הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/63380

⸱

17 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, Institute of Insect Science and Technology & School of Life Sciences, South China Normal University, 2Guangmeiyuan R&D Center, Guangdong Provincial Key Laboratory of Insect Developmental Biology and Applied Technology, South China Normal University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר קווים מנחים שלב אחר שלב לטכניקות הפעולה של RNAi ב - P. americana.

תקציר

מקקים, מזיק תברואתי, הם מינים חיוניים במחקרים התפתחותיים ומטמורפיים של חרקים בשל האכלתם הקלה ומאפייניהם ההמימטבוליים. בסך הכל עם רצפי גנום מובאים היטב, יתרונות אלה הפכו את הג'וק האמריקאי, פריפלנטה אמריקנה, למודל חרקים המימטבולי חשוב. מוגבל על ידי המחסור באסטרטגיית נוקאאוט, הפרעות RNA יעילות (RNAi) מבוסס גנים נוקאאוט הופך לטכניקה חיונית במחקר גנים פונקציונלי של P. americana. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טכניקות הפעולה של RNAi ב - P. americana. הפרוטוקול כולל (1) בחירה של P. americana בשלבים התפתחותיים נאותים, (2) הכנה להגדרת ההזרקה, (3) הזרקת dsRNA, ו -(4) זיהוי יעילות נוקאאוט גנים. RNAi הוא כלי גנטי הפוך רב עוצמה P . americana. רוב רקמות P. americana רגישות dsRNA חוץ תאי. הפשטות שלה מאפשרת לחוקרים להשיג במהירות פנוטיפים לא מתפקדים תחת אחד או יותר מיקוד dsRNA זריקות, המאפשר לחוקרים להשתמש טוב יותר P. americana למחקרים התפתחותיים מטמורפיים.

מבוא

הפרעות RNA (RNAi), מנגנון שנשמר אבולוציונית, הופך בהדרגה לכלי חיוני הפוך-גנטי לעיכוב ביטוי גנים באורגניזמים רבים1, שכן אנדרו פייר וקרייג מלו2 פיתחו את אסטרטגיית השתקת הגנים המתווכת של RNA (dsRNA). dsRNA הוא בקע לתוך שברים של 21-23 נוקלאוטידים, קטן מפריע RNAs (siRNAs), על ידי האנזים Dicer בתאים כדי להפעיל את מסלול RNAi. לאחר מכן siRNAs משולבים לתוך קומפלקס ההשתקה המושרה על ידי RNA (RISC), אשר זוגות mRNA היעד, גורם מחשוף mRNA, ולבסוף גורם לאובדן תפקוד הגנים 3,4,5. בין מיני החרקים, ניסויי RNAi מערכתיים רבים דווחו עד כה בהרבה סדרי חרקים, כגון אורתופטרה, איזופטרה, המיפטרה, קולופטרה, נוירופטרה, דיפטרה, היימנופטרה, לפידופטרה ובלטודה 5,6,7,8.

מקקים (Blattaria) הם משפחת חרקים חיונית במחקרים התפתחותיים ומטמורפיים עם מחזורי הצמיחה המהירים שלהם, הסתגלות חזקה לסביבה, ופלסטיות התפתחותית גבוהה9. לפני שגילה כי RNAi היה תואם עם מקקים, מחקר קודם התמקד רק במניעה ובקרה של מקק בשל מחסור של טכניקות מניפולציה גנטית מקקים. המבנה הייחודי של הג'וק אותקה הפך אותו למאתגר לביצוע נוקאאוט גנים מבוסס הזרקת עוברים עם מערכת CRISPR-Cas9. חוץ מזה, רוב הרקמות בג'וקים (כגון P. americana) להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, המאפשרת הדור המהיר של פנוטיפים לא מתפקדים על ידי הזרקת אחד או יותר מיקוד dsRNAs 9,10,11. תכונות אלה הפכו את RNAi לטכניקה הכרחית במחקר תפקודי גנים ב- P. americana.

למרות שהשימוש ב- RNAi במחקר גנים פונקציונלי ב - P. americana דווח, לא היה תיאור מפורט או צעד אחר צעד זמין. דו"ח זה מספק קו מנחה תפעולי צעד אחר שלב עבור RNAi ב - P. americana, שימושי לחקר תפקוד גנים בג'וקים אחרים. יתר על כן, מדריך זה אינו מוגבל לבלאטודה וניתן להחיל אותו על חרקים רבים אחרים עם שינויים קלים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הקו של P. americana סופק בתחילה על ידי ד"ר Huiling האו. מין זה נשמר עם הכלאה במשך 30 שנים9.

1. בקיעה והאכלה של פ. אמריקנה

  1. לאסוף oothecae טרי (מיד לאחר הטלת ביצה) של P. americana ו דגירה באינקובטור הכהה ב 25 °C (60 °F) ו 60% לחות במשך ~ 25 ימים. לאחר מכן להגדיל את הטמפרטורה והלחות ל 30 °C (50 °F) ו 75% 3 ימים לפני הבקיעה.
  2. השתמש מסננת עם צמצם 4 מ"מ כדי להפריד את הנימפות בקעו מן oothecae.
  3. שמור את הנימפות במיכלים גליליים (12 ס"מ קוטר ו 10 ס"מ גובה) בחושך ב 28 °C (60 °F), 70% לחות. מברישים את הקצה הפנימי של המיכלים עם וזלין כדי למנוע מקקים לברוח. ספק מזון חולדות, מים ומחסה (מגשי ביצים). שימו לב לפעילות הנימפות ולנקות באופן קבוע את הצואה והפסולת.

2. בחירת הנימפות בכוכב אינסטאר מתאים

  1. השתמש בצינור זכוכית כדי לבחור את P. americana מותך טרי (לבן בצבע הגוף). שמור אותם במיכלים חדשים ולחכות לשלב הנכון לטיפול.
    הערה: לאחר ~ 19 ימים בתנאי האכלה לעיל, הנימפות ב 3אינסטארס rd יהיה זמין להזרקה. צבעם של המקקים המותכים הטריים הוא לבן, והכוכבים מובהרים על ידי זמנים מותכים.

3. הכנת קטע היעד עם מקדמי T7

  1. באמצעות cDNA של P. americana כתבנית, עיצוב פריימרים מזווגים לביצוע PCR כדי להשיג שבר DNA 300-800 bp של גן היעד9. לאחר מכן שכפל את קטע ה- PCR לווקטור pTOPO (ראה טבלת חומרים) לרצף.
  2. באמצעות DNA קטע היעד כתבנית, לסנתז זוג חדש אחד של פריימרים עם רצף מקדם T7 (5'-GGATCCTACGACTCACTATAGG-3 ') במסופי 5 'ולבצע סיבוב נוסף של PCR כדי להשיג את שבר היעד עם מקדמי T7 בכל צד9.9'.

4. שעתוק וסינתזה של dsRNA במבחנה

  1. הוסף 10 μL של T7 2X Buffer, 2 μL של תערובת אנזימים, T7 Express (ראה טבלת חומרים), ו 2 מיקרוגרם של מוצר PCR (המתקבל בשלב 3.2) במערכת התגובה והוספת הנפח הכולל ל 20 μL עם ddH2O. בעדינות לערבב הפוך באופן ידני ודוגר ב 37 °C (30 °C במשך 30 דקות ו 70 °C ( 10 °C במשך 10 דקות, ואז להתקרר לאט לטמפרטורת החדר.
  2. מדלל פתרון RNase A (4 מיקרוגרם / μL) עם ddH2O ביחס של 1:200. לאחר מכן להוסיף 1 μL של RQ1 RNase ללא RNase (1 U / μL) ו 1 μL של RNase מדולל פתרון A למערכת (ראה טבלת חומרים).
    הערה: עכשיו, הנפח של מערכת אחת הוא 22 μL.
  3. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף 10% של נפח הכולל (בעת ביצוע תגובות N בו זמנית, הנפח הכולל הוא N x 22 μL) של נתרן אצטט ושלושה כרכים של הנפח הכולל של איזופרופנול.
  4. מערבבים בעדינות הפוך באופן ידני, מניחים על קרח במשך 5 דקות, וצנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F).
  5. הסר את supernatant עם פיפטה, לשטוף את השאריות עם 75% אתנול (עם 25% דיאתיל pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים), ולאחר מכן צנטריפוגה ב 13,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (4 °F ).
  6. הסר supernatant שוב. מייבשים את הכדור באוויר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש ~ 100 μL של מי DEPC כדי להמיס dsRNA, ולאחר מכן לדלל את dsRNA הסופי 2 מיקרוגרם / μL.
    הערה: ניתן לאחסן את ה- dsRNA בטמפרטורה של -80 °C (6 חודשים).

5. טעינת פתרון dsRNA למזרק

  1. הגדר את התוכנית במשאבת הזרקת מיקרו (ראה טבלת חומרים) מראש כדי להבטיח כי הנפח של כל זריקה הוא עקבי. לפני השימוש במזרק, לנקות את המזרק על ידי מילויו עם מים DEPC 8-10 פעמים.
  2. התקן את מזרק 10 μL על משאבת הזרקת מיקרו, להפעיל את המשאבה, ולמלא את המזרק עם 10 μL של פתרון dsRNA (מוכן בשלב 4.6). הזרקו 1 μL של dsRNA לתוך נימפהrd (ראה שלב 2) ולוודא כי זה לא דולף החוצה לגוף.

6. הזרקת dsRNA ל - P. americana

  1. מרדים את המקקים עם ריכוז מוגבר של CO2 במיכל עד המקקים לא זזים יותר, ולאחר מכן להמשיך מיד עם הזריקה.
  2. הרימו בעדינות את הג'וק עם פינצטה, והעבירו את המקק לכיוון המחט ביד. לאחר מכן, הכנס את המחט דרך הפער בין שתי חבטות בטן אופקית נגד האפידרמיס. על עומק הכנס, רדוד יותר, טוב יותר.
  3. לאחר מכן, להזריק את פתרון dsRNA לתוך המקק. לבסוף, לשלוף את קצה המחט. ודא כי קצה המחט הוא קרוב ככל האפשר לאפידרמיס כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים.
    הערה: ההזרקה צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ ביתור.
  4. שים את המקקים המוזרקים לתוך מיכלי bioassay נקיים. המתן כ 10-20 דקות כדי לאפשר להם להתאושש אפקטים CO2 . סמן את המיכלים עם תאריך ההזרקה, סוג ומינון של dsRNA, וגיל של P. americana.
  5. מניחים את המקקים המוזרקים בסביבה חשוכה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, 70% לחות, מספקים מים, מזון ומחסה, וצופים בשינויים אפשריים בפנוטיפ של המקקים באופן קבוע.

7. אישור נוקאאוט וניתוח פנוטיפי

  1. הערך את היעילות של RNAi באמצעות כל טכניקות ביולוגיה מולקולרית זמינות כגון PCR בזמן אמת כמותי (qRT-PCR) ו סופג מערבי. לקבלת נהלי qRT-PCR ו-QRT-PCR מפורטים, ראה הפניות 1,12.
  2. כדי לבחון ולנתח פנוטיפים הקשורים RNAi, להשתמש במיקרוסקופ המתאים לבעלי חיים חיים.
    הערה: RNAi עשוי להשפיע על המורפולוגיה, התנהגות, מותך, התחדשות גפיים, ופעילויות פיזיולוגיות אחרות של מקקים. התדירות הספציפית של פנוטיפ מחושבת על פי תנאים ספציפיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מראה זריקה מוצלחת. מזרק המיקרו-חדירה עם מחט בקוטר מיקרו צריך להיות ממוקם אופקית על המאיץ (איור 1A). המחט מוכנסת דרך הפער בין שתי חבטות בטן אופקיות כנגד האפידרמיס (איור 1B). ודא שהנוזל נכנס לבטן של פ. אמריקנה . הזווית התלולה מדי של המחט תפגע באיברים הפנימיים (איור 1C), והזרקה לא נכונה מובילה לדליפת פתרון dsRNA מהבטן (איור 1D). אם כל dsRNA דולף החוצה,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דו"ח זה תיאר אסטרטגיית RNAi מתודולוגית צעד אחר צעד ב - P. americana; שימו לב, זה יכול להיות מיושם גם על ג'וקים אחרים (Blattella germanica, למשל) וחרקים רבים אחרים עם שינויים קלים. עם זאת, יעילות השתקת הגנים של RNAi לא תמיד גבוהה מספיק, עם חיסרון ברור בהשוואה לאסטרטגיית נוקאאוט הגנים13. ההשפעה השיורית הבאה של רמת הגן עלולה להפריע פנוטיפים האמיתיים. כדי להבטיח את הטיפול RNAi הוא מוצלח, מספר תנאים חיוניים צריך להיחשב, כולל המצב הפיזי של בעלי חיים, בחירת קבוצת בקרה, אורך וריכוז של מו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס ' 32070500, 31620103917, 31330072, ו - 31572325 ל- C.R., Sh.L.), על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מענק מס '2021B1515020044 ו 2020A1515011267 ל- C.R.), על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז גואנגדונג (גרנט מס '2019B09005003 ו 2019A0102006), על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה בגואנגג'ואו (גרנט מס '202102020110), על ידי תוכנית המדע והטכנולוגיה של שנזן (מענק מס '. KQTD20180411143628272 לש.ל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
701 N 10 ומיקרו; L Syr (26s/51/2)המילטוןPN: 80300חממת הזרקה
Ningbo Jiangnan מפעל מכשיריםRXZ-380A-LEDלג'וקים בקיעה והאכלה
משאבת מיקרו הזרקהAlcott BiotechnologyALC-IP600הזרקת
pTOPO-Blunt ערכת שיבוטAidlab ביוטכנולוגיהCV16להארכת גנים
כמותית בזמן אמת מערכות PCRBio-RadCFX Connectלניתוח qRT-PCR
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700לסינתזה dsRNA, המכילה תמיסת Rnase A (4 μ g/μ L), נתרן אצטט, 3.0M (pH 5.2), תערובת אנזימים, T7 Express, מים ללא נוקלאז, מאגר Express T7 2x, RQ1 RNase ללא RNase DNase
Thermal CyclersBio-RadS1000להגברת DNA

מקורות

  1. Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431(2012).
  2. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
  4. Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
  5. Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
  6. French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).
  7. Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).
  8. Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
  9. Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).
  10. Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
  11. Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163(2011).
  12. Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
  13. Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
  14. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  15. Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
  16. Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
  17. Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
  18. Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
  19. Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778(2020).
  20. Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
  21. Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

dsRNAqRT PCR
יישומים של הפרעות RNA במקק אמריקאי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.