הפרוטוקול מאפשר יצירת אוכלוסיית אדיפוציט טהורה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). חומצה רטינואית משמשת להתמיינות iPSCs לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) המשמשים לייצור אדיפוציטים. לאחר מכן, גישת מיון המבוססת על צביעה אדומה של הנילוס משמשת להשגת אדיפוציטים טהורים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
התמיינות איתנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לאוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים כדי לחקור הפרעות הקשורות לאדיפוציטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) אפשרה יצירה של סוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים. עם זאת, שיטות ההבחנה הנוכחיות הן בעלות יעילות נמוכה ואינן מייצרות אוכלוסייה הומוגנית של אדיפוציטים. כאן, אנו עוקפים בעיה זו באמצעות שיטה מבוססת all-trans רטינואית לייצור תאי גזע מזנכימליים (MSC) בתפוקה גבוהה. על ידי ויסות מסלולים השולטים בהתפשטות, הישרדות והיצמדות תאים, אסטרטגיית ההתמיינות שלנו מאפשרת יצירה יעילה של גופים עובריים (EBs) המתמיינים לאוכלוסייה טהורה של MSCs רב-עוצמה. המספר הגבוה של MSCs שנוצרו על ידי שיטה זו מספק מקור אידיאלי ליצירת אדיפוציטים. עם זאת, הטרוגניות הדגימה הנובעת מהתמיינות אדיפוציטים נותרה אתגר. לכן, השתמשנו בשיטה מבוססת אדום הנילוס לטיהור אדיפוציטים בוגרים נושאי שומנים באמצעות FACS. אסטרטגיית מיון זו אפשרה לנו לבסס דרך אמינה למדל הפרעות מטבוליות הקשורות לאדיפוציט באמצעות מאגר של אדיפוציטים עם הטרוגניות דגימה מופחתת ופונקציונליות תאים משופרת.
מבוא
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) פועלים כמשאב חולף יעיל לייצור תאים ממוצא מזודרמלי כמו אדיפוציטים, אוסטיאוציטים וכונדרוציטים, אשר יכולים לשמש עוד יותר למידול ההפרעות הגנטיות שלהם. עם זאת, גישות קודמות הסתמכו על השגת MSCs אלה מרקמות בוגרות 1, אשר הטילו את האתגר של השגתם במספרים גבוהים מהתורמים, ואת המגבלה של שמירה על יכולת התפקוד שלהם בתנאי תרבית חוץ גופית תת-אופטימליים 1,2. מכשולים אלה יצרו דרישה גדולה של פרוטוקול ליצירת MSCs במבחנה. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) יכולים לשמש כמקור רב ערך של MSCs, המציגים מאפייני MSC
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית המתאימה ובוצע בהתאם לסטנדרטים האתיים כפי שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר או סטנדרטים אתיים דומים. הפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של HMC (מס '16260/16) ו- QBRI (מס '2016-003). עבודה זו ממוטבת גם עבור תאי גזע עובריים (HESC) כגון H1 ו-H9. דגימות דם נלקחו מאנשים בריאים בהסכמה מדעת מלאה. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים נוצרים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) של אנשים בריאים.
1. טיפוח ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים
- הכינו לוחות מטריצת ממברנת מרתף על ידי בנייה מחדש של מטריצת ציפוי בנוקאאוט-DMEM ביחס של 1:80 ואחסנו ב -4 מעלות צלזיוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סכמות ומורפולוגיה של תאים במהלך התמיינות מזנכימלית: התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתאי MSC כרוכה בשלבי התפתחות שונים המשתרעים על פני היווצרות EB, התמיינות MSC והתרחבות MSC (איור 1). במהלך שלבי התפתחות אלה, תאים רוכשים מורפולוגיה שונה בשל כימיקלים מעוררים שונים שהם חשופים להם. עם תחילת ההתמיינות, התאים מצופים בתרחיף וצפויים להיות עגולים, עם גבולות תא מוגדרים, בעוד שקוטרם קטן עד בינוני (איור 2). בחירת תאי הרבייה בתרחיף בשלב הראשוני של ההתמיינות מאפשרת ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה הוא בעל חשיבות עליונה בשל יכולתו לספק MSCs בתפוקה גבוהה וביעילות. ייצור בקנה מידה המוני זה של MSCs התאפשר על ידי דגירה ארעית של EBs הנגזרים מ- iPSCs עם 10 מיקרומטר של RA14,15. טיפול חולף עם 10 מיקרומטר של RA שיפר את תפוקת MSC פי 11.2 עד 1542 פי14,15, כאשר פרוטוקול זה ישים הן על iPSCs והן על hPSCs. במינון ובמשך הטיפול הזה, RA משפר את יכולות ההתרבות וההישרדות של תאים יוצרי EB על ידי ויסות ישיר א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי מענק מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF) (מענק מס' NPRP10-1221-160041). מרים אגאדי נתמכה על ידי מלגת GSRA מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Adiponectin | Abcam | ab22554 | סמן התבגרות אדיפוציטים |
| anti-CD105 | BD Pharmingen | 560839 | סמן התמיינות MSC |
| anti-CD14 | BD Pharmingen | 561712 | MSC סמן התמיינות |
| anti-CD19 | BD Pharmingen | 555415 | MSC סמן התמיינות |
| anti-CD34 | BD Pharmingen | 555824 | סמן התמיינות MSC |
| anti-CD44 | abcam | ab93758 | סמן התמיינות MSC |
| anti-CD45 | BD Pharmingen | 560975 | MSC סמן התמיינות |
| anti-CD73 | BD Pharmingen | 550256 | MSC סמן התמיינות |
| anti-CD90 | BD Pharmingen | 555596 | MSC סמן התמיינות |
| bFGF | מו"פ D | 233-FP | תוסף מדיה תרבית MSC |
| C/EBPA | Abcam | ab40761 | סמן התבגרות אדיפוציטים |
| דקסמתזון | טוריקס | 1126 | תוסף מדיה להבחנה של אדיפוציטים |
| FABP4 | Abcam | ab93945 | סמן התבגרות אדיפוציטים |
| סרום בקר עוברי | ThermoFisher | 10082147 | MSC תוסף מדיה לתרבית |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050-061 | MSC תוסף מדיה לתרבית |
| IBMX | Sigma Aldrich | I5879 | תוסף מדיה לבידול אדיפוציטים |
| Indomethacin | Sigma Aldrich | I7378 | תוסף מדיה להתמיינות אדיפוציטים |
| אינסולין | סיגמא אולדריץ' | 91077C | תוסף מדיה מבדלים של אדיפוציטים |
| נוקאאוט DMEM | ThermoFisher | 12660012 | מדיה בזאלית להכנת מטריג'ל |
| גלוקוז נמוך DMEM | ThermoFisher | 11885084 | MSC מדיה לתרבית |
| Matrigel | Corning | 354230 | מטריצת ציפוי |
| MEM-alpha | ThermoFisher | 12561056 | Adipocyte Differentiation Media |
| Nilered | Sigma Aldrich | 19123 | סמן מיון לאדיפוציטים |
| פניצילין | ThermoFisher | 15140122 | MSC/Adipocyte תוסף מדיה |
| מלח חוצץ פוספט | ThermoFisher | 14190144 | מאגר כביסה |
| Pierce™ 20X TBS מאגר | Thermo Fisher | 28358 | מאגר כביסה |
| PPARG | טכנולוגיית איתות תאים | 2443 | סמן התבגרות אדיפוציטים |
| ReLeSR | תא גזע טכנולוגיות | 5872 | ריאגנט דיסוציאציה |
| חומצה רטינואית | סיגמא אולדריץ' | R2625 | MSC תוסף מדיה התמיינות |
| מעכב רוק | Tocris | 1254/10 | hPSC תוסף מדיה תרבית |
| רוזיגליטזון | סיגמא אולדריץ' | R2408 | תוסף מדיה בידול אדיפוציטים |
| StemFlex | ThermoFisher | A334901 | hPSC מדיה תרבותית |
| Triton | Thermo Fisher | 28314 | מגיב פרמביליזציה |
| טריפסין | ThermoFisher | 25200072 | מגיב דיסוציאציה |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7942 | מאגר כביסה |
מקורות
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
- Wagner, W., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
