מאמר זה מתאר מודל חדש של בעלי חיים שפותח כדי לחקור את האנטומיה וההיסטולוגיה של הקרנית ותהליכי הריפוי שלה. מודל חדש זה של בעלי חיים משתמש בגרביל מונגולי, שיש לו קרנית עם קווי דמיון רבים לקרנית האדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרי ריפוי פצעי הקרנית נערכו במשך זמן רב וסייעו להפחית את הסבל ולפתח טיפולים התורמים לשיפור בריאות העיניים של המטופלים. מבחינה היסטורית, ריפוי הקרנית נחקר במכרסמים כמו עכברים וחולדות, אך ייתכן שמודלים אלה אינם מחקים לחלוטין הפרעות אנושיות. עם זאת, מידע על מכרסמים אחרים כגון גרבילים מונגולים (Meriones unguiculatus) הוא דל במחקר הקרנית.
במאמר זה נתאר טכניקה לפיתוח מודל חדשני של בעלי חיים לחקר ריפוי הקרנית לאחר כריתת קרטקטומיה פוטו-שבירה. בשל הספרות המוגבלת הזמינה על הקרנית של M. unguiculatus, אנו מתארים גם ניתוח היסטולוגי של הקרנית הרגילה. טכניקות מחקר אלה יכולות לשמש גם בחקר מחלות עיניים בגלל הדמיון בין הקרניות של גרבילים מונגולים לבני אדם במונחים של גנטיקה, אנטומיה ופיזיולוגיה.
מבוא
כמה מההיבטים החשובים ביותר של ריפוי פצעים בקרנית, שהם דאגות מרכזיות לניתוח מקטע קדמי, הם שלמות ארכיטקטורת האפיתל, שמירה על שקיפות סטרומה הקרנית, ולבסוף, התוצאה במונחים של תכונות השבירה של הקרנית1.
הקרנית היא הרקמה החיצונית הברורה ביותר בקדמת גלגל העין, ולכן היא רגישה לטראומה, זיהומים וכוויות; הריפוי הלקוי של פצעים אלה עלול לפגוע בבריאות הראייה2.
כיום, מספר מודלים של בעלי חיים זמינים לחקר ריפוי הקרנית, וחלקם טובים יותר מאחרים, בהתאם למין ולסוג המנגנון שיש לחקור1. יש כמה רשומות של חקירות קודמות על הרשתית של גרבילים2. עם זאת, עד כה, אין ספרות שפורסמה על תהליכי הצטלקות בקרנית של מכרסמים אלה.
כאן אנו מציגים את Meriones unguiculatus (גרביל מונגולי) כמודל חייתי לריפוי פצעים בקרנית. מתוארים נהלים להעלאת ריפוי הקרנית לאחר כריתת קרטקטומיה פוטו-שבירה, המאפשרים לנו לחקור את הסוגים השונים של תהליכי הצטלקות הקרנית, להבין ריפוי פצעים במונחים של השלבים הדינמיים של רקמה חיה, ולבסוף, לתכנן טיפולים עתידיים מתאימים3. כריתת קרקטומיה פוטותרפית היא טכניקה הניתנת לשחזור עם אפשרות לשליטה מדויקת בפרמטרים כגון עומק וקוטר הפגיעה בקרנית4. יתר על כן, טכניקה זו אינה דורשת הליכים עם מכשירים כירורגיים או תמיסות כימיות (למשל, תמיסת מלח, פורמלין, אלכוהול וכו ') שעשויים להוסיף משתנים ספציפיים למכשירים או למפעיל המבצע את ההליך5.
שלושה גרבילים זכרים בני 6 חודשים בגדלים ובמשקלים דומים (כ-90 גרם) שימשו לניסוי שהוצג במאמר זה. ההליכים בוצעו רק בעיניים הנכונות. גרביל אחד (המכונה גרביל 1 או בקרה) לא עבר כריתת קרקטומיה פוטותרפית והוכנס להערכת כל מבני העיניים הרגילים. כריתת קרקטומיה פוטותרפית כוללת העברה מבוקרת של אור אולטרה סגול שנוצר על ידי לייזר excimer אל הקרנית ופותחה על מנת לבצע ניתוח שבירה6. הוא שימש מכרסמים אחרים, כגון עכברים7. שני הגרבילים האחרים עברו כריתת רחם פוטותרפית. אחד מהם הוכנס ל-24 שעות (המכונה גרביל 2) והשני ל-96 שעות לאחר הניתוח (המכונה גרביל 3).
כדי לבצע את הניסוי הזה, גרביל שנבחר באקראי צולם עבור כל תנאי שייחקר, אך ניסוי זה בוצע בעבר עם 16 גרבילים בסך הכל עבור כל מצב. מטעמי עריכה, הוחלט להשתמש בגרביל שנבחר באקראי עבור כל תנאי (שלושה גרבילים בסך הכל) כדוגמה.
המטרה העיקרית של מחקר זה היא לחקור את מודל בעלי החיים הטוב ביותר שקיים. עם זאת, חשוב לציין כי לא לכל המינים יש מאפייני עיניים דומים לאלה של העין האנושית8. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה המשמשת לחקר הקרנית של Meriones unguiculatus ואת ההליך שבוצע כדי ליצור את הפגיעה בקרנית, אשר מאפשרים לנו ללמוד את תהליך הריפוי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל נהלי המחקר אושרו על ידי "הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" של אוניברסיטת קטוליקה דה קורדובה ועקבו אחר מדריך מועצת המחקר הלאומית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. נהלים אלה אושרו גם על ידי הרשויות של "הפקולטה לסינסיאס דה לה סאלוד" של אוניברסיטת קטוליקה דה קורדובה ו"המכון דה לה ויסיון סרו".
1. טיפול בגרביל והרדמה
הערה: כל בעלי החיים היו זכרים זכרים ללא פתוגנים (SFP) זכרים מונגולים ונשמרו במתקני המרכז למחקר ופיתוח באימונולוגיה ומחלות זיהומיות (CIDIE) (קורדובה, ארגנטינה). הם התקבלו מאוניברסיטת לה פלאטה (בואנוס איירס, ארגנטינה).
- מאכלסים את הגרבילים מבחינה חברתית בכלובי פוליסולפון עם מצעים מחלוקי תירס. ספק מזון ומי ברז מסוננים בבקבוקי מים ad libitum. ודאו שטווח טמפרטורות החדר הוא 18°C עד 24°C ונעשה שימוש במחזור אור-חושך של 12:12 שעות.
- שקלו כל גרביל בנפרד, וזהו כל אחד מהם כדי למנוע בלבול. לעשות סימן עם סמן דיו בל יימחה על בסיס הזנב של גרביל. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק את אוזנו של הגרביל ועשו סימן באמצעות הסמן הבלתי ניתן למחיקה על אוזנו של המכרסם. אם יש מעבדה וביוטיום גדול, הקצו כלוב ייחודי לכל מכרסם עם הזיהוי המתאים.
- חטא את מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית עם תמיסת אתנול של 70%. הניחו את כל הכלים הכירורגיים והחד פעמיים כולל מחטים, מזרקים ומדפים באזור העבודה שבתוך מכסה המנוע. הניחו גם קצף כירורגי חד פעמי במכסה המנוע.
- השתמש במיכל פלסטיק קטן ופתוח כדי לשמור על המכרסם על איזון הדיוק כדי להקל על המדידה.
- השתמש בשלושה גרבילים מונגולים זכרים בני 6 חודשים בגדלים ובמשקלים דומים (~ 80 גרם) לניסוי זה. בזה אחר זה, הניחו כל כלוב עם המכרסם בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית. פתחו את הכלובים, זיהו כל אחד מהגרבילים ושקלו אותם על המאזניים.
הערה: גרבילים הם בעלי חיים לא מזיקים אך עדינים. יש ללבוש כפפות חד פעמיות בעת הטיפול בגרבילים. - אחזו בגרביל ביד הלא דומיננטית כדי להחזיק אותו בחוזקה בזנב. השתמש ביד הדומיננטית, עם האגודל והאצבע המורה מאחורי האוזניים, כדי להחזיק את החיה כאשר אזור הגחון פונה כלפי מעלה. השתמש באצבע הקטנה כדי להחזיק את הזנב.
- למלא מזרק עם מחט 30 גרם עם 1 מ"ל של קטמין וקסילזין. יש לתת את ההרדמה באופן תוך-צפקי לתוך המכרסם (50-100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-2 מ"ג/ק"ג קסילזין)9 באמצעות היד הדומיננטית. משך ההשפעה יהיה כ 20-50 דקות (וריאציות עשויות להתרחש).
- כדי לוודא שהגרביל מורדם במלואו, יש לבדוק עם צביטה בבוהן, כיווץ זנב, השתקפות הקרנית וכו', לפני ביצוע חתכים בקרנית.
הערה: יש לבצע את כל ההליכים בעין ימין בלבד.
2. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) של הקרנית
- הניחו וילונות כירורגיים סטריליים כדי להגן על הציוד מפני הפרשות או שיער של בעלי חיים.
- ודא שאחד המפעילים מחזיק את החיה בזמן שמפעיל אחר מצלם את התמונות. על המפעיל להניח את ידיו על הציוד תוך החזקת הגרביל כך שעינו של הגרביל תהיה יציבה ככל האפשר ועדיין ניתנת ללימוד. הנח את היד האוחזת בגרביל על משענת הסנטר..
- הפעל את התוכנה השולטת ב- OCT ולחץ על צלם תמונה ולאחר מכן שמור את התמונה הרצויה. בצע פרוסות סגיטליות וקורונליות מרובות של הקרנית. דמיינו את העין מתחת ל-OCT, וצרו פרוסות מרובות כדי לראות את המקטע הקדמי של קרנית המכרסמים.
הערה: אם התמונה המתקבלת אינה חדה והעין זזה מעט, חזור על ההליך מספר פעמים כדי לקבל מספיק תמונות. - באמצעות תוכנת OCT, בצע מדידות פכימטריות של האזורים המרכזיים וההיקפיים. במסך הראשי של התוכנה, לחץ על צלם תמונה ולאחר מכן לחץ על שמור תמונה רצויה לחצן.
- בצע מדידות על העין הרגילה או שליטה ומיד לאחר כריתת קרקטומיה פוטותרפית על עיני המכרסם האחרות.
3. כריתת קרטקטומיה פוטותרפית בלייזר אקסימר (PTK)
- הניחו וילונות כירורגיים סטריליים על מכשיר הלייזר האקסימר כדי להגן על הציוד מפני הפרשות או שיער בעלי חיים.
- החדירו טיפה של פרופראקאין הידרוכלוריד מקומי (0.5%) בעין לטיפול 5 דקות לפני ההליך הכירורגי.
- השתמש ביד הלא דומיננטית כדי להחזיק את הגרביל בחוזקה. עם היד הדומיננטית, פתחו את עפעפי החיה כך שניתן יהיה לצלם את התמונות כראוי. כדי להיות מסוגל להתמקד ולקבל תמונה חדה, ודא כי הידיים של האדם מחזיק את גרביל לנוח על הראש של הציוד. הניחו את הידיים המחזיקות את החיה במקום שבו המטופל יניח את צווארו.
- בצע אבלציה PTK בעין ימין. השתמש בפרמטרים הבאים: אבלציה בעובי שבין 60 מיקרומטר ל-62 מיקרומטר, אזור אופטי של 3 מ"מ, משך זמן של 4 שניות וסך הכל 1,867 פולסים.
הערה: PTK מבוצע רק על גרביל 2 וגרביל 3. בשלב זה, המפעיל השני מכין ומפעיל את הלייזר כדי לנפח את רקמת הקרנית. - מיד לאחר ההליך, לצלם ולבצע ניתוח OCT כדי להקליט ולתעד שינויים פני השטח בעיניים המטופלות.
- לאחר השלמת ההליך, החזירו את המכרסם לכלוב, עקבו אחר הסימנים החיוניים (קצב לב: 360 פעימות לדקה; טמפרטורה רקטלית: 37-38.5 מעלות צלזיוס; קצב נשימה: 90 נשימות לדקה), ותנו לחיה להתאושש מההרדמה.
4. התעוררות הגרבילים לאחר PTK הקרנית
- מתן בופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג עד 0.05 מ"ג/ק"ג) ואטיפמזול (0.1-1 מ"ג/ק"ג) באמצעות זריקות תוך-צפקיות.
- מניחים כל גרביל בכלוב הביתי המתאים לו, ועוקבים אחר הסימנים החיוניים להתעוררות נורמלית (טמפרטורת הגוף הרגילה היא 37-39 מעלות צלזיוס).
- החל משחה אריתרומיצין כדי לשמור על פני השטח נקי ולמנוע זיהום. בצע הליך זה פעמיים ביום.
- לתת buprenorphine (כל 6-12 שעות) תת עורית (0.01-0.05 מ"ל) עבור משכך כאבים ומשחה עיניים על יומיים רצופים לאחר PTK.
5. שיטת המתת חסד
- בצע המתת חסד בכלוב הביתי במידת האפשר.
- הכנס גז פחמן דו חמצני דחוס (CO2) לכלוב הביתי. קצב מילוי של 30%-70% מנפח התא לדקה עם CO2 נוסף לאוויר הקיים בכלוב הביתי מספיק כדי להשיג תערובת העונה על המטרה (עבור תא נפח 10 ליטר, השתמש בקצב זרימה של 3-7 ליטר לדקה). השתמש פריקת צוואר הרחם (כשיטה משנית של המתת חסד) כדי להבטיח את מותו של המכרסם.
- בשעה 24 שעות ו-96 שעות לאחר ניתוח לגרביל 2 וגרביל 3, בהתאמה, הסר את החיה מהכלוב הביתי כדי לבצע את האנקולציה של גלגל העין (הן גלגל העין הרגיל והן זה שעובר ניתוח) כדי לצפות בריפוי הקרנית.
- מניחים את החיה על שולחן הניתוחים, ובודקים אם אין דופק במשך כדקה.
6. ניתוח עיניים
- הסר את העפעפיים העליונים והתחתונים כדי לקבל גישה לגלגל העין. השתמש מלקחיים כירורגיים ומספריים כדי להסיר את העפעפיים. גודלו של אזור העבודה כה קטן ועדין, עד כי הסרת העפעפיים מאפשרת לגלגל העין להיות עטוף מבלי לפגוע בו.
- כדי לעטוף את גלגל העין, לעשות חתך בקנטוס החיצוני, ולהנחות את המספריים בכיוון האחורי. חזור על הליך זה מן canthus הפנימי על ידי הפרדת גלגל העין מן המסלול.
- חתך את עצב הראייה בחלק האחורי של גלגל העין. יש להבהיר כי מקלעת המסלול האחורי בדרך כלל יוצר דימום קל בעת ביצוע טכניקה זו, מה שהופך את העבודה קשה.
- הכנס את גלגל העין לתוך צינור microcentrifuge עם תמיסת מלח סטרילית במשך 30 שניות עד 1 דקות כדי לשטוף את כל שאריות הדם.
- מניחים את גלגל העין בצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 10% פורמלדהיד לניתוח אנטומו-פתולוגי לאחר מכן כמתואר להלן. צלם תמונות וצילומים מרובים.
7. ניתוח אנטומי-פתולוגי
- הטמע את כל העין ב-10% פורמלין דחוס למשך 6-24 שעות.
- חותכים את הרקמה באמצעות מיקרוטום. ודא כי רקמת לחתוך יש עובי של 3 מ"מ.
- השרו את הרקמה ב-96% אלכוהול למשך 30-90 דקות, וחזרו על הליך זה פעמיים.
- מניחים את הרקמה באלכוהול איזופרופיל למשך 30-90 דקות, וחוזרים על הליך זה פעמיים.
- שים את הרקמה בתחליף קסילן או קסילן למשך 1-3 שעות.
- הטמע את הרקמה בנפט נוזלי למשך שעה אחת לפחות.
- השתמש בלוק כדי למקם את הרקמה ולהטביע אותו פרפין נוזלי. אפשרו לו להתמצק (הניחו אותו במקום קר), וחתכו אותו.
- הכינו את המיקרוטום לחיתוך בהתאם להוראות היצרן.
- לאחר מכן, להשתמש כתמים כגון hematoxylin ו eosin.
- השג תמונות עם המצלמה שנוספה למיקרוסקופ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר הנוכחי, כל מבנה הקרנית נותח ביסודיות באמצעות טכניקות היסטולוגיות ומחקרים משלימים של הקטע הקדמי, כגון טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. ניתוח התמונה באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של מבני המקטעים הקדמיים מראה אפיתל וסטרומה תקינים (איור 1), עם עובי קרנית מרכזי והיקפי של 160 מיקרומטר ו-106 מיקרומטר ± 2 מיקרומטר, בהתאמה. פרסומים אחרים הראו גם כי הקרנית של מכרסמים אחרים הופכת דקה יותר לכיוון הפריפריה10.
לאחר PTK נצפתה התדרדרות של אפיתל הקרנית ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפיזיולוגיה של ריפוי פצעי הקרנית היא איזון בין התחדשות רקמות לבין שמירה על הומאוסטזיס. ריפוי פצעים מוגזם עלול להוביל לפיברוזיס והצטלקות, מה שעלול בסופו של דבר לגרום לאובדן תפקוד האיברים. עם ההתפתחות המהירה של הליכים כירורגיים בקרנית, לא ניתן להפריז בחשיבות של הבנת ריפוי פצעי הקרנית והאירועים הפיזיולוגיים והפתולוגיים המעורבים11.
עבודות מחקר רבות טוענות כי לגרבילים יש מאפיינים חושיים רבים שהופכים אותם למין חיובי למחקרי ראייה, כולל בעיקר התנהגות יומית12<...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות למהנדס רודריגו דה לה פואנטה על עזרתו והתמיכה הטכנית שלא יסולא בפז. אנו מודים גם למריה יוג'ניה קורבלה על הקריינות ולפריסילה הזרון על מהדורת הדמויות. הוגו לוג'אן איפשר לנו להשתמש במתקנים במרכז למחקר ופיתוח באימונולוגיה ומחלות זיהומיות (CIDIE).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| הרדמה | Tododrogas | ||
| Eppendorf צינורות | Tododrogas | ||
| Excimer לייזר | Technolas | 2022445 | |
| Fluorescein | Poen | ||
| מלקחיים | Ofcor | 3339 | |
| פורמלדהיד | Tododrogas | ||
| כפפות | Tododrogas | ||
| קטמין | Sigma-Aldrich | ||
| טומוגרפיה קוהרנטית אופטית | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| מספריים | Ofcor | 3336 | |
| וילונות סטריליים | Soporte hospitalario | ||
| גזה סטרילית | Soporte hospitalario | ||
| מזרקים ומחטים | Tododrogas | ||
| קסילזין | סיגמא-אולדריץ' |
מקורות
- Kuo, I. C. Corneal wound healing. Current Opinion in Ophthalmology. 15 (4), 311-315 (2004).
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J. Corneal epithelial wound healing. Indian Journal of Ophthalmology. 51 (1), 5-15 (2003).
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Experimental Biology and Medicine. 226 (7), 653-664 (2001).
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S. Phototherapeutic keratectomy. Indian Journal of Ophthalmology. 60 (1), 5-14 (2012).
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071(2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903(2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
