פרוטוקול זה מתאר את ההכנה המפורטת של דגימות בעלות קלט נמוך לריצוף גרעין יחיד, כולל כריתה של צוואר הרחם העליון של העכבר וגרעיני סטלאט, דיסוציאציה של תאים, שימור בהקפאה, בידוד גרעין וברקוד האשטאגים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
מערכת העצבים האוטונומית של הלב חיונית בשליטה על תפקוד הלב, כגון קצב הלב והתכווצות הלב, ומחולקת לענפים סימפתטיים ופאראסימפתטיים. בדרך כלל, יש איזון בין שני ענפים אלה כדי לשמור על הומאוסטזיס. עם זאת, מצבי מחלות לב כגון אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב ויתר לחץ דם יכולים לגרום לשיפוץ של תאים המעורבים בהתעצבנות לבבית, אשר קשורה לתוצאה קלינית שלילית.
למרות שיש כמויות עצומות של נתונים עבור המבנה ההיסטולוגי והתפקוד של מערכת העצבים האוטונומית הלבבית, הארכיטקטורה הביולוגית המולקולרית שלה בבריאות ובמחלות עדיין אניגמטית בהיבטים רבים. טכנולוגיות חדשניות כגון ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מבטיחות אפיון גנטי של רקמות ברזולוציה של תאים בודדים. עם זאת, הגודל הגדול יחסית של נוירונים עלול לעכב את השימוש הסטנדרטי בטכניקות אלה. כאן, פרוטוקול זה מנצל ריצוף RNA מבוסס טיפות של גרעין יחיד (snRNA-seq), שיטה לאפיון הארכיטקטורה הביולוגית של נוירונים סימפתטיים לבביים בבריאות ובמחלות. גישה מדורגת מודגמת לביצוע snRNA-seq של צוואר הרחם העליון הדו-צדדי (SCG) וגרעיני הסטלה (StG) המנותקים מעכברים בוגרים.
שיטה זו מאפשרת שימור דגימה לטווח ארוך, תוך שמירה על איכות RNA נאותה כאשר לא ניתן לאסוף דגימות ממספר אנשים /ניסויים בבת אחת תוך פרק זמן קצר. קידוד הגרעינים עם אוליגוס האשטאג (HTOs) מאפשר דמולטיפלקסינג ועקבות של דגימות גנגליוניות מובהקות לאחר ריצוף. ניתוחים מאוחרים יותר חשפו לכידת גרעינים מוצלחת של תאי עצב, גליה לווייניים ואנדותל של הגרעינים הסימפתטיים, כפי שאומתו על ידי snRNA-seq. לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה מדורגת עבור snRNA-seq של גרעיני לב חיצוניים סימפתטיים, שיטה שיש לה פוטנציאל ליישום רחב יותר במחקרים על העצבנות של איברים ורקמות אחרים.
מבוא
מערכת העצבים האוטונומית (ANS) היא חלק מכריע במערכת העצבים ההיקפית השומרת על הומאוסטזיס של הגוף, כולל הסתגלות לתנאי הסביבה ולפתולוגיה1. הוא מעורב בוויסות של מערכות איברים מרובות בכל הגוף כגון מערכות הלב וכלי הדם, הנשימה, העיכול והאנדוקריניות. ה- ANS מחולק לענפים סימפתטיים ופאראסימפתטיים. ענפי עמוד השדרה של מערכת העצבים הסימפתטית סינפסה בגרעינים של השרשרת הסימפתטית, הממוקמים באופן דו-צדדי בתנוחה פרה-חולייתית. צוואר הרחם הדו-צדדי וגרעיני בית החזה, במיוחד ה- StG, הם מרכיבים חשובים המשתתפים בעצבנות סימפתטית לבבית. במצבי מחלה, כגון איסכמיה לבבית, שיפוץ עצבי יכול להתרחש, וכתוצאה מכך הילוך יתר סימפתטי2. השיפוץ העצבי הוכח במחקרים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה מתאר את כל השלבים הנדרשים עבור snRNA-seq של גרגירי צוואר הרחם ו/או צוואר הרחם (סטלטים). נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J נקבות וזכריות (בנות 15 שבועות, n = 2 לכל מין). עכבר Wnt1-Cre;mT/mG נוסף שימש להדמיית הגרעינים למטרות כריתה17,18. עכבר נוסף זה נוצר על ידי רבייה צולבת של עכבר B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J ועכבר B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J עכבר. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי NIH ואושר על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ליידן (מספר רישיון AVD1160020185325, ליידן, הולנד). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ניתוח בקרת איכות של הכנת ספריית cDNA של גרעין יחיד ו- snRNA-seq
תוצאות מייצגות מתארות תוצאות ריצוף של 10,000 גרעינים שנלכדו בבריכה אחת עם ספריית ביטוי גנים של 25,000 קריאות/גרעין וספריית האשטאגים של 5,000 קריאות/גרעין. איור 3B ממחיש את תוצאות בקרת האיכות של cDNA שלגדיל 1, ספריית ביטוי גנים (GEX) וספריית HTO, שנבדקו באמצעות Bioanalyzer. ה-cDNAs שמקורם ב-HTO צפויים להיות קטנים מ-180 bp, בעוד ש-cDNAs שמקורם ב-mRNA גדולים מ-300 bp. ניתן לזהות ספריית GEX באיכות גבוה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן מתואר פרוטוקול מפורט המתמקד ב- i) כריתה של חיידקים בוגרים בעלי צוואר הרחם וגרעיני סטלה סימפתטיים, ii) בידוד ושימור בהקפאה של התאים הגנגליוניים, iii) בידוד גרעין, ו- iv) ברקוד גרעין עם תיוג HTO למטרות ריבוב ו- snRNA-seq.
עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג בקלות תאים גנגליוניים סימפתטיים על ידי ניתוק גרעינים בודדים באמצעות טריפסין וקולגןאז נפוצים. שימור ארוך טווח של תאים גנגליוניים מבודדים מושג בקלות גם על ידי הקפאת תאים ב- FBS בתוספת 10% DMSO, שהראה איכות גבוהה של התאוששות לאחר ההפשרה. יתר על כן, ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים לסוזן ל. קלוט (המחלקה לגנטיקה אנושית, LUMC, ליידן, הולנד) על עזרתה בתכנון ניסויים ובדיונים מועילים. אנו מודים לאמיל ג'יי דה מאייר (המחלקה לגנטיקה של האדם, LUMC, ליידן, הולנד) על העזרה בבידוד RNA של גרעין יחיד והכנת הספרייה לריצוף. עבודה זו נתמכת על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) [016.196.346 ל- M.R.M.J.].
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>כימיקלים וריאגנטים | |||
| 0.25% טריפסין-EDTA | Thermo Fisher | Scientific 25200056 | |
| 0.4% צבע כחול טריפאן | Bio-Rad | 1450021 | |
| אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| קולגנאז סוג 2 | וורת'ינגטון | LS004176 להשתמש ב-1,400 יח'/מ"ל | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא אולדריץ' | 67685 | |
| אתנול מוחלט ≥ 99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| סרום בקר עוברי (אנדוטוקסין נמוך) | Biowest | S1810-500 | |
| L-גלוטמין | תרמו פישר 25030024 | ||
| Neurobasal בינוני | Gibco | 21103049 | |
| סרום בקר אלבומין 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | מאגר שטיפת |
| תאים DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | מאגר שטיפת תאים |
| תמיסת מגנזיום כלוריד, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | מאגר גרעין ליזה |
| תחליף Nonidet P40 (חומר ניקוי לא יוני) | Sigma-Aldrich | 74385 | מאגר גרעין ליזה |
| מים ללא נוקלאז (לא מטופל ב-DEPC) | Invitrogen | AM9937 | מאגר |
| גרעין ליזהמעכב RNase, 40 U/µ L | סיגמא-אולדריץ' | 3335399001 | מאגר גרעין ליזה |
| תמיסת נתרן כלוריד, 5 מ' | סיגמא-אולדריץ' | 59222C | מאגר גרעין ליזה |
| תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, 1 מ', pH 7.4 | סיגמא-אולדריץ' | T2194 | מאגר גרעין ליזה |
| אלבומין סרום בקר 10% | סיגמא-אולדריץ' | A1595-50ML | שטיפת גרעין |
| DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free) | Gibco | 14190-169 | מגן שטיפת גרעין |
| מעכב RNase,40 U/µ L | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus |
| Wash בקר סרום אלבומין 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST מאגר צביעה (ST-SB) |
| תמיסת סידן כלוריד, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | מאגר צביעה ST (ST-SB) |
| תמיסת מגנזיום כלוריד, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST מאגר צביעה (ST-SB) |
| מים ללא נוקלאז (לא DEPC מטופל) | Invitrogen | AM9937 | ST מאגר צביעה (ST-SB) |
| תמיסת נתרן כלוריד, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST מאגר צביעה (ST-SB) |
| תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, 1M, pH 7.4 | מאגר צביעה Sigma-Aldrich | T2194 | ST (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST מאגר צביעה (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 חלבונים מורכבים נקבוביות אנטי גרעיניות האשטאג 1 נוגדן | Biolegend | 682205 | נוגדן האשטאג |
| TotalSeq-A0452 חלבונים מורכבים נקבוביות גרעיניות האשטאג 2 נוגדן | Biolegend | 682207 | נוגדן האשטאג |
| TotalSeq-A0453 חלבונים מורכבים נקבוביות אנטי גרעיניות האשטאג 3 נוגדן | Biolegend | 682209 | האשטאג נוגדן |
| TotalSeq-A0461 חלבונים מורכבים נקבוביות גרעיניות האשטאג 11 נוגדן | Biolegend | 682225 | נוגדן האשטאג |
| TotalSeq-A0462 חלבונים מורכבים נקבוביות אנטי גרעיניות האשטאג 12 נוגדן | Biolegend | 682227 | נוגדן האשטאג |
| TotalSeq-A0463 חלבונים מורכבים נקבוביות גרעיניות האשטאג 13 נוגדן | Biolegend | 682229 | האשטאג נוגדן |
| TotalSeq-A0464 אנטי-גרעיני נקבוביות קומפלקס חלבונים האשטאג 14 נוגדן | Biolegend | 682231 | נוגדן האשטאג |
| TotalSeq-A0465 אנטי-גרעיני נקבוביות קומפלקס חלבונים האשטאג 15 נוגדן | Biolegend | 682233 | האשטאג נוגדן |
| TruStain FcX (אנושי) | Biolegend | 422302 | FC חסימת קולטן תמיסה |
| <חזק>ציוד וחומרים מתכלים | |||
| קו בהיר המציטומטר | Merck | Z359629-1EA | |
| צנטריפוגה 5702/R A-4-38 | Eppendorf | ||
| CoolCell LX מיכל הקפאת תאים | קורנינג | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 מ"ל צינור אפנדורף | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"ל | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 מ"מ לא מטופל TC צלחת פטרי | קורנינג | ||
| 351008 פלקון 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים | פישר 10773501 | ||
| מלקחיים דומונט #5 | כלים מדעיים עדינים | 11252-40 | |
| מספריים עדינים | מוקשים כלי מדע עדינים | 14091-09 | |
| מחבת קרח, מלבני 4 ליטר כתום | קורנינג | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | מיקרוסקופ | |
| מוריה MC50 מספריים | מדעיים עדינים | 15370-50 | |
| Noyes מספריים אביב | כלים מדעיים עדינים | 15012-12 | |
| אולימפוס CK2 ULWCD | מיקרוסקופ | אולימפוס | |
| P10 | גילסון | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| מסנני הפרדה מראש (30 ומיקרו; m) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| אמבט מים רועדים | GFL | 1083 | |
| צלחת סיליקון | RubberBV | 3530 | לוח חיתוך |
| <חזק>תוכנה וחבילות | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R תכנות | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6. Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J עכבר | מעבדת ג'קסון | JAX מלאי #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J עכבר | ג'קסון | JAX מלאי #007576 | |
| עכברי C57BL/6J | צ'ארלס ריבר | ||
| קוד לניתוח הנתונים | |||
מקורות
- McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricula....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
