מאמר שיטה

תהליך ביולוגי סופח משפר את תפוקת המלנין מ-Pseudomonas stutzeri

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63339

⸱

12 בינואר 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול על תהליך ביולוגי סופח לייצור מוצר ביולוגי, במיוחד פיגמנט המעכב את הביוסינתזה שלו ומעכב את צמיחת המיקרואורגניזם המייצר אותו.

תקציר

מלנינים הם פיגמנטים טבעיים, והנוכחות של טבעת אינדול וקבוצות פונקציונליות רבות הופכת את המלנין לבחירה אידיאלית עבור יישומים רבים כגון חומרי הגנה מפני UV, טיפוח עור, קוסמטיקה וכו'. Pseudomonas stutzeri ימי מייצר מלנין ללא תוספת טירוזין. עיכוב המשוב נצפה על ידי מלנין בתרבית של חיידק ימי המייצר מלנין, Pseudomonas stutzeri. המלנין הדגים גם עיכוב גדילה מיקרוביאלית. הניתוח המבוסס על מודל Han-Levenspiel זיהה עיכוב מוצר מסוג לא תחרותי של מלנין על צמיחת התאים. אנזים טירוזינאז, המייצר מלנין, עוכב על ידי מלנין. העלילה ההדדית הכפולה של התגובה האנזימטית בנוכחות ריכוזי מלנין שונים חשפה עיכוב תוצר לא תחרותי. פותח תהליך ביולוגי סופח מבוסס ספיחה כדי להפחית את עיכוב המשוב על ידי מלנין. סופחים שונים נבדקו כדי לבחור את הסופח הטוב ביותר לספיגת מלנין. המינון והזמן עברו אופטימיזציה לפיתוח התהליך הביולוגי הסופג, מה שהביא לשיפור של פי 8.8 בייצור המלנין על ידי החיידק הימי Pseudomonas stutzeri (153 מ"ג/ליטר עד 1349 מ"ג/ליטר) ללא תוספת של טירוזין ותמצית שמרים.

מבוא

מלנינים הם תרכובות פוליפנול שהיחידה המונומרית שלהן היא טבעת האינדול. מלנינים אחראים לרוב הצבעים השחורים, החומים והאפורים של צמחים, בעלי חיים ומיקרואורגניזמים1. המלנינים הנפוצים ביותר הם אומלנין, שהם פיגמנטים חומים כהים או שחורים המופצים באופן נרחב בבעלי חוליות וחסרי חוליות2. צפלופודים, צמחים ומיקרובים הם המקורות העיקריים למלנין3. למלנין המתקבל ממיקרואורגניזמים יש מספר יתרונות על פני מלנין מצפלופודים וצמחים. הם מהירים בצמיחה ואינם גורמים לבעיות של וריאציות עונתיות. כמו כן, הם משנים את עצמם בהתאם למדיום הגידול ולתנאי ההפעלה המסופקים. בהתחשב בכל העובדות הללו, המקורות המיקרוביאליים מנוצלים כמקור עיקרי למלנין עם יישומים מסחריים פוטנציאליים 4,5,6. Guo ואחרים השתמשו ב-Streptomyces kathirae SC-1 רקומביננטי כדי לייצר מלנין עד 28.8 גרם/ליטר במדיום אופטימלי7. Lagunas-Muñoz et al. השיג כ -6 גרם לליטר מלנין ב- E. coli 8 רקומביננטי. וואנג ועמיתיו השיגו כ-4.2 גרם/ליטר של מלנין מסיס לאחר אופטימיזציה בינונית9. חוקרים חקרו גם תרבויות ימיות כדי לייצר מלנין. קיראן ואחרים ייצרו מלנין ממיני Pseudomonas ימיים10. קומאר ועמיתיו בודדו את Pseudomonas stutzeri HMGM-7 מאצות ימיות, שייצרו מלנין במרק תזונתי. כל יצרני המלנין המדווחים זקוקים לתוספי מזון בינוניים, תמצית שמרים ו/או פפטון לייצור מלנין, מה שעלול לעכב את הגדלת התהליך הביולוגי. Raman et al. חקרו את ייצור המלנין מ-Aspergillus fumigatus AFGRD105, שלא דרש תוספים יקרים11.

חיידק ימי הידוע בשם Pseudomonas stutzeri, מבודד מאצות, נבחר לייצור מלנין. מיקרואורגניזם זה אינו דורש תוספת של תמצית טירוזין ושמרים לייצור מלנין מסיס וגדל במצע על בסיס מי ים, ובכך מפחית את טביעת הרגל של מי השתייה ואת העלות הבינונית. Thaira et al. דיווחו על תהליך ביולוגי אופטימלי באמצעות קמח עוגת קוקוס לייצור ננו-פיגמנט מלנין באמצעות חיידק ימי זה בפרסום קודם12. המלנין המיוצר שימש להסרה יעילה ביותר של מתכות כבדות ממי התהום הסינתטיים. עם זאת, במהלך אופטימיזציה בינונית, זוהה עיכוב משוב סביר של מלנין על הגידול והיווצרות המוצר. לכן, בפרוטוקול זה, עיכוב משוב של מלנין נחקר ומכומת באמצעות מודל האן-לבנשפיל הכללי. פרוטוקול ביו-תהליכי ספיחה פשוט ויעיל פותח כדי להפחית את עיכוב המשוב במידה המקסימלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גידול ותחזוקה של תרבות Pseudomonas stutzeri .

  1. השג את החיידק Pseudomonas stutzeri מ- MTCC Chandigarh (מסופק כאמפולה מיובשת בהקפאה).
    1. יש לחטא את פני האמפולה באלכוהול (70%). סמן את האמפולה ליד אמצע המד ושבר באזור המסומן.
      הערה: יש לנקוט בזהירות בפתיחת האמפולה מכיוון שהתכולה נמצאת בוואקום. נקוט באמצעי זהירות בעת שבירת האמפולה, שכן פתיחה מהירה תמשוך את פקק הכותנה לקצה אחד ופתיחה חפוזה תשחרר את החלקיקים העדינים של החיידק לאוויר.
    2. הסר בזהירות את פקק הכותנה בעזרת פינצטה מעוקרת והוסף לאמפולה 0.3 מ"ל מרק לוריא ברטאני (LB). תן לזה לעמוד 30 דקות.
    3. יש לחסן 100 מיקרוליטר מהתרחיף ל -10 מ"ל מרק LB (בבקבוק חרוטי של 100 מ"ל) ולהניח אותו בשייקר החממה ב -180 סל"ד הנשמר ב -37 מעלות צלזיוס. העבירו בו זמנית 100 מיקרוליטר מהתרחיף לאגר ה-LB המוצק והתפשטו לקבלת מושבות מבודדות. דגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. לאחר שהתרבות גדלה, אחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. בצע תת-תרבות לאחר כל 4 שבועות על ידי פס מושבה על צלחת אגר LB טרייה ודגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי שהמושבות יופיעו.

2. מחקרי עיכוב של מלנין על גדילה ופעילות אנזימים

  1. הכן את מדיום התרבית על ידי הוספת 51.4 גרם/ליטר גלוקוז, 49.8 גרם/ליטר עוגת קוקוס, 0.09 גרם/ליטר, 0.03 גרם/ליטר ו-0.05 גרם/ליטר של CuSO4, FeSO4 ו-MgSO4, בהתאמה, במי ים מלאכותיים (טבלת חומרים). בצע את כל הניסויים בבקבוק שייק של 250 מ"ל עם נפח מילוי של 15 מ"ל ב-200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס ו-pH ראשוני של 7.
  2. הוסף ריכוזים שונים של מלנין (100 מ"ג/ליטר, 200 מ"ג/ליטר, 500 מ"ג/ליטר ו-1000 מ"ג/ליטר) לכל מדיום תרבית בתחילת התהליך הביולוגי.
  3. למדוד את קצב הגדילה הספציפי, את פעילות האנזים של התאים ואת המלנין במרווחי זמן שונים של התהליך הביולוגי עבור כל ריכוז מלנין נוסף (סעיף 3.2).

3. מידול קינטיקה של עיכוב מלנין

  1. השתמש במשוואה הכללית הבאה של האן ולבנשפיל13 כדי לדגמן את קינטיקה העיכוב של ייצור המלנין,
    figure-protocol-1 (1)
    איפה
    μ = קצב גדילה ספציפי לכאורה (1/שעה)
    μמקסימום = קצב צמיחה ספציפי מקסימלי (1/שעה)
    p = ריכוז המוצר (גרם/ליטר)
    p *= ריכוז מוצר קריטי שבו הצמיחה נעצרת (גרם/ליטר)
    s = ריכוז סובסטרט (גרם/ליטר)
    m,n = פרמטרים
    ניתן לשכתב את המשוואה לעיל כ-
    figure-protocol-2 (2)
    איפה
    figure-protocol-3 (3)
    ו- figure-protocol-4 (4)
    ניתן לסדר מחדש את המשוואה לעיל לתרשים הדדי כפול של 1/μ לעומת 1/s, כמפורט להלן
    figure-protocol-5 (5)
  2. צייר קו ישר באמצעות הנתונים של שיעורי גידול ספציפיים וריכוזי מצע שונים באמצעות המשוואה לעיל. היירוט על ציר ה-Y וה-X, בהתאמה, נותן μmax ו-Ks, אותם ניתן להחליף ב-eqution 3 ו-4 בהתאמה כדי לקבל μobs ו-Kobs.
    ניתן לכתוב משוואה (3) כ-
    figure-protocol-6 (6)
  3. חשב את קצב הגידול הספציפי של תרבית שגדלה בשלב 2.2 וקרא לו μobs.
  4. השתמש בערך של קצב הגידול הספציפי שהתקבל בשלב 3.3 במשוואה (6). התאם את הנתונים למשוואה ליניארית וחשב את השיפוע והיירוט.
  5. השתמש במשוואה (3) כדי לחשב את קצב הגידול הספציפי המקסימלי בהיעדר מלנין.

4. התפתחות התהליך הביולוגי הסופח

  1. בצע את כל הניסויים בבקבוק שייק של 250 מ"ל עם נפח מילוי של 15 מ"ל ב-200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס ו-pH ראשוני של 7.
  2. בצע את התהליך הביולוגי האופטימלי הסופי בביו-ריאקטור מיכל מעורבב בנפח 5 ליטר עם נפח תיוק של 3 ליטר. שמור על pH של התרבית בין 7-7.5 וחמצן מומס בין 50%-60% מהרוויה במחקרי הביוריאקטור.

5. בחירת הסופח הטוב ביותר מבין סופחים זמינים שונים

  1. הוסף סופחים שונים כגון אלומינה, זאוליט, ציט, אדמת פולר ופחם פעיל בצלוחיות שונות המכילות את מרק התרבית.
  2. מוסיפים כל סופח בנפרד בריכוז של 1 גרם/ליטר למרק התרבית ושומרים אותו בשייקר סיבובי ב-150 סל"ד למשך 12.
  3. הפרד את הסופחים על ידי צנטריפוגה ב-5000 x גרם למשך 10 דקות ומדוד את הספיגה של הסופרנטנט ב-400 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  4. בחר את הסופח הסופח הסופח את כמות המלנין המקסימלית ממרק התרבית.

6. השפעת זמן המינון של הסופח

  1. התחל את התהליך הביולוגי והוסף את הסופח המניב את הספיחה הגבוהה ביותר של מלנין מהתרבית (נבחר לאחר סעיף 5). הריכוז שנבחר בשלב הראשוני הוא 1 גרם/ליטר.
  2. מדוד את ייצור המלנין המקסימלי על פי פרוטוקול12 שפורסם בעבר.
  3. חזור על שלב 6.1 על ידי הוספת הסופח לאחר 12 שעות מתחילת התהליך הביולוגי ומדוד את ייצור המלנין בזמנים שונים של התהליך הביולוגי.
  4. חזור על שלב 6.3 על ידי הוספת הסופח לאחר 24 שעות, 36 שעות ו-48 שעות מתחילת התהליך הביולוגי.
  5. השוו את המלנין המיוצר בכל ריצת תהליך ביולוגי וזהו את זמן המינון הטוב ביותר לייצור והתאוששות מקסימליים של מלנין.

7. השפעת כמות המינון הסופח

  1. הוסף ריכוזים שונים של הסופח הטוב ביותר (0.5, 1, 2, 4, 6, 8 ו-10 גרם/ליטר) לתרביות בזמן שזוהה בסעיף 6.
  2. קצרו את התהליך הביולוגי על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5000 x גרם למשך 10 דקות.
  3. אספו את הסופרנטנט וחשבו את כמות המלנין על ידי מדידת ספיגה ב-400 ננומטר.
  4. שטפו את הגלולה המכילה סופח פעמיים כל אחת במים מזוקקים ואתנול כדי להסיר תאים ותרכובות אחרות המחוברות לסופח. בצע את שלב הכביסה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5000 x גרם למשך 10 דקות.
  5. הוסף תמיסת NaOH של 0.1 M לסופח השטוף כדי לספוג את המלנין.
  6. צנטריפוגה את התערובת ב-5000 x גרם למשך 10 דקות ומדדו את כמות המלנין בסופרנטנט ב-400 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר.
  7. חזור על תהליך הספיחה שלוש פעמים או עד שהסופח חוזר לצבעו הרגיל.
  8. הפחיתו את ה-pH של תמיסת מלנין מרוכזת זו ל-3 או פחות על ידי הוספת 1 N HCl באמצעות מערבל עם חרוזים מגנטיים כדי לזרז מלנין. אחסן את התמיסה החומצית במקרר למשך שעה כדי להגביר את המשקעים, במידת הצורך.
  9. שוטפים את המלנין המשקע שהתקבל כך שלוש פעמים במים מזוקקים על ידי צנטריפוגה ב-5000 x גרם למשך 10 דקות, מייבשים ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס.

8. מידול מתמטי של התהליך הביולוגי

  1. קינטיקה של גידול ביומסה
    1. כמת את קצב גידול הביומסה באמצעות מודל Verhulset המותאם הבא שפותח לעיכוב מוצרים, כמתואר במשוואה המופיעה להלן 14,15,16,17,
      figure-protocol-7 (7)
      איפה
      x = ריכוז ביומסה (גרם/ליטר)
      xm = ריכוז ביומסה מקסימלי (גרם/ליטר)
      μobs = קצב גידול ספציפי מקסימלי (1/h) כפי שניתן במשוואה (2)
      Vazques et al. (2008) גזרו עוד את המשוואה הבאה לריכוז ביומסה ממשוואה (7)
      figure-protocol-8 (8)
      איפה
      vx = קצב גידול ביומסה (גרם/ליטר/שעה) = μobs·x
      μobs       = קצב צמיחה ספציפי שנצפה (1/h)
      τx = זמן פיגור (h)
      t = זמן (h)
    2. השתמש במשוואה (8) כדי לחשב את ריכוז הביומסה בזמנים שונים של התהליך הביולוגי ולדמות את פרופיל הגדילה של Pseudomonas stutzeri.
  2. קינטיקה של צריכת מצע
    הערה: המצע משמש לגידול ביומסה, היווצרות מוצרים ותחזוקה בתהליך ביולוגי.
    1. השתמש במשוואה הבאה כדי לאזן את ניצול המצע בתהליך הביולוגי,
      figure-protocol-9 (9)
      רוב הגלוקוז משמש לייצור ביומסה; לכן, לצורך הפשטה, הזנחת צריכת המצע ליצירת מוצר תפחית את משוואה (9) ל,
      figure-protocol-10 (10)
      איפה
      S = ריכוז סובסטרט (גרם/ליטר)
      YP/S = מקדם תפוקת מוצר, כלומר, מקדם תפוקת מלנין (גרם/גרם)
      P = ריכוז מכפלה (גרם/ליטר), כלומר, ריכוז מלנין (גרם/ליטר)
      YX/S = מקדם תפוקת ביומסה (גרם/גרם)
      ms = מקדם תחזוקה (g/g/h)
      שילוב המשוואה לעיל מזמן t = 0 לזמן t = t, והחלפת הערך של x ממשוואה (8) נותן את המשוואה הבאה עבור פרופיל ריכוז המצע17,
      figure-protocol-11 (11)
      כאשר, s0 = ריכוז סובסטרט ראשוני (g/L) ו-x0 = ריכוז ביומסה ראשוני (g/L)
    2. השתמש במשוואה (11) כדי לחשב את ריכוז הסובסטרט במרווחי זמן שונים של התהליך הביולוגי או אם ריכוז המצע ידוע, השתמש באותה משוואה כדי להעריך את הפרמטרים הניתנים במשוואה.
  3. קינטיקה של ייצור מלנין
    1. השתמש במשוואת Ludeking-Pirate כדי לדמות ייצור מלנין. עם זאת, מלנין קשור לצמיחה ולכן המונח היווצרות מוצר שאינו קשור לצמיחה מוזנח, וניתן לכתוב את המשוואה הפשוטה כך,
      figure-protocol-12 (12)
      איפה
      α = קבוע לודקינג-פיראט הקשור להיווצרות תוצר הקשור לצמיחה (גרם/גרם)
      שילוב משוואה (12) מזמן t = 0 עד t = t מביא למשוואה הבאה עבור פרופיל ריכוז המוצר
      figure-protocol-13 (13)
    2. השתמש במשוואה (13) כדי לחשב α.
  4. הערכת פרמטר קינטי
    1. הערך את כל הפרמטרים שהוזכרו לעיל בשיטה הלא ליניארית של הערכת פרמטרים באמצעות כל כלי תוכנה מתאים (למשל, כלי הפתרון של Microsoft Excel).
    2. השתמש בנתוני ניסוי אצווה להערכת פרמטרים ומזער את סכום השגיאה בריבוע (SSE) באמצעות הכלי Solver, כפי שניתן על ידי המשוואה הבאה,
      למזער
      figure-protocol-14 (14)
      איפה
      xsim = ערך מדומה ו- xexp = ערך ניסיוני

9. טכניקות אנליטיות

  1. מיצוי מלנין
    1. צנטריפוגה את תרבית הגידול ב 5000 x גרם למשך 10 דקות כדי להסיר את הביומסה.
    2. הוסף נפח שווה של 1 M NaOH לסופרנטנט.
    3. החמצת הסופרנטנט האלקליין ל-pH 2 על ידי הוספת 1 N HCl כדי לזרז את המלנין.
    4. צנטריפוגה הסופרנטנט המחומצת ב-12000 x גרם למשך 20 דקות לאיסוף מלנין.
    5. שוטפים את המלנין שנאסף שלוש פעמים עם 5 מ"ל מים מזוקקים, מייבשים לילה בטמפרטורת החדר (RT) ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס18.
  2. כימות מלנין
    1. הכינו ריכוזים שונים של תמיסות מלנין (0-500 מ"ג/ליטר) על ידי המסת הכמות המתאימה של מלנין במי ים מלאכותיים (pH 8).
    2. מדוד את הספיגה ב-400 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר18.
    3. הכן את עקומת הכיול באמצעות הנתונים לעיל.
    4. צנטריפוגה את תרבית הגידול ב-5000 x גרם למשך 10 דקות כדי להסיר את הביומסה ולמדוד את הספיגה של הסופרנטנט ב-400 ננומטר. חישוב ריכוז המלנין בתרבית הגידול באמצעות עקומת הכיול שהוכנה בשלב 9.2.3
  3. בדיקת טירוזינאז
    1. עקוב אחר הפרוטוקול המפורט להלן עבור בדיקת האנזים טירוזינאז שפותחה על ידי Ren et al. (2013)19 כדי לקבוע את פעילות האנזים של טירוזינאז המופק ממרק תרבית Pseudomonas stutzeri .
    2. צנטריפוגה של תרבית החיידקים ב-5,000 x גרם כדי לאסוף את התאים.
    3. סוניקציה של התאים במאגר פוספט קר של 100 מ"מ של pH 6.5 וצנטריפוגה של ההומוגנאט ב-9000 x גרם למשך 15 דקות ואיסוף הסופרנטנט, מקור לאנזים טירוזינאז.
    4. הוסף 0.2 מ"ל מתמיסת האנזים שהתקבלה בשלב לעיל ל-2.8 מ"ל של 0.1 מ"ל מאגר נתרן פוספט 0.1 M (pH 6.5) המכיל 1 מ"מ L-טירוזין (מצע).
    5. התבונן בהיווצרות דופכרום על ידי מדידת הספיגה ב-475 ננומטר.
    6. חשב את פעילות הטירוזינאז באופן הבא. יחידה בינלאומית אחת (IU) של פעילות טירוזינאז מוגדרת ככמות האנזים הנדרשת כדי לחמצן 1 מיקרומול של L-טירוזין לדופכרום לדקה. חשב זאת על ידי שימוש במקדם ההכחדה המולרית של דופכרום (3600 L·M-1·cm-1) על ידי המשוואה הבאה,
      figure-protocol-15 (15)
  4. הערכת ביומסה
    1. אסוף 5 מ"ל מהדגימות במרווח של 4 שעות בארון הבטיחות הביולוגית, תוך שמירה על סטריליות. הדליקו את פקק הכותנה של הבקבוק לפני ואחרי לקיחת הדגימות כדי להפחית את הסיכוי לזיהום. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של הדגימות ב-660 ננומטר עבור כל הדגימות הללו.
      הערה: המדיה הלא מחוסנת משמשת כריק. קריאות אלה ישמשו לחקר צמיחת המיקרואורגניזמים.
    2. צנטריפוגה את מרק התרבות ב-5000 x גרם למשך 10 דקות ו-4 מעלות צלזיוס, אוספים את כדור התא ומייבשים את הגלולה למשך 8 שעות ב-60 מעלות צלזיוס בתנור אוויר חם כדי להשיג את מסת התא היבשה.
    3. הכן את עקומת הכיול באמצעות ה-OD שנמדד בשלב 9.4.1 והביומסה המתאימה המתקבלת בשלב 9.4.2
    4. השתמש בעקומת הכיול (OD = 0.82٠ביומסה (g/L)) כדי למדוד את הכמות הלא ידועה של ביומסה על ידי מדידת הצפיפות האופטית של מרק התרבות בכל זמן נתון.
  5. הערכת DNA
    1. העריכו את כמות ה-DNA בדגימה על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-260 ננומטר.
    2. חשב את ה- DNA באמצעות הנוסחה הבאה,
      figure-protocol-16 (16)
      איפה
      A260 = ספיגה ב 260 ננומטר
      0.1 = נפח המדגם
      1 = ספיגה של תמיסה סטנדרטית של DNA בריכוז 50 מיקרוגרם/מ"ל, ב-260 ננומטר
  6. הערכת חלבון
    1. הערך את כמות החלבון בדגימות באמצעות ערכת הערכת חלבון ברדפורד (טבלת חומרים).
    2. הוסף 5 מ"ל של מגיב ברדפורד ל -0.1 מ"ל של הסופרנטנט ושמור אותו למשך 5 דקות. החלבונים הקיימים בסופרנטנט מגיבים עם מגיב ברדפורד ליצירת קומפלקס צבעוני.
    3. מדוד את הספיגה ב-595 ננומטר20 באמצעות הספקטרופוטומטר.
  7. הערכת סך הסוכר המפחית (TRS)
    1. מדוד את ה-TRS בשיטת דיניטרוסליצילי (DNS)21.
    2. הכן את פתרון ה- DNS על ידי המסת 1 גרם DNS ב -50 מ"ל מים מזוקקים. הוסף לתמיסה זו 30 גרם נתרן אשלגן טרטרט בכמויות קטנות עד שצבע התמיסה הופך לצהוב חלבי, ואחריו כתום-צהוב שקוף בתוספת של 20 מ"ל של 2 N NaOH. הביאו את הנפח ל-100 מ"ל בעזרת מים מזוקקים ואחסנו אותו בחושך.
    3. הכן תמיסת עבודה של גלוקוז (0.01 מ ') על ידי המסת 180 מ"ג גלוקוז ב 100 מ"ל מים מזוקקים בבקבוק רגיל.
    4. יש להוציא את תמיסת הגלוקוז הסטנדרטית (0.2, 0.4, 0.6, 0.8 ו-1 מ"ל) ל-5 מבחנות נפרדות. השתמש במבחנה המכילה מים מזוקקים (1 מ"ל) כתמיסה ריקה.
    5. הביאו את הנפח עד 2 מ"ל בכל מבחנה באמצעות מים מזוקקים.
    6. הוסף 1 מ"ל של מגיב DNS לכל מבחנה וכסה בנייר אלומיניום.
    7. מחממים את המבחנות באמבט מים רותחים למשך 5 דקות ומצננים ל-RT.
    8. מוסיפים 9 מ"ל מים מזוקקים לכל מבחנה ומערבבים היטב. מדוד את ה-OD של התוכן ב-575 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
    9. מדוד את הריכוז באמצעות טבלת כיול שהוכנה עם כמות הגלוקוז על ציר ה-X לעומת ספיגה ב-575 ננומטר (A575) על ציר ה-Y.
  8. ניתוח גודל חלקיקים
    1. פזרו את המלנין הביו-סינתטי במים מזוקקים (1 מ"ל) באמצעות סוניקטור.
    2. הוסף את תמיסת הדגימה המפוזרת (1 מ"ל) למנתח הננו-חלקיקים ומדוד את גודל החלקיקים לפי פרוטוקול היצרן.
  9. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).
    1. יבש את אבקת המלנין המתקבלת לאחר המיצוי על ידי שמירתה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות.
    2. טען את אבקת המלנין במטריצת הדגימה TEM ומדוד את הגודל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור בהתאם לפרוטוקול המפעיל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1A,B מדגים צמיחה וייצור מלנין בהשפעת ריכוזי מלנין ראשוניים שונים. צמיחת התאים וייצור המלנין פחתו באופן משמעותי עם העלייה בריכוז הראשוני של המלנין. בריכוז המלנין הראשוני של 500 מ"ג/ליטר במדיום, הביומסה והמלנין ירדו לכמעט 50% מהערך המקסימלי שהושג בביקורת. ב-1000 מ"ג/ליטר של ריכוז המלנין הראשוני, היה ייצור מלנין שולי. קצב גידול הביומסה ירד משמעותית בריכוז המלנין הראשוני של 1000 מ"ג/ליטר. איור 1C מראה פעילות טירוזינאז תוך-תאית במרק תרבית בריכוז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עיכוב מוצרים הוא צוואר בקבוק מרכזי בעיבוד ביולוגי שמוביל לירידה בפרודוקטיביות. קיימות מספר שיטות להפחתת עיכוב המוצר, כגון תהליך ביולוגי מתמשך וטכניקות להסרת מוצר באתרו. עם זאת, אפשרויות אלה דורשות שיפוץ מלא של מתקן העיבוד הביולוגי הקיים 23,24,25,26,27,28. ביו-תהליך סופח אינו דורש שיפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין כל ניגוד אינטרסים

תודות

אנו מודים למחלקת המדע והטכנולוגיה (DST/TSG/WP/2014/58), הודו והמכון הלאומי לטכנולוגיה של קרנטקה על מתן המימון לפיתוח הפרוטוקול הנ"ל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  אלומינה+A15A26A3:A13A3:A16A3:A17HiMediaGRM1909
פחם פעילHiMediaPCT1001
מי ים מלאכותיים מדיוםHiMediaM1942
ערכת ריאגנט ברדפורדHiMediaML106
CeliteHiMedia GRM226
צנטריפוגהREMICM-8
צינורות צנטריפוגהHiMediaPW1207
חומצה דיניטרוסליציליתHiMediaGRM1582
בקבוק ארלנמאיירבורוסיל4980021
כדור הארץ של פולרHiMediaGRM232
גלוקוזHiMediaMB037
HClHiMediaAS004
L-טירוזיןHiMediaRM069
Microsoft Excelשל מיקרוסופט
HORIBA ScientificNanopartica SZ-100
מדיום אגר תזונתיHiMediaM001
צלחת פטריHiMediaPW054
מאגר פוספטHiMediaM1452
נתרן הידרוקסידHiMediaMB095
ספקטרופוטומטרThermofisherGenesys 10
מיכל מעורבב ביו-ריאקטורScigenicsBioferm LS
TE מאגרHiMediaML060
שידור מיקרוסקופ אלקטרוניםJEOLJEM-2100
זאוליטHiMediaGRM3834
מנתח ננו-חלקיקים

מקורות

  1. Langfelder, K., Streibel, M., Jahn, B., Haase, G., Brakhage, A. A. Biosynthesis of fungal melanins and their importance for human pathogenic fungi. Fungal Genetics and Biology. 38 (2), 143-158 (2003).
  2. Riley, P. A. Melanin. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 29 (11), 1235-1239 (1997).
  3. Madaras, F., Gerber, J. P., Peddie, F., Kokkinn, M. J. The effect of sampling methods on the apparent constituents of ink from the squid sepioteuthis australis. Journal of Chemical Ecology. 36 (11), 1171-1179 (2010).
  4. Tran-Ly, A. N., et al. Microbial production of melanin and its various applications. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 36 (11), 170(2020).
  5. Pavan, M. E., López, N. I., Pettinari, M. J. Melanin biosynthesis in bacteria, regulation and production perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (4), 1357-1370 (2019).
  6. Pombeiro-Sponchiado, S. R., Sousa, G. S., Andrade, J. C. R., Lisboa, H. F., Gonçalves, R. C. R. Production of melanin pigment by fungi and its biotechnological applications. Melanin. , IntechOpen Limited. London, UK. 47-77 (2017).
  7. Guo, J., et al. Cloning and identification of a novel tyrosinase and its overexpression in Streptomyces kathirae SC-1 for enhancing melanin production. FEMS Microbiology Letters. 362, 41(2015).
  8. Lagunas-Muñoz, V. H., Cabrera-Valladares, N., Bolívar, F., Gosset, G., Martínez, A. Optimum melanin production using recombinant Escherichia coli. Journal of Applied Microbiology. 101 (5), 1002-1008 (2006).
  9. Wang, L., Li, Y., Li, Y. Metal ions driven production, characterization and bioactivity of extracellular melanin from Streptomyces sp. ZL-24. International Journal of Biological Macromolecules. 123, 521-530 (2019).
  10. Kiran, G. S., Jackson, S. A., Priyadharsini, S., Dobson, A. D. W., Selvin, J. Synthesis of Nm-PHB (nanomelanin-polyhydroxy butyrate) nanocomposite film and its protective effect against biofilm-forming multi drug resistant Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 7, 9167(2017).
  11. Raman, N. M., Shah, P. H., Mohan, M., Ramasamy, S. Improved production of melanin from Aspergillus fumigatus AFGRD105 by optimization of media factors. AMB Express. 5 (1), 72(2015).
  12. Thaira, H., Raval, K., Manirethan, V., Balakrishnan, R. M. Melanin nano-pigments for heavy metal remediation from water. Separation Science and Technology (Philadelphia). 54 (2), 265-274 (2018).
  13. Han, K., Levenspiel, O. Extended monod kinetics for substrate, product, and cell inhibition. Biotechnology and Bioengineering. 32 (4), 430-447 (1988).
  14. Vázquez, J. A., Murado, M. A. Unstructured mathematical model for biomass, lactic acid and bacteriocin production by lactic acid bacteria in batchfermentation. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83 (1), 91-96 (2008).
  15. Rohit, S. G., Jyoti, P. K., Subbi, R. R. T., Naresh, M., Senthilkumar, S. Kinetic modeling of hyaluronic acid production in palmyra palm (Borassus flabellifer) based medium by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523. Biochemical Engineering Journal. 137, 284-293 (2018).
  16. Nair, A. V., Gummadi, S. N., Doble, M. Process optimization and kinetic modelling of cyclic (1→3, 1→6)-β-glucans production from Bradyrhizobium japonicum MTCC120. Journal of Biotechnology. 226, 35-43 (2016).
  17. Reddy Tadi, S. R., Limaye, A. M., Sivaprakasam, S. Enhanced production of optically pure D (-) lactic acid from nutritionally rich Borassus flabellifer sugar and whey protein hydrolysate based-fermentation medium. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (-), 279-289 (2017).
  18. Ganesh Kumar, C., Sahu, N., Narender Reddy, G., Prasad, R. B. N., Nagesh, N., Kamal, A. Production of melanin pigment from Pseudomonas stutzeri isolated from red seaweed Hypnea musciformis. Letters in Applied Microbiology. 57 (4), 295-302 (2013).
  19. Ren, Q., Henes, B., Fairhead, M., Thöny-Meyer, L. High level production of tyrosinase in recombinant Escherichia coli. BMC Biotechnology. 13, 13-18 (2013).
  20. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The Protein Protocols Handbook. Springer Protocols Handbooks. , Humana Press. (2002).
  21. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31 (3), 426-428 (1959).
  22. Dutta, A., Diao, Y., Jain, R., Rene, E. R., Dutta, S. Adsorption of cadmium from aqueous solution onto coffee grounds and wheat straw: Equilibrium and kinetic study. Journal of Environmental Engineering. 142 (9), 1-6 (2015).
  23. Dhillon, G. S., Brar, S. K., Verma, M., Tyagi, R. D. Recent advances in citric acid bio-production and recovery. Food and Bioprocess Technology. 4, 505-529 (2011).
  24. Roffler, S. R., Blanch, H. W., Wilke, C. R. In situ recovery of fermentation products. Trends in Biotechnology. 2 (5), 129-136 (1984).
  25. Maiti, S., et al. A re-look at the biochemical strategies to enhance butanol production. Biomass and Bioenergy. 94, 187-200 (2016).
  26. Prakash, G., Srivastava, A. K. Integrated yield and productivity enhancement strategy for biotechnological production of Azadirachtin by suspension culture of Azadirachta indica. Asia-Pacific Journal of Chemical Engineering. 6 (1), 129-137 (2011).
  27. Stark, D., von Stockar, U. In situ product removal (ISPR) in whole cell biotechnology during the last twenty years. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 80, 149-175 (2003).
  28. Kaur, G., Srivastava, A. K., Chand, S. Debottlenecking product inhibition in 1,3-propanediol fermentation by In-Situ Product Recovery. Bioresource Technology. 197, 451-457 (2015).
  29. Arun, G., Eyini, M., Gunasekaran, P. Characterization and biological activities of extracellular melanin produced by Schizophyllum commune (Fries). Indian Journal of Experimental Biology. 53, 380-387 (2015).
  30. Bin, L., Wei, L., Xiaohong, C., Mei, J., Mingsheng, D. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula, an edible jelly mushroom. Annals of Microbiology. 62 (4), 1523-1530 (2012).
  31. Madhusudhan, D. N., Mazhari, B. B. Z., Dastager, S. G., Agsar, D. Production and cytotoxicity of extracellular insoluble and droplets of soluble melanin by Streptomyces lusitanus DMZ-3c. BioMed Research International. 2014, 1-11 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים