostatמברשות Leica
Cryostat
D-PBSתרמו פישר14080055
אתנולפישרBP2818-4
סרום בקר עובריפישר10437028
המוציטומטרפישר267110
HEPESסיגמא אולדריץ'H3375-100g
רגישות גבוהה D1000 מאגר דגימהAgilent Technologies5067-5603
קלטת מסך D1000 ברגישות גבוההחממת
C 5% CO2
IsopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
חנקן
נוזלי בינוני 199Sigma AldrichM2520-10X
מיכל
מיקרוסקופLeicaלהערכת מורפולוגיה
מדיום תרבית אנדותל מיקרו-וסקולרייישומי תאים111-500
NaClFisherS271-1
ניו ברונסוויק Innova 44/44R שייקר אורביטליEppendorf
תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימליתפישר4585
תבניות קריותל פלסטיקפישר22363553
סרטמסך RNAAgilent Technologies5067-5576
מסך RNA מאגר דגימת קלטתAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
מים ללא RNaseTakaraRR036Bמים ללא RNase (2) בערכה
מלקחיים ארוכים סטריליים 12 אינץ'FST91100-16
מלקחיים עדינים סטרילייםFST11050-10
מספריים עדינים סטרילייםFST14061-11
Superfrost PLUS זהב שקופיותפישר1518848
TRIzol מגיבפישר15596018
טריפן כחולקורנינגMT25900CI
TrypLE אקספרס אנזים (1X) פנול אדוםתרמו פישר12605010אנזים דיסוציאציה תאים ב פרוטוקול
ערכת אביזרי Visium10X GenomicsPN-1000215
חבילת Visium Gateway, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
שקופית ביטוי גנים מרחבית של Visium & ערכת ריאגנטים, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184
שחורה בקר D-גלוקוז פישר D16-1 דימתיל סולפוקסיד פישר MT25950CQC Dispase II Roche 4942078001 פרוטאז שמקורו בחיידקים בפרוטוקול אזמל בטיחות חד פעמי Myco Instrumentation 6008TR-10 Agilent Technologies 5067-5584 נשמרת ב-37 מעלות;מתכתשל תאים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7(2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19(2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489(2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211(2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337(2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296(2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976(2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690(2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088(2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627(2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771(2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Mesenteric ArteryCell IsolationTranscriptome ProfilingSingle Cell RNASpatial TranscriptomicsCell ViabilityImmunofluorescence StainingRNA ExtractionHematoxylin Eosin Staining

מאמרים קשורים