מאמר שיטה

בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד

DOI:

10.3791/63397

⸱

23 במרץ 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה המפורטת של דגימות בעלות קלט נמוך לריצוף גרעין יחיד, כולל כריתה של צוואר הרחם העליון של העכבר וגרעיני סטלאט, דיסוציאציה של תאים, שימור בהקפאה, בידוד גרעין וברקוד האשטאגים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים האוטונומית של הלב חיונית בשליטה על תפקוד הלב, כגון קצב הלב והתכווצות הלב, ומחולקת לענפים סימפתטיים ופאראסימפתטיים. בדרך כלל, יש איזון בין שני ענפים אלה כדי לשמור על הומאוסטזיס. עם זאת, מצבי מחלות לב כגון אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב ויתר לחץ דם יכולים לגרום לשיפוץ של תאים המעורבים בהתעצבנות לבבית, אשר קשורה לתוצאה קלינית שלילית.

למרות שיש כמויות עצומות של נתונים עבור המבנה ההיסטולוגי והתפקוד של מערכת העצבים האוטונומית הלבבית, הארכיטקטורה הביולוגית המולקולרית שלה בבריאות ובמחלות עדיין אניגמטית בהיבטים רבים. טכנולוגיות חדשניות כגון ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מבטיחות אפיון גנטי של רקמות ברזולוציה של תאים בודדים. עם זאת, הגודל הגדול יחסית של נוירונים עלול לעכב את השימוש הסטנדרטי בטכניקות אלה. כאן, פרוטוקול זה מנצל ריצוף RNA מבוסס טיפות של גרעין יחיד (snRNA-seq), שיטה לאפיון הארכיטקטורה הביולוגית של נוירונים סימפתטיים לבביים בבריאות ובמחלות. גישה מדורגת מודגמת לביצוע snRNA-seq של צוואר הרחם העליון הדו-צדדי (SCG) וגרעיני הסטלה (StG) המנותקים מעכברים בוגרים.

שיטה זו מאפשרת שימור דגימה לטווח ארוך, תוך שמירה על איכות RNA נאותה כאשר לא ניתן לאסוף דגימות ממספר אנשים /ניסויים בבת אחת תוך פרק זמן קצר. קידוד הגרעינים עם אוליגוס האשטאג (HTOs) מאפשר דמולטיפלקסינג ועקבות של דגימות גנגליוניות מובהקות לאחר ריצוף. ניתוחים מאוחרים יותר חשפו לכידת גרעינים מוצלחת של תאי עצב, גליה לווייניים ואנדותל של הגרעינים הסימפתטיים, כפי שאומתו על ידי snRNA-seq. לסיכום, פרוטוקול זה מספק גישה מדורגת עבור snRNA-seq של גרעיני לב חיצוניים סימפתטיים, שיטה שיש לה פוטנציאל ליישום רחב יותר במחקרים על העצבנות של איברים ורקמות אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת העצבים האוטונומית (ANS) היא חלק מכריע במערכת העצבים ההיקפית השומרת על הומאוסטזיס של הגוף, כולל הסתגלות לתנאי הסביבה ולפתולוגיה1. הוא מעורב בוויסות של מערכות איברים מרובות בכל הגוף כגון מערכות הלב וכלי הדם, הנשימה, העיכול והאנדוקריניות. ה- ANS מחולק לענפים סימפתטיים ופאראסימפתטיים. ענפי עמוד השדרה של מערכת העצבים הסימפתטית סינפסה בגרעינים של השרשרת הסימפתטית, הממוקמים באופן דו-צדדי בתנוחה פרה-חולייתית. צוואר הרחם הדו-צדדי וגרעיני בית החזה, במיוחד ה- StG, הם מרכיבים חשובים המשתתפים בעצבנות סימפתטית לבבית. במצבי מחלה, כגון איסכמיה לבבית, שיפוץ עצבי יכול להתרחש, וכתוצאה מכך הילוך יתר סימפתטי2. השיפוץ העצבי הוכח במחקרים היסטולוגיים מרובים בבני אדם ובכמה מינים אחרים של בעלי חיים 3,4,5,6. אפיון ביולוגי מפורט של שיפוץ עצבי המושרה על ידי איסכמיה לבבית בגרעינים סימפתטיים לבביים חסר כיום, והמאפיינים הביולוגיים הבסיסיים של סוגי תאים עצביים מיוחדים או תת-סוגים בתוך מערכת העצבים הסימפתטית הלבבית (SNS) אינם נקבעים במלואם עדיין בבריאות ובמחלות7.

טכנולוגיות חדשניות, כגון scRNA-seq, פתחו שערים לאפיון גנטי של רקמות קטנות ברמה של תא בודד 8,9. עם זאת, הגודל הגדול יחסית של תאי עצב עלול לעכב את השימוש הממוטב בטכניקות החד-תאיות האלה בבני אדם10. בנוסף, ריצוף חד-תאי דורש תפוקה גבוהה של תאים כדי לשחזר מספר תאים מספיק עקב אובדן גבוה בתהליך הריצוף. זה עשוי להיות מאתגר כאשר חוקרים רקמות קטנות שקשה ללכוד בפגישה אחת ודורשים דגימות מרובות כדי להכניס מספיק תאים בודדים לריצוף. טכנולוגיית snRNA-seq מבוססת הטיפות שפותחה לאחרונה (כלומר, פלטפורמת כרום 10x) מאפשרת לחקור הבדלים ביולוגיים בין גרעינים בודדים11,12. snRNA-seq טומן בחובו יתרון על פני scRNA-seq עבור תאים גדולים (>30 מיקרומטר), אשר ייתכן שלא יילכדו בחרוז ג'ל בתחליבים (GEMs), כמו גם תאימות משופרת עם דיסוציאציה נרחבת ו/או שימור ממושךשל 13,14,15.

הטרוגניות, מספר התאים העצביים ותאים אחרים המועשרים ב-SNS הלבבי הם היבטים חשובים לאפיון ה-ANS במצבי בריאות ומחלות. בנוסף, העצבנות הספציפית לאיבר או לאזור על ידי כל גנגליון אוהד תורמת למורכבות של ה- SNS. יתר על כן, גרגירי צוואר הרחם, הסטלאט והחזה של השרשרת הסימפתטית הוכחו כמעצבנים אזורים שונים של הלב16. לכן, יש צורך לבצע ניתוח גרעין יחיד של תאים גנגליוניים שמקורם בגרעינים בודדים כדי לחקור את הארכיטקטורה הביולוגית שלהם.

snRNA-seq מבוסס טיפות מאפשר פרופיל ביטוי כלל-תעתיק עבור מאגר של אלפי תאים מדגימות מרובות בבת אחת עם עלויות נמוכות יותר מפלטפורמות ריצוף מבוססות צלחת. גישה זו מאפשרת ל-snRNA-seq מבוסס טיפות להיות מתאים יותר לסיווג פנוטיפ תאי ולזיהוי תת-אוכלוסייה חדש של תאים בתוך ה-SCG וה-StG. יש לציין כי פרוטוקול זה מספק גישה תמציתית של זיהוי, בידוד וריצוף RNA חד-גרעין של גרעיני לב חיצוניים סימפתטיים, שיטה שיש לה פוטנציאל ליישום רחב במחקרים על אפיון של גרעינים הפנימיים של איברים ורקמות קשורים אחרים ב בריאות ומחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את כל השלבים הנדרשים עבור snRNA-seq של גרגירי צוואר הרחם ו/או צוואר הרחם (סטלטים). נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J נקבות וזכריות (בנות 15 שבועות, n = 2 לכל מין). עכבר Wnt1-Cre;mT/mG נוסף שימש להדמיית הגרעינים למטרות כריתה17,18. עכבר נוסף זה נוצר על ידי רבייה צולבת של עכבר B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J ועכבר B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J עכבר. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי NIH ואושר על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת ליידן (מספר רישיון AVD1160020185325, ליידן, הולנד). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי כל החומרים, הציוד, התוכנה ובעלי החיים המשמשים בפרוטוקול.

1. הכנות

הערה: כל השלבים מבוצעים בארון זרימה של תרבית תאים.

  1. נקו את המלקחיים והמספריים על ידי טבילת המכשירים ב-70% אתנול למשך 20 דקות.
  2. הכינו את מדיום הגנגליון המורכב ממדיום נוירובסאלי בתוספת B-27 פלוס (1x), L-גלוטמין (2 מ"מ) ו-1% אנטיביוטי-אנטיביוטי. לפני המלחמה את מדיום הגנגליון בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו את תמיסת העיכול: 0.25% טריפסין-EDTA (1:1) ו-1,400 U/mL קולגן מסוג 2 מומסים במדיום הגנגליון.
  4. הכינו חיץ שטיפת תאים טרי וקר (4 מעלות צלזיוס) (0.4% אלבומין בסרום בקר [BSA]) ובופר ליזיס (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, ו-0.1% חומר ניקוי לא-יוני, 40 U/mL RNAse במים נטולי נוקלאז) לבידוד הגרעין.
  5. הכן חיץ שטיפת גרעין (1x מלוחים עם חציצה בפוספט [PBS] עם 2.0% BSA ומעכב RNase 0.2U/μL).
  6. הכן מאגר צביעת ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0.02% Tween-20 במים ללא נוקלאז).

2. כריתה של גרעיני צוואר הרחם העליונים של העכבר הבוגר (SCG)

  1. להרדים את העכברים ולהשאיר אותם על הקרח.
    הערה: במחקר הנוכחי, סך של 4 עכברי C57BL6/J הומתו על ידי חנק CO2 . לחלופין, ניתן להשתמש באיזופלורן ולאחר מכן לבצע אקסנגווינציה כאשר יש צורך לאסוף כמות גדולה של דם למטרות מחקר אחרות.
  2. תקן את העכבר על לוח דיסקציה עם סיכות ועשה אותו עם 70% אתנול כדי למזער את פיזור הפרווה (גילוח אינו הכרחי).
  3. תחת סטריאומיקרוסקופ, פתחו את העור של אזור הצוואר על ידי יצירת חתך בקו האמצע עם מספריים, הזיזו את הבלוטות התת-מנדיבולריות הצידה והסירו את שריר הסטרנומסטואיד כדי לחשוף ולאתר את עורק הצוואר הנפוץ ואת הביפורקציה שלו (איור 1A, B, ראו חץ).
  4. נתחו את ביפורקציה של עורק הצוואר הימני והשמאלי ואת הרקמה המחוברת אליו. מעבירים כל פיסת רקמה מנותחת לצלחת פטרי נפרדת בקוטר 3.5 ס"מ המכילה PBS קר.
  5. חפשו את ה-SCG המחובר לביפורקציה הקרוטיד. נקו עוד יותר את ה-SCG על ידי הסרת העורק ורקמות מחוברות אחרות בצלחת הפטרי (איור 1E).

3. כריתה של גרעינים סטלטיים של עכברים בוגרים (StG)

  1. כדי לנתח את ה- StG, בצע חתך בקו האמצע בבטן, ולאחר מכן פתח את הסרעפת ואת דופן בית החזה הגחוני.
  2. הסר את הלב והריאות כדי לחשוף את בית החזה הגבי. חפשו את ה-StG האנטרולטרלי השמאלי והימני ל-musculus colli longus (MCL) בגובה הצלע הראשונה (איור 1C, D, המסומן על-ידי קווים מקווקווים).
  3. נתחו את ה-StG השמאלי והימני עם המלקחיים והעבירו אותם בנפרד לצלחות פטרי בקוטר 3.5 ס"מ המכילות PBS קר (איור 1F).
    ​

4. בידוד ושימור בהקפאה של תאים גנגליוניים של עכברים

שלבים 4-6 מסוכמים באיור 2.

  1. העבר בזהירות את כל צינורות ה- SCG וה- StG הבודדים כדי להפריד בין צינורות מיקרוצנטריפוג ' של 1.5 מ"ל עם מלקחיים.
    הערה: אין להשתמש בקצות פיפטה כדי להעביר את הגרעינים מכיוון שהגרעינים נוטים להיצמד לקיר של קצות פיפטה מפלסטיק.
  2. הוסיפו 500 μL של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% לכל צינור microcentrifuge ודגירה באמבט מים רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    הערה: שלב זה נועד להקל על העיכול ושחרור התאים לאחר מכן בתמיסת קולגן מסוג 2.
  3. הכינו צינור 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום גנגליון עבור כל דגימה. אפשרו לגרעינים להתיישב בתחתית צינורות המיקרוצנטריפוגה. לאסוף את supernatant, המכיל מעט מאוד תאים גנגליוניים, להעביר את supernatant לצינורות מוכנים 15 מ"ל, ולתייג כל צינור. לחלופין, כדי לחסוך קצת זמן, לשאוף את supernatant טריפסין-EDTA ללא איסוף כמו מעט מאוד תאים מנותקים ניתן לזהות בו.
    הערה: ניתן להשאיר כמות קטנה של תמיסת טריפסין-EDTA (~10-30 μL) בצינור microcentrifuge כדי למנוע הסרה של הגרעינים. הימנעו מצנרת בשלב זה מכיוון שהיא עלולה לפגוע בגרעינים ולהוביל לתפוקה נמוכה של תאים גנגליוניים לאחר מכן.
  4. הוסיפו 500 μL של תמיסת קולגן מסוג 2 לכל צינור microcentrifuge ודגרו באמבט מים רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35-40 דקות. נסו להחיות את הגנגליון אחרי 35 דקות; אם הגנגליון עדיין שלם ואינו מתנתק, להאריך את זמן הדגירה או להגדיל את הריכוז של collagenase סוג 2 פתרון לפי הצורך.
    הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לגודל הגנגליון.
  5. יש להחיות את הגרעינים בתמיסת הקולגן על ידי צנרת למעלה ולמטה כ-10 פעמים או עד שלא זוהו עוד גושי רקמות.
  6. העבר את מתלי התא לצינור 15 מ"ל ששימש בעבר המכיל את מדיום תרבית הגרעינים ואת מתלה טריפסין-EDTA מאותו גנגליון. סובבו את מתלי התא עם צנטריפוגת רוטור דלי מתנדנדת למשך 10 דקות, 300 × גרם בטמפרטורת החדר. יש להשליך בזהירות את ה-supernatant של התא.
    הערה: מכיוון שהתאים הגנגליוניים מנותקים מגנגליון יחיד, גלולת התא עשויה להיות קטנה מכדי לזהות אותה בעין; כמות קטנה של supernatant ניתן להשאיר בצינור כדי למנוע הסרה בשוגג של גלולת התא.
  7. בצעו החייאה של התאים הגנגליוניים ב-270 מיקרול של סרום בקר עוברי (FBS, אנדוטוקסין נמוך) והעבירו כל תרחיף FBS של תאים לקריוביה של 1 מ"ל.
  8. כדי לספור את התאים, יש לערבב 5 μL של תרחיף התא הגנגליוני עם 5 μL של 0.4% צבע כחול טריפאן ולהעמיס את התערובת לתוך המוציטומטר. ספרו את המספרים הכוללים של התאים החיים תחת מיקרוסקופ.
    הערה: הכדאיות של התאים (ספירת תאים חיים/ספירת תאים כוללת = כדאיות %) היא בדרך כלל מעל 90% עם פרוטוקול דיסוציאציה זה. ספירת התאים החיים של גנגליון יחיד (SCG או StG) נופלת בדרך כלל בטווח של 9,000-60,000 תאים כאשר הגנגליון מבודד מעכבר בגילאי 12 עד 16 שבועות.
  9. הוסיפו 30 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לכל תרחיף FBS של תאים ב-cryovials, ערבבו היטב והעבירו את ה-cryovials למיכל הקפאת תאים, שנשמר בטמפרטורת החדר. אחסנו את המיכל הטעון ב-80 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, והעבירו את הקריוביציאלים לחנקן נוזלי למחרת לצורך שימור ממושך לפני הריצוף.

5. בידוד גרעין

הערה: SCG שמאלי וימני שבודד מארבעה עכברים (בסך הכל 8 דגימות) שימשו כדוגמה בבידוד הגרעין הבא ובהכנת ריצוף. שמור הכל על קרח במהלך כל ההליך. בגלל חוסר הנראות של כדורי גרעין קטנים, צנטריפוגה עם דליים מתנדנדים מומלצת מאוד כדי להקל על הסרת סופרנאטים לאורך כל ההליך.

  1. מכינים צינורות של 15 מ"ל עם מסננת (30 מיקרומטר) למעלה ומניחים מראש את המסננת עם 1 מ"ל של מדיום הגנגליון.
  2. מוציאים את הקריוביציאלים מחנקן נוזלי ומיד מפשירים אותם באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר כדור קרח קטן נשאר ב cryovial, להוציא את cryovials מתוך אמבט המים.
  3. לשחזר את התאים הגנגליוניים על ידי הטלת 1 מ"ל של מדיום הגנגליון לתוך כל קריוביאל תוך רעד בזהירות ביד. אופציונלי: כדי להעריך את התאוששות התא, ערבבו את תרחיף התא לאחר ההתאוששות והוציאו 5 μL של תרחיף התא לצורך ספירת תאים חיים, כמתואר בשלב 4.8.
  4. טענו כל תרחיף גנגליוני על מסננת נפרדת (שהוכנה בשלב 5.1) ושטפו כל מסננת ב-4-5 מ"ל של מדיום גנגליון.
  5. צנטריפוגה של תרחיף התא המתוח במשך 5 דקות ב-300 × גרם, הסר את הסופרנטנט בזהירות, והחזיר את התאים ב-50 μL של חיץ שטיפת תאים.
  6. העבר את תרחיף התא לצינור מיקרו-צנטריפוג DNA/RNA 0.5 מ"ל בעל קשירה נמוכה.
  7. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
  8. הסר 45 μL של supernatant מבלי לגעת בתחתית הצינור כדי למנוע פריקה של גלולת התא.
  9. הוסיפו 45 μL של Lysis Buffer מצונן ופיפט בעדינות למעלה ולמטה באמצעות קצה פיפטה של 200 μL.
  10. דגירה של התאים במשך 8 דקות על קרח.
  11. הוסיפו 50 μL של חיץ שטיפת גרעין קר לכל צינור. אין לערבב.
  12. צנטריפוגה מתלה הגרעין ב 600 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
  13. הסר 95 μL של supernatant מבלי לשבש את גלולת הגרעין.
  14. הוסיפו 45 μL של חיץ שטיפת גרעין צונן לכדור. אופציונלי: יש ליטול 5 μL של תרחיף גרעין, לערבב עם 5 μL של 0.4% טריפאן כחול כדי לספור, ולבדוק את איכות הגרעינים תחת מיקרוסקופ עם המוציטומטר.
  15. צנטריפוגה את מתלה הגרעין ב 600 × g במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F).
  16. הסר את חומר העל מבלי לגעת בתחתית הצינור כדי למנוע פריקה של גלולת הגרעין.

6. ברקוד גרעין עם אוליגוס האשטאג (HTOs) וריבוב

הערה: שלבי הכתם של HTO שונו והותאמו לתיוג גרעיני של כמויות נמוכות מאוד של גרעינים (גנגליוניים) על פי היישום הקודם ברקמת קליפת המוח על ידי Gaublomme et al.15.

  1. הוסיפו 50 μL של חיץ ST-SB לכדור הגרעין, פיפט בעדינות 8-10 פעמים עד שהגרעינים מוחזרים לחלוטין.
  2. הוסף 5 μL של ריאגנט חוסם Fc לכל 50 μL של תערובת ST-SB / גרעינים ודגירה במשך 10 דקות על קרח.
  3. הוסיפו 1 μL (0.5 מיקרוגרם) של נוגדן האשטאג חד-גרעין לכל צינור של תערובת ST-SB/גרעינים ודגירה למשך 30 דקות על קרח.
    הערה: זמן דגירה קצר יותר מוביל ליעילות נמוכה יותר של תיוג האשטאגים, כפי שהודגם בתוצאות המייצגות.
  4. הוסף 100 μL של ST-SB לכל צינור. אין לערבב.
  5. צנטריפוגה את מתלה הגרעין במשך 5 דקות, 600 × גרם ב 4 °C (64 °F).
  6. הסר 145 μL של הסופרנאטנט מבלי לשבש את גלולת הגרעין.
  7. חזור על שלבים 6.4 ו- 6.5. הסר את ה-supernatant ככל האפשר מבלי לגעת בתחתית הצינור כדי להימנע מפריקה של גלולת הגרעין.
  8. בצעו החייאה של גלולת הגרעין ב-50 μL של ST-SB, וערבבו בעדינות את הגרעינים.
  9. קחו 5 μL של תרחיף הגרעין וערבבו אותו עם 5 μL של 0.4% טריפאן כחול כדי לספור את הגרעינים תחת מיקרוסקופ. ראו איור 3A עבור תמונה מייצגת של גרעינים מעורבבים בכחול טריפאן ונטענים בהמוציטומטר.
  10. צנטריפוגה את מתלה הגרעין למשך 5 דקות ב 600 × גרם ב 4 °C (64 °F).
  11. בצעו החייאה של הגרעינים ב-ST-SB כדי להשיג ריכוז גרעין מטרה של 1,000-3,000 גרעינים/μL עבור כל דגימה על פי ספירת הגרעין המתאימה.
  12. אסוף את הדגימות כדי להשיג את מספר התאים הרצוי.
    הערה: לדוגמה, בניסוי זה, 8 דגימות רוכזו באופן שווה כדי להשיג בסך הכל 25,000 גרעינים כדי להתקדם מיד ל-10x גנומיקה כרום ו-snRNA-seq לאחר מכן. ספירת הגרעינים נמצאת בדרך כלל בטווח של 6,000-40,000 תאים כאשר הגנגליון מבודד מעכבר בגילאי 12 עד 16 שבועות. רק כמחצית מכלל הגרעינים הטעונים ניתנים ללכידה על ידי snRNA-seq מבוסס טיפות. לדוגמה, תערובת של 25,000 גרעינים הוכנה כדי להבטיח לכידה של 10,000 גרעינים, הדרושים להמשך הכנת הספרייה וריצוףה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח בקרת איכות של הכנת ספריית cDNA של גרעין יחיד ו- snRNA-seq
תוצאות מייצגות מתארות תוצאות ריצוף של 10,000 גרעינים שנלכדו בבריכה אחת עם ספריית ביטוי גנים של 25,000 קריאות/גרעין וספריית האשטאגים של 5,000 קריאות/גרעין. איור 3B ממחיש את תוצאות בקרת האיכות של cDNA שלגדיל 1, ספריית ביטוי גנים (GEX) וספריית HTO, שנבדקו באמצעות Bioanalyzer. ה-cDNAs שמקורם ב-HTO צפויים להיות קטנים מ-180 bp, בעוד ש-cDNAs שמקורם ב-mRNA גדולים מ-300 bp. ניתן לזהות ספריית GEX באיכות גבוה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מתואר פרוטוקול מפורט המתמקד ב- i) כריתה של חיידקים בוגרים בעלי צוואר הרחם וגרעיני סטלה סימפתטיים, ii) בידוד ושימור בהקפאה של התאים הגנגליוניים, iii) בידוד גרעין, ו- iv) ברקוד גרעין עם תיוג HTO למטרות ריבוב ו- snRNA-seq.

עם פרוטוקול זה, ניתן להשיג בקלות תאים גנגליוניים סימפתטיים על ידי ניתוק גרעינים בודדים באמצעות טריפסין וקולגןאז נפוצים. שימור ארוך טווח של תאים גנגליוניים מבודדים מושג בקלות גם על ידי הקפאת תאים ב- FBS בתוספת 10% DMSO, שהראה איכות גבוהה של התאוששות לאחר ההפשרה. יתר על כן, ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסוזן ל. קלוט (המחלקה לגנטיקה אנושית, LUMC, ליידן, הולנד) על עזרתה בתכנון ניסויים ובדיונים מועילים. אנו מודים לאמיל ג'יי דה מאייר (המחלקה לגנטיקה של האדם, LUMC, ליידן, הולנד) על העזרה בבידוד RNA של גרעין יחיד והכנת הספרייה לריצוף. עבודה זו נתמכת על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) [016.196.346 ל- M.R.M.J.].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים וריאגנטים
0.25% טריפסין-EDTAThermo FisherScientific 25200056
0.4% צבע כחול טריפאןBio-Rad1450021
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתGibco15240096
B-27GibcoA3582801
קולגנאז סוג 2וורת'ינגטוןLS004176 להשתמש ב-1,400 יח'/מ"ל
דימתיל סולפוקסידסיגמא אולדריץ'67685
אתנול מוחלט ≥ 99.5%VWRVWRC83813.360
סרום בקר עוברי (אנדוטוקסין נמוך)BiowestS1810-500
L-גלוטמיןתרמו פישר 25030024
Neurobasal בינוניGibco21103049
סרום בקר אלבומין 10%Sigma-AldrichA1595-50MLמאגר שטיפת
תאים DPBS (Ca2+, Mg2+free)Gibco14190-169מאגר שטיפת תאים
תמיסת מגנזיום כלוריד, 1 MSigma-AldrichM1028מאגר גרעין ליזה
תחליף Nonidet P40 (חומר ניקוי לא יוני)Sigma-Aldrich74385מאגר גרעין ליזה
מים ללא נוקלאז (לא מטופל ב-DEPC)InvitrogenAM9937מאגר
גרעין ליזהמעכב RNase, 40 U/µ Lסיגמא-אולדריץ'3335399001מאגר גרעין ליזה
תמיסת נתרן כלוריד, 5 מ'סיגמא-אולדריץ'59222Cמאגר גרעין ליזה
תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, 1 מ', pH 7.4סיגמא-אולדריץ'T2194מאגר גרעין ליזה
אלבומין סרום בקר 10%סיגמא-אולדריץ'A1595-50MLשטיפת גרעין
DPBS (Ca2+, Mg< sup>2+free)Gibco14190-169מגן שטיפת גרעין
מעכב RNase,40 U/µ LSigma-Aldrich3335399001Nucleus
Wash בקר סרום אלבומין 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST מאגר צביעה (ST-SB)
תמיסת סידן כלוריד, 1 MSigma-Aldrich21115-100MLמאגר צביעה ST (ST-SB)
תמיסת מגנזיום כלוריד, 1 MSigma-AldrichM1028ST מאגר צביעה (ST-SB)
מים ללא נוקלאז (לא DEPC מטופל)InvitrogenAM9937ST מאגר צביעה (ST-SB)
תמיסת נתרן כלוריד, 5MSigma-Aldrich59222CST מאגר צביעה (ST-SB)
תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, 1M, pH 7.4מאגר צביעה Sigma-AldrichT2194ST (ST-SB)
Tween-20Merck Millipore822184ST מאגר צביעה (ST-SB)
TotalSeq-A0451 חלבונים מורכבים נקבוביות אנטי גרעיניות האשטאג 1 נוגדןBiolegend682205נוגדן האשטאג
TotalSeq-A0452 חלבונים מורכבים נקבוביות גרעיניות האשטאג 2 נוגדןBiolegend682207נוגדן האשטאג
TotalSeq-A0453 חלבונים מורכבים נקבוביות אנטי גרעיניות האשטאג 3 נוגדןBiolegend682209האשטאג נוגדן
TotalSeq-A0461 חלבונים מורכבים נקבוביות גרעיניות האשטאג 11 נוגדןBiolegend682225נוגדן האשטאג
TotalSeq-A0462 חלבונים מורכבים נקבוביות אנטי גרעיניות האשטאג 12 נוגדןBiolegend682227נוגדן האשטאג
TotalSeq-A0463 חלבונים מורכבים נקבוביות גרעיניות האשטאג 13 נוגדןBiolegend682229האשטאג נוגדן
TotalSeq-A0464 אנטי-גרעיני נקבוביות קומפלקס חלבונים האשטאג 14 נוגדןBiolegend682231נוגדן האשטאג
TotalSeq-A0465 אנטי-גרעיני נקבוביות קומפלקס חלבונים האשטאג 15 נוגדןBiolegend682233האשטאג נוגדן
TruStain FcX (אנושי)Biolegend422302FC חסימת קולטן תמיסה
<חזק>ציוד וחומרים מתכלים
קו בהיר  המציטומטרMerckZ359629-1EA
צנטריפוגה 5702/R A-4-38Eppendorf 
CoolCell LX מיכל הקפאת תאיםקורנינגCLS432003-1EA
CryovialThermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 מ"ל צינור אפנדורףEppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"לEppendorf30121872
Falcon 35 מ"מ לא מטופל TC צלחת פטריקורנינג
351008 פלקון 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםפישר 10773501
מלקחיים דומונט #5כלים מדעיים עדינים11252-40
מספריים עדיניםמוקשים כלי מדע עדינים14091-09
  מחבת קרח, מלבני 4 ליטר כתוםקורנינגCLS432106-1EA
Leica MS5Leicaמיקרוסקופ
מוריה MC50 מספרייםמדעיים עדינים15370-50
Noyes מספריים אביבכלים מדעיים עדינים15012-12
אולימפוס CK2 ULWCDמיקרוסקופאולימפוס
P10גילסוןF144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
מסנני הפרדה מראש (30 ומיקרו; m)Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
אמבט מים רועדיםGFL1083
צלחת סיליקוןRubberBV3530לוח חיתוך
<חזק>תוכנה וחבילות
Cell rangerV4.0.0
R תכנותV4.1.1
R sudioV1.3.1073
SeuratV4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6. Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J עכברמעבדת ג'קסוןJAX מלאי #022501
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J עכברג'קסוןJAX מלאי #007576
עכברי C57BL/6Jצ'ארלס ריבר
קוד לניתוח הנתונים
EP022629905מדעי כלים מעבדת https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
  2. Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368(2015).
  3. Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010(2012).
  4. Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
  5. Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
  6. Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
  7. Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  8. Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
  9. Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
  10. Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
  11. Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832(2019).
  12. Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374(2020).
  13. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
  14. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).
  15. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).
  16. Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298(2021).
  17. Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O'Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Developmental Biology. 379 (2), 229-234 (2013).
  18. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  19. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
  20. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  21. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224(2018).
  22. Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022(2016).
  23. Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
  24. Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiac Autonomic Nervous SystemHashtag OligosMultiplexed SequencingGanglia DissectionNeuronal Cell ClustersSample Preservation

מאמרים קשורים