אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

תאי דו-תאי ליפידים משמשים כתאים סינתטיים לדוגמה לחקר תגובות אורגניות סגורות ותהליכים מבוססי ממברנה או כמודלים נשאים ביישומי אספקת תרופות ^1,2. ביולוגיה מלמטה למעלה עם רכיבים מטוהרים דורשת מערכות ניסוי מינימליות כדי לחקור תכונות ואינטראקציות בין ביומולקולות, כגון חלבונים ושומנים ^3,4. עם זאת, עם התקדמות התחום, יש צורך גובר במערכות ניסוי מורכבות יותר המחקות טוב יותר את התנאים בתאים ביולוגיים. אנקפסולציה ב- GUVs היא גישה מעשית שיכולה להציע חלק מהתכונות דמויות התאים הללו על ידי מתן דו-שכבת שומנים מעוותת וחדירה באופן סלקטיבי ומרחב תגובה מוגבל. בפרט, שחזור חוץ גופי של מערכות שלד ציטוסקטליות, כמודלים של תאים סינתטיים, יכול להפיק תועלת מאנקפסולציה בתאי ממברנה⁵. חלבונים ציטוסקטליים רבים נקשרים ומתקשרים עם קרום התא. מכיוון שרוב מכלולי השלד הציטוסקטליים יוצרים מבנים המשתרעים על פני כל התא, צורתם נקבעת באופן טבעי על ידי כליאה בגודל תא⁶.

שיטות שונות משמשות ליצירת GUVs, כגון נפיחות ^7,8, היתוך שלפוחית קטן ^9,10, העברת תחליב^11,12, סילון פועם¹³, וגישות מיקרופלואידיות אחרות^14,15. למרות ששיטות אלה עדיין בשימוש, לכל אחת מהן יש את המגבלות שלה. לפיכך, גישה חזקה ופשוטה עם תפוקה גבוהה של אנקפסולציה GUV היא רצויה מאוד. אף על פי שטכניקות כגון נפיחות ספונטנית ואלקטרוסוולינג מאומצות באופן נרחב ליצירת GUVs, שיטות אלה תואמות בעיקר להרכבי שומנים ספציפיים¹⁶, מאגרי ריכוז מלח נמוכים¹⁷, גודל מולקולרי אנקפסולנטי קטן יותר¹⁸, ודורשים נפח גבוה של האנקפסולנט. התמזגות של שלפוחיות קטנות מרובות לתוך GUV היא שלילית מטבעה מבחינה אנרגטית, ולכן דורשת ספציפיות בהרכבי שומנים טעונים⁹ ו/או חומרים חיצוניים הגורמים לאיחוי, כגון פפטידים¹⁹ או כימיקלים אחרים. העברת תחליב ושיטות מיקרופלואידיות, לעומת זאת, עשויות לדרוש ייצוב טיפות באמצעות פעילי שטח והסרת ממסים לאחר היווצרות דו-שכבתית, בהתאמה^18,20. המורכבות של מערך הניסוי והמכשיר בטכניקות מיקרופלואידיות כגון סילון פועם מטילים אתגר נוסף²¹. cDICE היא שיטה מבוססת אמולסיה הנגזרת מעקרונות דומים המסדירים העברת תחליב^22,23. תמיסה מימית (תמיסה חיצונית) ותערובת שומנים-שמן מרובדים על ידי כוחות צנטריפוגליים בתא גלילי מסתובב (תא cDICE) היוצרים ממשק רווי שומנים. טפטוף של טיפות מימיות חד-שכבתיות של שומנים חד-שכבתיים לתוך תא ה-cDICE המסתובב גורם לרוכסן של דו-שכבתי כאשר טיפות חוצות את הממשק רווי השומנים אל תוך התמיסה המימית החיצונית^22,24. גישת cDICE היא טכניקה חזקה עבור אנקפסולציה של GUV. עם השיטה המתוקנת המוצגת, לא רק תפוקת השלפוחית הגבוהה האופיינית ל- cDICE עם זמן אנקפסולציה קצר משמעותית (כמה שניות) מושגת, אלא שזמן יצירת GUV המאפשר תצפית על תהליכים תלויי זמן (למשל, היווצרות רשת ציטוסקטלית של אקטין ציטוסקלית) מצטמצם באופן משמעותי. הפרוטוקול לוקח בערך 15-20 דקות מההתחלה לאיסוף GUV והדמיה. כאן, יצירת GUV מתוארת באמצעות שיטת cDICE שעברה שינוי לעטיפת חלבונים קושרי אקטין ואקטין (ABPs). עם זאת, הטכניקה המוצגת ישימה לתמצות מגוון רחב של תגובות ביולוגיות ואינטראקציות עם ממברנות, החל מהרכבת ביופולימרים, דרך ביטוי חלבונים ללא תאים וכלה בהעברת מטען מבוססת היתוך ממברנה.

1. הכנת תערובת שמן-שומנים

הערה: הצעד צריך להתבצע במכסה אדים בהתאם לכל הנחיות הבטיחות לטיפול בכלורופורם.

1. קח 0.5 מ"ל של כלורופורם בבקבוקון זכוכית 15 מ"ל. הוסיפו 88 μL של 25 מ"ג/מ"ל דיאוליאויל-פוספוכולין (DOPC), 9.3 μL של 50 מ"ג/מ"ל כולסטרול, ו-5 μL של 1 מ"ג/מ"ל דיאוליאויל-פוספואתנולמין-ליסאמין-ליסמין רודמין B (רודמין PE) (ראו טבלת חומרים) לתוך בקבוקון הזכוכית של 15 מ"ל.
   הערה: השברי השומה הסופיים של DOPC וכולסטרול בשמן סיליקון/מינרלי הם 69.9% ו-30%, בהתאמה. נקבע כי 20-30 מול% כולסטרול הוא ריכוז אופטימלי לנזילות הממברנה וליציבות של GUVs שנוצרו באמצעות הטכניקה המוצגת^25,26. מבחינה פיזיולוגית, ערכים אלה נמצאים היטב בטווח ריכוזי הכולסטרול המצויים בקרום^הפלזמה של תאי יונקים 6. מלאי שומנים נרכשים כפתרונות בכלורופורם ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. בקבוקוני מלאי שומנים צריכים להיות מאוכלסים לטמפרטורת החדר לפני שהם נפתחים.
2. פיפטה 7.2 מ"ל של שמן סיליקון ו-1.8 מ"ל של שמן מינרלי בבקבוקון שני של 15 מ"ל (ראו טבלת חומרים). בדרך כלל, זה צריך להיעשות בתא כפפות בלחות נמוכה, בעיקר אם נעשה שימוש חוזר בשמן המינרלי.
3. מערבבים את השמנים על ידי מערבולת במהירות הסיבוב המרבית (3200 סל"ד) למשך 10 שניות, מוסיפים את התערובת לבקבוקון המכיל את תערובת השומנים בכלורופורם ומניחים אותה מיד על מערבל המערבולות. מערבולת ל-10-15 שניות במהירות הסיבוב המרבית (3200 סל"ד). תערובת השומנים בשמן שנוצרת צריכה להיות מעט עכורה, שכן השומנים אינם מומסים במלואם בשמן אלא מפוזרים כאגרגטים קטנים²⁴.
4. שים את פיזור השומנים בשמן בסוניקטור אמבטיה (ראה טבלת חומרים) עם הספק על-קולי של 80 W ותדר הפעלה של 40 קילוהרץ בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש להשתמש בתערובת באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לכל היותר.

2. יצירת שלפוחית

1. הרכיבו את הפיר המודפס בתלת-ממד (קובץ משלים 1) העשוי משרף שחור (ראו טבלת חומרים) על לוח ההתעוררות של הספסל והגדירו את מהירות הסיבוב ל-1,200 סל"ד.
2. הרכיבו את תא ה-cDICE המודפס בתלת-ממד (קובץ משלים 2) העשוי משרף שקוף (ראו טבלת חומרים) על הפיר (איור 1A,B).
3. הכן פתרונות אקטין וחלבונים קושרי אקטין (ABP) בנפרד בנפח כולל של 20 μL.
   1. הכן 1-10 מיקרומטר של אקטין במאגר אקטין כדורי (G-buffer), כולל 10% ATTO 488 אקטין (ראה טבלת חומרים).
      הערה: 1x G-buffer מורכב מ-5 mM של Tris-HCl, pH 8.0 ו-0.2 mM של CaCl₂.
   2. הוסיפו חיץ פילמור אקטין נימה (F-buffer) כדי להתחיל בפולימריזציה של אקטין על קרח. שמור את הפתרונות על קרח כדי להאט את הפילמור של אקטין לפני הוספת crosslinker.
      הערה: מאגר F 1x מכיל 50 mM של KCl, 2 mM של MgCl₂, ו-3 mM של ATP ב-10 mM של Tris, pH 7.5.
   3. המתן במשך 15 דקות כדי לאפשר ייזום של פילמור אקטין על קרח לפני שתוסיף לינקרים צולבים בעלי עניין ביחס הטוחנת הרצוי. שמור את התמיסה על קרח עד לעטיפה.
   4. הכינו חלבונים קושרי אקטין (ABPs) בנפרד במיקרו-צינור (איור 1C).
      הערה: שלב זה מבוצע כאשר שילוב של ABPs (למשל, מיוזין, α-אקטינין, fascin, Arp2/3 complex) מתמצת עם אקטין 25,26,27. במקרים כאלה, הכמות הרצויה של כל ABP נלקחת מהמלאי שלה ומתווספת למיקרו-טיוב המיועד ל-ABPs. מכיוון שהפתרון הכולל הוא להיות 20 μL, יש להכין ציטוטים מלאי של ABPs כך שהכמות הרצויה של תערובת ה- ABP הכוללת לא תעלה על 5-6 μL. ה- ABP היחיד המשמש בתוצאות המייצגות כאן הוא קסם, שהכנתו מוזכרת להלן.
      1. Aliquot 1.57 μL של fascin מתוך 1.75 מ"ג /מ"ל של מלאי fascin (ראה טבלת חומרים), ולהוסיף ישירות לתמיסת אקטין בשלב 2.7. זה מתאים 2.5 μM של fascin בתמיסה.
4. הוסף 7.5% ממדיום גרדיאנט הצפיפות (ראה טבלת חומרים) לתמיסת האקטין כדי ליצור גרדיאנט צפיפות בין הפאזה החיצונית והפנימית מימית כדי להקל על שקיעת GUV.
5. מחלקים 700 μL של התמיסה החיצונית של 200 mM של גלוקוז לתוך החדר (איור 1D, משמאל).
   הערה: התנודות של התמיסה הפנימית קובעות את ריכוז הגלוקוז. עבור ניסויים אלה, האוסמולריות של התמיסה הפנימית היא ~ 200 mOsm, ולכן תמיסת גלוקוז של 200 mM משמשת כפתרון החיצוני.
6. הוסיפו כמות מספקת של תערובת שמן שומנים (>3 מ"ל בהתבסס על גודל התא) לתוך התא עד למילוי של 60%-80% מהתא (איור 1D, מימין). ייווצר ממשק בין תערובת השומנים-שמן לבין התמיסה החיצונית.
7. העברת ABPs (שהוכן בשלב 2.3.4) לפתרון אקטין. באמצעות פיפטה רגילה של 100-1000 μL, מעבירים מיד את ה-700 μL של תערובת השומנים-שמן לתערובת האקטין-ABP (איור 1E, משמאל). פיפטה למעלה ולמטה 8 פעמים כדי ליצור טיפות חד-שכבתיות בגודל תא בקוטר של 7-100 מיקרומטר (איור 1E, אמצע).
   הערה: יש להשלים את שלב 2.7 תוך מספר שניות כדי להימנע מכל הרכבה של רשת אקטין לפני האנקפסולציה. לכן, לפני ביצוע הצעד, ודא כי קצות פיפטה כבר מוכנסים לתוך pipettes מוכן להעביר את התערובות.
8. באמצעות אותה פיפטה של 100-1000 μL, מיד מחלקים את כל האמולסיה לתא המסתובב. טיפות ירכשו עלון שני של שומנים על ידי חציית מונו-שכבת השומנים בממשק הפתרון החיצוני של השמן, ובכך ייצרו GUVs (איור 1E, מימין).
9. מוציאים את התא מצלחת הערבוב ומשליכים את רוב תערובת השומנים-שמן על ידי הטיית התא במיכל הפסולת כך שחלק גדול מתערובת שמן השומנים מנוקז מהפתח הגדול שבמרכז התא.
   הערה: בדרך זו, תערובת שמן השומנים נמשכת מהתא, תוך הימנעות מערבוב של תערובת שמן שומנים עם התמיסה החיצונית בשלב הבא.
10. החזיקו את התא כשהמכסה שלו פונה לכיוון המשתמש. פתחו את מכסה התא והטו מעט את התא לכיוון המשתמש. הממשק בין התמיסה החיצונית המכילה GUVs לבין תערובת שמן השומנים נראה מפתח התא (שם נמצא המכסה).
11. באמצעות פיפטה, אספו מספיק תמיסות חיצוניות המכילות GUVs וחלקו 50-300 מיקרול' של הפתרון החיצוני לצלחת של 96 בארות כדי להשיג צפיפות מתאימה של GUVs.
    הערה: בעקבות פרוטוקול זה, בסך הכל כ-2 x 10⁵ GUVs משוחררים בפתרון החיצוני בתוך התא. פיזור ה-GUV לא כומת; עם זאת, הקוטר של כ -90% של GUVs הוא בטווח של 12-30 μm. GUVs עם כל קוטר בטווח של 7-50 מיקרומטר ניתן למצוא באוכלוסייה. בהתאם למדיום שיפוע הצפיפות העטוף, גודל ה-GUV ועומק הפתרון בלוח הבאר, לוקח ל-GUVs 2-15 דקות להתיישב על פני השטח. התשואה של GUVs עם חבילות אקטין משוחזרות היא כ -90%.

3. הדמיה ושחזור תמונה בתלת-ממד

1. הגדר את לוחית הבאר 96 על הבמה של מיקרוסקופ הפוך המצויד ביחידת קונפוקל של דיסק מסתובב (או סריקת לייזר), EMCCD או מצלמת sCMOS, ועדשת מטרה טבילת שמן 60x (ראה טבלת חומרים).
2. התמקד בכל אזור עניין (ROI) וקח רצף תמונות z-stack מה- ROI עם מרווח z-step של 0.5 מיקרומטר.
   הערה: מכיוון שניתן לעקור מעט את ה-GUVs על פני השטח לאורך זמן, מומלץ לצלם קבוצה מרובת אורכי גל של תמונות בכל מישור z אם מצלמים פלואורופורים מרובים, כלומר לצלם קבוצה של תמונות של 561 ננומטר ו-488 ננומטר בכל נתיב z בכל פעם כדי ללכוד תמונות ATTO 488 actin ו-Rhod PE.
3. שמור כל רצף תמונה של z-stack בתבנית .tiff.
4. פתח רצף תמונות בעל עניין בתוכנת עיבוד תמונה (ImageJ/Fiji). זהה את התמונה בעוצמה הגבוהה ביותר. החזק את "ctrl+shift+c" כדי לפתוח את החלון בהירות וניגודיות ולחץ על איפוס.
5. מתפריט ImageJ/Fiji, עבור אל נתח > הגדר קנה מידה והזן את המרחק הפיזי הידוע ואת היחידה שלו עבור כל פיקסל תמונה.
6. מתפריט ImageJ/Fiji, עבור אל Image > Stacks > פרויקט תלת-ממד כדי לשחזר תמונה תלת-ממדית ממחסנית z. הגדר את "שיטת ההקרנה" כנקודת בהירות, "ריווח פרוסות (μm)" כ - 0.5, וסימן ביקורת אינטרפולציה. ניתן להשתמש באפשרויות ברירת המחדל עבור שאר ההגדרות.
   הערה: ייתכן שמרווחי z במיקרוסקופים מסוימים אינם מכוילים, והתנועה בפועל בכיוון z עשויה להיות שונה במקצת מהמרווח z שהוזן (כלומר, 0.5 מיקרומטר). במקרים כאלה, ניתן להשתמש בדגימת כיול תלת-ממדית כגון מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות בקוטר ידוע כדי לקבל את מרווח ה-z בפועל. ערך זה ישמש אפוא כ"מרווח פרוסות (μm)" עבור הקרנה תלת-ממדית.

כדי להדגים את הדור המוצלח של GUVs של שלדיים באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, נבנו מחדש מבנים של צרור קסין-אקטין ב-GUVs. Fascin הוא קרוסלינקר קצר של חוטי אקטין היוצר צרורות אקטין נוקשים המיושרים במקביל ומטוהר מ- E. coli כחלבון היתוך גלוטתיון-S-טרנספראז (GST)26. 5 μM של אקטין שוחזר לראשונה, כולל 0.53 μM של ATTO488 אקטין במאגר פילמור אקטין ו-7.5% ממדיום שיפוע הצפיפות. עם הוספת קסין בריכוז של 2.5 מיקרומטר ועטיפת תערובת הפאסין-אקטין, נוצרו מבני צרור אקטין ב-GUVs. רצפי תמונה קונפוקליים של Z-stack של מבני צרור האקטין העטופים ב-GUVs המסומנים ב-PE של רודמין נלכדו 1 שעות לאחר האנקפסולציה (איור 2A). באמצעות פרוטוקול זה, התחרות האינהרנטית והמיון של האקטין קרוסלינקרים, α-אקטינין ופאסין, שיחד יוצרים תבניות שונות של צרור אקטין באופן תלוי גודל GUV, הודגמו בעבר26.

בדומה לגישת האמולסיה ההפוכה ששונתה שהוצגה כאן, תהליך ה-cDICE המסורתי מייצר GUVs שלדיים ציטוסקטליים בעלי תפוקה גבוהה אך דורש משאבת מזרקים ומערך צינורות להזרקה מבוקרת של תמיסת חלבון לתא המסתובב בקצבי זרימה נמוכים בסדר גודל של ננו-ליטרים לשנייה22,28. בגישה זו, האמולסיה נוצרת ישירות בתא cDICE המסתובב; נימי דק מוכנסים לשלב השמן. תמיסת החלבון מוזרקת דרך משאבת מזרק. טיפות נוצרות ונגזזות בקצה הנימי לפני שהן נעות לעבר השלב החיצוני המיימי, שם הן הופכות ל-GUVs, בדומה לשיטה שתוארה לעיל. איור 2B מראה שלפוחיות שמתמצתות תערובת תגובות באמצעות גישה זו. תערובת התגובה מכילה 6 μM של אקטין אשר צרור על ידי 0.9 μM של fascin. כאן, שתי השיטות והתוצאות שלהן אינן מושוות אך יש לציין כי שתיהן מייצרות תפוקה גבוהה של GUVs.

איור 1: מערך ניסיוני ליצירת GUVs. (A) תצוגה עליונה ותצוגת מקטע צדדי של תא ה-cDICE. (ב) תמונות של ההתקנה של התא המסתובב. (ג-ה) איורים סכמטיים של נהלים stepwise ליצירת GUVs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: אנקפסולציה של מבני צרור אקטין. (A) התמונות מציגות פרוסות קונפוקליות פלואורסצנטיות מייצגות של GUVs (משמאל) והקרנות מקסימליות של ערימת z קונפוקלית של ערוצי אקטין וליפידים (מימין). Fascin, 2.5 μM; אקטין, 5 מיקרומטר (כולל 10% ATTO 488 אקטין). סרגל קנה מידה = 10 μm. (B) אנקפסולציה של מבני צרור אקטין באמצעות cDICE קונבנציונלי. התמונה מציגה הקרנה מקסימלית מייצגת של תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות של צרורות אקטין עטופים שנוצרו בנוכחות קסם. Fascin, 0.9 μM; Actin, 6 μM. סרגל קנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: עיצוב פיר מודפס בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: עיצוב עבור תא cDICE המודפס בתלת-ממד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.